微藻、藍藻及其代謝物的生產方法

2023-05-27 08:10:56 2

微藻、藍藻及其代謝物的生產方法
【專利摘要】本發明涉及用於生產微藻、藍藻和/或其代謝物的方法，本文描述了一種方法，涉及使用施加到微藻或藍藻培養物的刺激來提高一種或多種代謝產物的生產。本文還描述了用於生產微藻和/或藍藻的方法，其包括適應階段，其中使藻/藍藻培養物在工藝用水原料中和/或在發射光波長在400nm-700nm之間的發光二極體(LED)下生長；以及生產階段，其中使微藻或藍藻在與適應階段所用相同的工藝用水原料中和/或在與適應階段所用相同的光照條件下生長。本發明還涉及具體微藻藻株。
【專利說明】微藻、藍藻及其代謝物的生產方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及用於生產微藻、藍藻和/或其代謝物的方法。尤其是，本發明涉及一種方法但並非僅限於此，其中將微藻或藍藻培養物暴露在刺激下，以增強一種或多種代謝產物的生產。本文還描述了用於生產微藻和/或藍藻的方法，包括適應階段，其中使藻類/藍藻培養物在工藝用水原料中和/或在發射光波長在400nm-700nm之間的發光二極體(LED)下生長；以及生產階段，其中使微藻或藍藻在與適應階段所用相同的工藝用水原料和/或相同的光照條件下生長。
[0002]本發明集成了優選在光生物反應器系統內、露天池塘中培養形成脂質的微藻或藍藻的方法或其他培養方法。本發明提供了用於生產藻類生物質並轉化成高價值副產品如EPA或生物燃料的集成和連續的方法。還描述了本發明所用的具體藻株，其在本文中稱為ALG02。
[0003]本發明描述了提高獨特的微藻藻株(攝食膠網藻(Dictyosphaeriumchlorelloides)ALG03)的胞外多糖(EPS)生產的方法，所述微藻藻株在培養過程中被預調/適應，用於隨後使用限定的LED照明光譜和作為在光生物反應器(PBRs)中生長的營養物質和能量的工業廢物CO2和水進行大規模生產。此外，本文提供了用於在碳水化合物提取前/後生產藻類生物質的集成和連續的方法，所述藻類生物質可用於其他下遊用途，例如，提高養分利用率和地下滴灌灌溉的植物根區的土壤粘附；作為厭氧消化單位或生物乙醇工廠或生產沼氣的生物質。還描述了本發明所用的具體藻株，其在本文中稱為ALG03。
【背景技術】
[0004]藻類是地球上增長最快的生物體之一。它們可以在幾個小時內再生(旺盛)。無論在淡水、廢水或海水中，只要有CO2和光它們就能成長。此外，在工藝用水中養分(主要是氮和磷酸鹽)的水平升高以及其他化合物的增加，能促進藻類(a)生物質增加。
[0005]在全球範圍內正在進行的研究中，藻類正在成為未來燃料和廢水處理解決方案的目標，這是因為在藻類燃料的生產方法中，藻類可以封存工業源的CO2以及幫助封存在經部分處理後的工藝用水(b，c)內的養分(和一些重金屬)。
[0006]藻類和藍藻的同樣也是有價值的代謝產物來源，例如脂肪酸，包括肉豆蘧酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、山嵛酸、月桂酸、亞油酸、α-亞麻酸和Y-亞麻酸、硬脂酸、花生四烯酸和二十碳五烯酸。此外，微藻和藍藻的胞外聚合物質(天然多糖)所具備的獨特生化特性使它們從生物技術的角度來看顯得頗具吸引力。藍藻產生複雜的胞外多糖，它們在食品和非食品行業的應用包括食品塗抹劑、乳化劑和膠凝劑、絮凝劑、增粘劑和保溼劑。在醫療保健(d)中，它們還有作為軟組織粘合劑的新化合物的潛在用途。在生物修復領域，胞外多糖(EPSs)可以去除被汙染土壤和水域中的有毒重金屬(e，f)，以及廢水中回收的養分和其他元素。
[0007]由以上描述可得知，藻類和藍藻在許多不同【技術領域】中都是寶貴的資源，因此，本發明尋求開發這類微生物生長和生產的新方法。
[0008]發明概述[0009]根據本發明的第一個方面，提供了用於提高微藻和/或藍藻的一種或多種代謝物生產的方法，所述方法包括以下步驟:
[0010](i)在生產階段培養微藻或藍藻藻株；
[0011](ii)將微藻或藍藻培養物曝露在刺激下培養，其中所述刺激包括:(a)將pH降低
至不超過約PH6，隨後將pH增加至不低於約pH7，及(b)將光輻照度增加到至少400 μ mol/
[0012]根據本發明的第二個方面，提供了用於生產或生長微藻和/或藍藻或生產由其衍生的一種或多種代謝物的方法，所述方法包括:
[0013](i)適應階段，包括將微藻或藍藻培養於:
[0014](a)工藝用水原料中，並選擇能夠在工藝用水原料中生長的微藻或藍藻，和/或
[0015](b)發光二極體(LED)下，所述發光二極體(LED)所發射的紅光和藍光的2個峰位於光波長為約400-700nm的光譜內；
[0016](ii)生產階段，包括在與適應階段所用相同的工藝用水原料中和/或在與適應階段所用相同的光照條件下培養(i)中所選擇的微藻或藍藻。
[0017]本發明還提供了一種微生物，其是保藏在藻類和原生動物培養中心、保藏號為CCAP817/1的阿洛格綠蛇藻(Chlorogibba allorgei)藻株或是由其衍生的突變藻株,或具有所述藻株的識別特徵。保藏號為CCAP817/1的阿洛格綠蛇藻藻株在本文中也稱為ALG02藻株。
[0018]本發明還提供了一種微生物，其是保藏在藻類和原生動物培養中心、保藏號為CCAP222/98的攝食膠網藻藻株，或是由其衍生的突變藻株，或具有所述藻株的識別特徵。保藏登記號為CCAP222/98的攝食膠網藻藻株在本文中也稱為ALG03藻株。
[0019]本文提供的方法可以用於提高含有以下物質的微藻的生產:具有商業價值的生物蛋白、脂質及代謝產物，包括二十碳五烯酸(EPA)、肉豆蘧酸、棕櫚酸、山嵛酸、月桂酸、亞油酸、α -亞麻酸以及硬脂酸。所述方法採用優化的光波長，來優選在光生物反應器中培養和生產富含脂質的微藻藻株，如綠藻門中並選自肋胞藻科(Pleurochloridaceae)的微藻。工業副產品，如廢工藝用水和CO2，用作養分和碳的再生源，來調整藻類/使藻類適應，以利用這些輸入提高生長。
[0020]本發明還提供了獨特的兩階段方法，其用於優化藻類、特別是攝食膠網藻的具有商業價值的胞外多糖的生產，並且所述方法可以應用於特定微藻藻株。所述方法在光生物反應器系統(PBR)中進行。所述方法利用工業過程中的二氧化碳(CO2)/水來在規模擴大的PBR系統中在類似的條件下培養藻類並增加生長率。所述方法使用藻類預適應培養來調整生物體，使之適應工藝用水/CO2和LED照明的規模擴大的應用。這反過來又使藻類所生產的具有商業價值的藻胞外多糖水平升高。裝載碳水化合物的藻類生物質可作為富含營分的高碳肥料用於灌溉農作物，或者用於下遊能源生產(生物乙醇生產或其他能源生物質系統，如厭氧消化池或發酵容器)。
[0021]本發明提供了由攝食膠網藻ALG03的適應藻株生產高產量胞外多糖的新方法，所述藻株已經演變為在二級處理汙水源中、在調整的LED光下高速生長。在生長的遲滯期觀察到，這種處理使胞外多糖的產率從38%翻倍至77%。所產生的高百分比多糖可移動到下遊過程，來提取用於各種用途的聚合物。提取碳水化合物後的剩餘廢生物質可以用於動物飼料(如果在生物反應器中使用純水)或用於能量生產，例如，在厭氧消化池、發酵工藝或熱解系統。
[0022]因此，本發明還涉及屬於膠網藻科(Dictyosphaeriaceae),特別是膠網藻屬(Dictyosphaerium),更具體是屬於攝食膠網藻的一種具體(分離)藻類藻株。該藻株保藏於藻類和原生動物培養中心，保藏號CCAP222/98，並於2011年I月25日被接受。本文所示的所述藻株對於特定代謝物的生產是有用的。
[0023]本發明還提供了使用地下滴灌系統(SDIs)將所產生的藻類生物質作為具體土壤調理劑的新方法。修復水內生長的生物質進入灌溉存儲器(irrigation holding tank),準備與正常灌溉水和其他兼容化學品混合。早已吸收了廢氣或工藝水的磷酸鹽和硝酸鹽以及其他營養物質的送遞劑量的藻類細胞，有助於向植物的根區送遞「天然緩釋」肥料。這也增加了土壤中的碳，並有助於在植物正發展的根部周圍聚集土壤顆粒，防止水土流失，這在乾旱區是至關重要的。
[0024]這些和其他目的，根據下面的詳細描述會變得顯而易見，並已經通過本發明人的發現而實現，即通過調控藻類藻株的預培養和在PBRs內生長期間進行管理，預調/適應的藻類藻株的胞外多糖的形成能夠使富含碳水化合物的生物聚合物的產量翻倍。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1LED光照適應-FAME譜
[0026]與螢光光照預先暴露在PAR LED光照(400_700nm的)下6個月並經6個周期的傳代培養的柵藻屬(Scenedesmus)種類(ALG05)相比，在調整的LED光下HPLC FAME譜增強。
[0027]從藻類藻株獲得的HPLC (FAME)譜，所述藻類藻株以24小時為周期僅利用LED PAR光照培養了 6個月出代傳代培養)。注意分子量較高的脂肪酸(右圖中箭頭所指)，相比用相同輻照度的螢光光照下( 左圖)生長的藻株的外觀；
[0028]圖2預培養時，在已處理的工藝水中的生長增強
[0029]通過暴露於已處理的工藝水和調整的PAR LED光(27°C和24小時光照)進行6個月(6 個周期)預培養，Trachydiscus sp.(ALGOl)、小球藻(Chlorella sp.) (ALG04)以及柵列藻(Scenedesmus sp.) (ALG05)的生長增長；
[0030]使已適應的細胞在來自加工廠(二次處理)的水中生長6個月，以及每4周再培養於新工藝用水中；將非適應的細胞培養於標準的100% ZBB生長培養基中，每4周在新ZBB生長培養基中重新培養；然後，使這兩種藻株在新的工藝用水中生長9天(直至穩定期)。結果表明預適應的細胞明顯適應工藝用水環境和LED光照。
[0031]圖3不同藻株的脂質含量
[0032]比較藻株在指數生長期生產的碳水化合物/脂質/蛋白和生物質的熱值。在指數增長階段收穫培養物。
[0033]圖4綠蛇藻(Chlorogibba sp.) (ALG02)藻株內二十碳五烯酸(EPA)的生產
[0034]通過毛細管色譜分析並在次優生長條件下(不添加二氧化碳或PAR輻照)生產的生物質樣品中主要脂肪酸的百分含量。和使用PAR燈源和添加二氧化碳生長的這種藻株和Trachydiscus sp.ALGOl的其他分析顯示,EPA的百分比在總脂肪酸含量的30-38%範圍內。在控制的PAR光照下，檢測到分析物中顯著水平的棕櫚酸和肉豆蘧脂肪酸。
[0035]圖5A及B的圖表分別顯示了關於本發明開展的實驗工作結果並說明養分濃度和光水平與攝食膠網藻藻株ALG03生長之間的關係。
[0036]5A低養分水平要求
[0037]藻類在Bold’s Basal (BB)培養基生長4天顯示藻類在27°C和最佳光輻照度下的最佳生長需要相對降低的養分水平。
[0038]5B用於生長的LED光輻照度水平
[0039]圖表顯示藻類在低光照下、在27°C的25%BB培養基中超過7天生長最好。
[0040]圖6是根據本發明生產用於灌溉的藻類生物聚合物的系統的示意圖；
[0041]圖7是一個示出了連續收穫攝食膠網藻ALG03的曲線圖；生物質由在PBR中表示為光密度 SOnm處)讀數顯示，每天以50%的速率收穫，使得當補足了新的生長培養基後，能在24小時內再生攝食膠網藻ALG03的相同生物質。
[0042]圖8顯示了藻株對廢水和LED光照的適應，從而與非適應的藻株相比，使得生長速率增加；
[0043]暴露於廢水和調整的PAR LED光(27°C和24小時光照)下，經6個月(6個周期)和生理適應提高了攝食膠網藻的生長；
[0044]圖9示出了第二階段培養結束後EPS翻倍(右圖)；
[0045]圖10示出3個生物體中碳水化合物/脂質/蛋白質細胞含量和熱值的比較；
[0046]攝食膠網藻ALG03藻株在對數生長期內產生的碳水化合物/脂質/蛋白質產物和生物質熱值的比較。在指數增長階段收穫培養物；
[0047]圖11顯示了在溫室試驗中使用滴灌使韭菜在貧瘠的沙質土壤中生長超過12個周的結果。
[0048]發明詳述
[0049]在本發明的第一個方面，提供了用於提高微藻和/或藍藻的一種或多種代謝物生產的方法，所述方法包括以下步驟:
[0050](i)在生產階段培養微藻或藍藻藻株；
[0051](ii)將微藻或藍藻培養物曝露在刺激下培養，其中所述刺激包括:(a)將pH降低
至不超過約PH6，隨後將pH增加至不低於約pH7，及(b)將光輻照度增加到至少400 μ mol/
2 /
m/seco
[0052]在本發明的上下文中，術語「培養」是用來表不使一種或多種微藻或藍藻藻株在任何合適的培養基中生長。這種培養基可包括本領域技術人員熟知的標準生長培養基，例如BB培養基或同等物。在一個優選的實施方案中，使微藻或藍藻藻株在工藝用水中生長，其中的術語「工藝用水」包括來自工業系統和家庭廢水的工藝用水。所述工藝用水可以在使用前處理(例如，消毒或不消毒)和補充養分，使得營養物的水平在標準生長培養基的範圍內。
[0053]在某些實施方案中，所述的培養可以是分批培養、補料分批培養或至少部分連續培養(在穩定期之前)。
[0054]生產階段
[0055]在生產階段中微藻或藍藻藻株通常會以指數速率增長，因此，在某些實施方案中，生產階段對應於培養物的指數生長期。
[0056]「指數期」，也被稱為「log期」或「對數期」，為微生物包括微藻和藍藻細胞分批培養過程中的確定時期，其特徵為細胞倍增。每單位時間出現的新生物體的數量與現有群體成比例。如果生長不受限制，將繼續以恆定的速率倍增，因此細胞的數量和和群體增加的比率在每一個連續的時間段翻倍。實際生長速率可能會有所不同，這取決於所使用的微生物株和/或生長條件。
[0057]在生產階段中，使用的環境或培養條件可具體選擇，以使得正在使用的微藻或藍藻藻株呈指數生長。[0058]在某些實施方案中，在穩定期開始之前，在呈指數增長開始停止時即指數生產期最後微藻或藍藻藻株的細胞密度，應不小於IO8個細胞/ml培養基，優選為IO7-1O8個細胞/ml。用於實現培養物的最佳生長或培養物指數增長的培養條件可以選自下列各項:
[0059]-波長為約400nm至700nm之間的持續人造光，和/或
[0060]-50 μ mol/m2/sec 至 200 μ mol/m2/sec 之間的持續人造光；和 / 或
[0061]-約20°C至40°C之間的溫度；和/或
[0062]-約500mV至800mV之間的含氧量，和/或
[0063]-約pH6_pH9 之間的 pH 值。
[0064]本領域技術人員應當理解，培養條件可以依據生長的微藻或藍藻而改變。本文討論了用於本發明具體藻株的具體條件，並且所述條件也可以作為應用於其他藻株的指導，這是本領域技術人員所能夠理解的。
[0065]在本發明的優選實施方案中，在生產階段微藻或藍藻藻株的培養或生長在光生物反應器(PBR)中進行。如本文所採用的，光生物反應器指的是併入一個或多個光源向反應器中提供光子能量的生物反應器。在優選的實施方案中，使微藻或藍藻生長在對(外部)環境關閉的系統中。優選的光源包括發光二極體(LED)，特別是發PAR光的LED (400-700nm範圍的光合有效輻射)。在某些實施方案中，可以配置PBR，以便包括旨在自生物反應器中心提供360度照明的(高度調整的)LED光源，從而使光源周圍不同藻類或藍藻藻株的生長最大化。在優選的實施方案中，光是由LED發射的，所述LED發射的紅、藍光的2個峰位於400-700nm光譜範圍內。在優選的實施方案中，光是由LED發射的，所述LED發射的紅光峰在約500-665nm範圍內，優選為約660nm，且所發射的藍光峰在約440_500nm範圍內，優選為約 460nm。
[0066]其中，生產階段是在PBR內進行，在生產階段開始時，微藻或藍藻藻株的密度應不小於10% (v/v)的PBR體積。在相同或替代的實施方案中，不將微藻或藍藻培養物暴露在自然光下。
[0067]刺激
[0068]在本發明方法的第二個步驟中，將微藻或藍藻培養物暴露在刺激下，其中所述刺激包括、基本上由下述組成或由下述組成:(a)將pH降低至不超過約pH6，隨後將pH增加至不低於約pH7,及(b)將光福照度增加到至少400 μ mol/m2/sec。
[0069]在生產階段，培養物的pH通常在pH7_pH9的範圍內，因此所述刺激可以包括pH從約pH7-pH9降低至約pH3-pH6，優選為約pH5_pH6。通過本領域技術人員所知的任何適宜的方式，可將培養物中的pH值降低並隨後使其增加，只要不損害培養物的生存力即可。在一個優選的實施方案中，通過二氧化碳的加入降低pH。
[0070]在生產階段，送遞到培養物的光輻照度通常在50-200 μ mol/m2/sec的區域內，因此所述刺激可以包括將光輻照從約50-200 μ mol/m2/sec增加至約400-2000 μ mol/m2/sec。光源優選包括一個或多個LED、基本上由或由一個或多個LED組成。
[0071]一旦微藻或藍藻培養物已到達指數期生長峰值，通常將所述培養物暴露在刺激下。此峰值在穩定期開始之前立即出現。穩定期是微生物包括微藻和藍藻分批培養過程中一個定義非常明確的時期，其中培養物的生長速率放緩，這通常是由於有毒物質積累和養分耗竭。在這個階段，微生物的生長速率通常等於微生物的死亡速率。本領域技術人員應當理解，任何微藻或藍藻培養物都經歷從指數生長峰值到穩定期的過渡。培養物可以在指數期生長峰值的任何時間或從指數期過渡到穩定期的任何時間內暴露在刺激下。
[0072]可以在整個生產階段監測微藻或藍藻的生長速率，例如使用採樣技術，如細胞計數，或通過測量培養物的葉綠素a的水平。細胞數可使用分光光度測定培養物的取樣來確定，例如，通過在約0D680nm處讀數。這些措施可以用來確定指數生長期、指數期生長的峰值和培養物開始進入穩定生長期的時間，任何合適的技術都可以採用。
[0073]所述刺激最低限度包括pH降低至不超過約pH6，隨後pH增加至不低於約pH7，以及光輻照度增加至至少400ymol/m2/sec。所述的刺激還可以包括添加碳源，其中碳源為各種形態的CO2。
[0074]在優選的實施方案中，pH值的降低和隨後的增加發生在光輻照度增加之前。可以在約30分鐘至約2小時的期間內，將pH降低至不超過約pH6，優選在約pH5-pH6之間。隨後可以將PH增至約pH6-pH9之間，優選在約pH7-pH9之間。可以利用任何合適的方式升高PH，只要不損害培養物的生存力即可。通常，將pH恢復到刺激前水平。
[0075]在某些實施方案中，在暴露於刺激下開始後，再將微藻或藍藻培養物培養至少約12、24、36、48等小時的生長期。在實施方案中，其中在約30分鐘至2小時之間的一段時間內降低PH，並隨後升高至例 如刺激前的水平，暴露於刺激後的培養期，可以由初始pH值下降的時間或由恢復PH及隨後增加輻照度的時間計算。
[0076]代謝物的生產
[0077]將微藻或藍藻藻株暴露在刺激下的一個作用是，誘發或促進微藻或藍藻特定代謝產物的生產。本發明人已經注意到，將某些微藻和/或藍藻藻株暴露在如本文所定義的刺激下，會導致產生大量特定代謝物，這種特定代謝物依賴於所使用的微生物株。因此，實施上述所要求保護的方法的目的是，提高微藻和/或藍藻細胞的一種或多種代謝產物的生產。通常在培養物已經暴露於刺激後的另一生長期後收穫這類代謝物。代謝物可使用本領域技術人員知曉的任何合適的方式收穫、純化和/或分析，例如，Bligh，EG和Dyer，ff.J.1959.A rapid method for total lipid extraction and purification (一種用於快速提取總脂和純化的方法).Can.J.Biochem.Physiol.37:911-917所記載的方式。
[0078]脂類也可以根據工業標準程序收穫/分析，如超臨界CO2、溶劑提取的變型、分餾和層析，或根據以下方案:
[0079]如果用於在培養管中進行GC-MS測量，則將25mg藻類產物樣品與內部標準品混合，添加1.5ml0.5N氫氧化鈉的甲醇溶液，給培養管蓋上蓋子，並在100°C下加熱約5分鐘。使其冷卻並添加2ml BF3/甲醇試劑，蓋管，混合併在100°C加熱30分鐘。使其冷卻並加入2ml異己烷+BHT，然後5ml飽和氯化鈉，蓋管，並劇烈震蕩30秒。冷卻至室溫並使其分層，將上面的異己烷層通過無水硫酸鈉短柱並收集。將含水層用2ml異己烷+( 二丁基羥基甲苯)BHT萃取，使上面的異己烷層通過無水硫酸鈉柱，並收集溶劑與其他樣品。將所述柱用2ml異己烷+BHT洗滌，並且也放置在相同的樣品管中。
[0080]多糖可通過本【技術領域】技術人員可用的層析技術進行分析。微藻生物質提取物中的碳水化合物和糖醇的分析，可通過高PH陰離子交換層析法(HPAE)，接著通過並行的電化學檢測(IPAD)和質譜檢測分析來進行。在一個優選的實施方案中，樣品提取物採用耦合到MSQ Plus質譜儀的模塊化ICS-5000系統進行分析。分析物在CarboPac MAl柱上使用等度條件分離。經柱分析後，流出物被分割，從而一半流過實現了集成和脈衝安培檢測(IPAD)的電流分析室(amperometry cell)，而另一半則是使用膜基脫鹽裝置(ASRS)連續脫鹽。隨後將中和的流出物與氯化鋰水溶液混合，以促進碳水化合物作為鋰加合物在MS中的檢測。
[0081]廢生物質反過來可用於各種各樣的應用，包括但不限於:反芻動物飼料、牛飼料、水產養殖、家禽飼料、生物質的生物乙醇製品碳水化合物級分以及從蛋白質中提取有價值的胺基酸。
[0082]本文所述的方法可用於以提高任何發現於微藻和/或藍藻藻株內的代謝物的生產。在本發明的某些實施方案中，所述方法用於增強脂質的生產，包括但不限於選自下組的脂肪酸:肉豆蘧酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、山嵛酸、月桂酸、亞油酸、α-和Y亞麻酸、硬脂酸、花生四烯酸和二十碳五烯酸。在優選的實施方案中，本發明的方法用於提高二十碳五烯酸(EPA)的生產。本文所述的方法尤其可用於獲得培養的微藻或藍藻藻株的期望的脂肪酸組成(profile)，例如，以優化產EPA藻株的EPA生產。通過本文所述的方法生產的脂肪酸可以例如用於食品行業中，用於液體生物燃料生產中，用於化妝品組分。
[0083]在本發明的某些實施方案中，所述方法用於提高碳水化合物的生產。在優選的實施方案中，本發明所述的方法用於提高胞外多糖(EPS)的生產。
[0084]微藻/藍藻
[0085]與本發明方法配合使用的微藻類或藍藻可以選自任何合適的藻類或藍藻藻株。合適的微藻藻株可選自下組:綠微藻、淡水微藻、綠藻門、肋胞藻科、Trachydiscus sp.、綠蛇藻以及攝食膠網藻。合適的藍藻藻株可以選自下組:色球藻目(ChiOococcales)、集胞藻屬(Synechocystis)或聚球藻屬(Synechoccocus)。
[0086]在所述方法用於增強二十碳五烯酸的生產的實施方案中，優選微藻藻株選自Trachydiscus sp.和綠蛇藻,並且特別是,保藏在藻類和原生動物培養保藏中心、保藏號為CCAP817/1 (本文中也稱為ALG02)的阿洛格綠蛇藻藻株，或是由其衍生的突變藻株。
[0087]在所述方法用於增強胞外多糖生產的實施方案中，優選微藻藻株選自攝食膠網藻，並且尤其是保藏在藻類和原生動物培養保藏中心、保藏號為CCAP222/98(本文中也稱為ALG03)的攝食膠網藻藻株，或是由其衍生的突變藻株。
[0088]如本文所用術語「突變藻株」是指來自於最初的微藻和/或藍藻的藻株，其保留了原藻株的特徵，考慮到當根據上述本發明的方法，所述最初的微藻和/或藍藻藻株的特徵與根據本發明將其暴露於刺激下時所產生的代謝物組成有關。
[0089]與本發明所述的方法配合使用的微藻和/或藍藻可能已經經過預選擇，如基於在與生產階段所用相同的培養條件下的最佳生長。這個預選擇或者適應階段可在上文詳述的方法步驟之前，依據下文描述的本發明的第二個方面，對其進行了更詳細的描述。下文中描述的所有實施方案適用於本發明。
[0090]因此，根據本發明的第二個方面，提供了用於生產或生長微藻和/或藍藻或生產由其衍生的至少一種代謝物的方法，所述方法包括:
[0091](i)適應階段，包括將微藻或藍藻培養於:
[0092](a)工藝用水原料中，並選擇能夠在工藝用水原料中生長的微藻或藍藻，和/或
[0093](b)發光二極體(LED)下，所述發光二極體(LED)所發射的紅光和藍光的2個峰位於光波長為約400-700nm的光譜內；
[0094](ii)生產階段，包括在與適應階段所用相同的工藝用水原料中和/或在與適應階段所用相同的光照條件下培養(i)的所選擇的微藻或藍藻。
[0095]適應
[0096]工藝用水原料可來源於工業處理系統或家庭廢水系統。重要的藻類生長養分，如硝酸鹽和磷酸鹽，通常是存在於所述原料中。其他藻類刺激物也可能存在，如微量元素及維生素。食品、軟性飲料和啤酒行業有很多這樣的合適的工藝用水流。當添加的養分等同於標準生長培養基所用的水平時，也可用其他營養較不豐富的淡水資源。
[0097]通常在 適應階段將微藻或藍藻培養於工藝用水原料水中在最佳培養條件下，所述最佳條件包括但不限於:
[0098]-波長在約400nm至700nm之間的持續人造光，和/或
[0099]-在50μ mol/m2/sec至200 μ mol/m2/sec之間的持續人造光；和/或
[0100]-在約20°C至29V之間的溫度；和/或
[0101]-在約pH7至pH9的之間的pH。
[0102]可對工藝用水進行預處理，例如，為了減少顆粒。在適應階段微藻或藍藻的生長可以使用三角燒瓶(100-500ml)或製備型光生物反應器進行。光可由LED光源或其他非自然光發射。在一個優選的實施方案中，光由LED發射，所述LED發射的紅光和藍光的2個峰位於光波長為約400-700nm的PAR光譜內。在又一個優選的實施例中，通過發光二極體發射的紅光的峰值在約500_665nm之間,優選為約660nm,所發射的藍光的峰值在約440_500nm之間，優選為約460nm。
[0103]在某些實施方案中，適應階段的目的是，確定能在生產階段過程的工藝用水原料中生長的微藻或藍藻藻株。
[0104]可選地，或另外地，光可以用來使微藻或藍藻適應或「適合」生產階段使用的條件，優選以優化在生產階段的生長。在一個優選的實施方案中，適應階段包括藻類和/或藍藻在LED下生長，所述LED發射的紅光和藍光的2個峰位於400_700nm的PAR光譜內。在進一步優選的實施方案中，光由LED發射，所述LED發射的紅光的峰值在約500-665nm範圍內，優選為約660nm，且所發射的藍光的峰值在約440_500nm範圍內，優選為約460nm。
[0105]適應階段可包括將微藻或藍藻藻株培養至少約2、3、4、5、6個月，優選至少約3個月。適應階段包括將微藻或藍藻藻株培養至少2、3、4、5、6、7、8代的生長，優選至少約6代生長。在使微藻或藍藻生長數月或至少2代生長的實施方案中，微藻或藍藻可傳代培養，其中傳代培養是指將培養物中的部分或全部轉移到新生長培養基。在優選的實施方案中，使微藻或藍藻每月或每4周進行一次傳代培養。[0106]一旦微藻或藍藻藻株已根據上述適應階段被選擇出來，方法的第二步就是生產階段，該生長階段包括使用與適應階段所用相同的工藝用水原料和/或在與適應階段所用相同的光條件下培養所選的微藻或藍藻。
[0107]術語「相同的」工藝用水原料是指來自於同一批次即具有相同特徵、用於適應階段的工藝用水，而不是適應階段用於細胞生長的完全相同的培養基。
[0108]本發明第二個方面的生產階段可根據上文針對所述方法的第一方面所述的生產階段的任何實施方案來進行。例如，適應的微藻或藍藻藻株的生長，可以在允許指數生長的條件下進行。此外，生產階段的生長優選在上述定義的光生物反應器中進行。在生產階段使用的條件可反映適應階段所用的條件。因此，除了利用工藝用水作為原料，所述適應可外延到其他環境條件，如上文所述(光波長、輻照度水平、溫度、pH值等)。更具體地，適應可使用如本文所述的LED光照。在一個優選的實施方案中，適應是在400-700nm PAR光譜內的紅光和藍光的2個峰送遞的LED光照。在進一步優選的實施方案中，光是LED發射的，所述LED發射的紅光峰值在約500-665nm範圍內，優選為約660nm，以及所發射的藍光峰值在約440-500nm範圍內，優選為約460nm。
[0109]在某些實施例中，生產階段之後的步驟可包括將微藻或藍藻培養物暴露在刺激下，以提高代謝物生產。在本發明上下文中第一個方面所述的刺激的所有實施方案可比照適用於本發明第二個方面的方法中。此外，用於本發明第二個方面方法中的微藻和/或藍藻藻株可選自上文已經描述的任意微藻和/或藍藻門、目、科和/或種。
[0110]本發明的第二個方面的方法可用於提高微藻和/或藍藻生物質的生產。這樣的生物質可用於如下文所述的應用如生產生物燃料、，生物柴油、汽油、煤油，或用作土壤調理劑或生物肥料，包括用於地下灌溉系統。可選地，或另外地，所述方法可用來生產代謝物，包括但不限於提高脂質和/或碳水化合物的生產。在優選的實施方案中，所述方法用於提高二十碳五烯酸生產。在進一步優選的實施方案中，所述方法用於提高胞外多糖的生產。
[0111]在本發明的再一個方面，提供了一種微生物，其是保藏在藻類和原生動物培養中心、保藏號為CCAP817/1的阿洛格綠蛇藻藻株，或是由其衍生的突變藻株，或具有所述藻株的識別特徵。
[0112]在本發明的又一個方面，提供了一種微生物，其是保藏在藻類和原生動物培養中心、保藏號為CCAP222/98的攝食膠網藻藻株，或是由其衍生的突變藻株或具有所述藻株的識別特徵。
[0113]本發明描述了由屬於肋胞藻科(例如Trachydiscus sp.和綠蛇藻)的藻類生產脂質和代謝物二十碳五烯酸、肉豆蘧酸、棕櫚酸、山嵛酸、月桂酸、亞油酸、α -亞麻酸、硬脂酸等類似物的方法。因此，本發明提供了用於製備和選擇可用於生產藻類生物質產物所用的生物反應器和/或其他培養條件的所述藻類培養物的適應細胞的方法，所述藻類生物質產物含有本文所述的脂質和代謝物。更具體地說，本發明提供了用於生產和/或提高某些含脂肪酸脂質產量的方法。該方法可以包括通過提高光合效率、調整養分和代謝活性，製備屬於肋胞藻科且含有上述脂質和脂肪酸的藻類，用於生產下遊產品生物柴油、汽油、煤油和其他高價值化學品方法。另外，本發明提供了從形成二十碳五烯酸的藻類藻株中獲得所需脂肪酸譜的方法。所述方法允許通過調節生長培養基中的某些養分水平(包括氮肥和硫)以及改變光輻照度水平來優化二十碳五烯酸的生產，用於食品行業或飽和脂肪酸或脂肪酸-肉豆蘧酸、棕櫚酸、山嵛酸、月桂酸、亞油酸、α-亞麻酸、硬脂酸等，用於液體生物燃料(S)生產或化妝品成分。本發明還提供了通過增加光合效率和代謝活性製備來自於藍藻藍球藻目(Chroococcales)的集胞藻屬和聚球藻屬的含有一些或所有上述脂質和脂肪酸的物種的方法。本發明通過利用連續光，在存在光合成有效輻射(PAR)波長內的選擇頻段的情況下，調整光合效率，還提供了獲得的脂質中脂肪酸特異性產物的方法。
[0114]本發明還涉及到一個屬於肋胞藻科具體為綠蛇藻屬藻類的特定(分離)藻株，更具體為阿洛格綠蛇藻的藻株。所述藻株保藏在藻類和原生動物培養中心，保藏號為CCAP817/1，並於2011年I月25日被接受。本文表明，本發明顯示所述藻株可用於特定代謝物的生產。
[0115]本發明進一步提供了生產含有二十碳五烯酸和上述脂質、脂肪酸及其代謝物的藻類生物質產物的方法，適合下遊產品生物柴油、汽油、煤油及其他這類液體生物燃料和高價值的工業化學品的生產，包括以下步驟:
[0116]a)上遊培養階段，其用於使用調整的連續PAR波長和工藝用水應力來分離、傳代培養並製備調整的藻類，所述藻類屬於綠藻門的物種，包括特別是富含EPA的肋胞藻科和藍球藻目集胞藻屬和聚球藻屬。屬於肋胞藻科和藍球藻目集胞藻屬和聚球藻屬的藻類，現在可使用類似的光發射和水源在生物反應器中擴大培養。結果表明，與相同培養物在正常水、添加養分和日光或日光燈照明下生長相比，預計不同的藻株間生長速率增加兩倍。
[0117]b)光生物生物反應器階段(Photobiobioreactor stage),其中，將屬於綠藻門肋胞藻科或藍球藻目集胞藻屬和聚球藻屬的藻類生長於工業工藝用水、+\-養分(100%的標準 BB 生長培養基，包括 NaNO3 (0.25g/L) ; CaCl2.2H20 (0.025g/L) ;MgSO4.7H20 (0.075g/L) ; K2HPO4 (0.075g/L) ;NaCl (0.025g/L) ; KH2PO4 (0.175g/L) ;FeS04.7H20 (4.98mg/L) ; H2SO4 (0.01 μ 1/L) ; H3BO3 (0.1142g/L) ; ZnSO4.7H20(0.00882g/L) ; MnCl2.4H20 (0.00144g/L) ;Mo03 (0.00071g/L) ; CuSO4.5H20 (0.00157g/L) ; Co (NO3) 2.6H20 (0.00049g/L) ;EDTA(0.005g/L) ;K0H(0.031g/L))中，在指數生長期內維持連續流動系統中特定的PAR光波長和輻照度水平，以允 許每日收穫的特定比例的生物質。生物質產品含上述脂質、脂肪酸及其代謝物和屬於肋胞藻科和藍球藻目聚球藻屬和集胞藻屬的生物蛋白。生物反應器裝滿了工藝用水或用養分改良的工藝用水，使藻類細胞密度在下一個收穫季節前恢復到指數生長階段。
[0118]相對於乾燥的藻類的總重量，藻類通常含有約7-60% (重量/重量)的脂質含量。在藻類屬於肋胞藻科的情況下，二十碳五烯酸包括脂質中25-40%的總脂肪酸，剩餘的脂肪酸主要是上述的飽和或不飽和脂肪酸。因此，屬於肋胞藻科的藻類擁有比來自魚油的傳統來源更大量的EPA。
[0119]根據本發明的實施方案，屬於肋胞藻科的脂類和代謝物二十碳五烯酸、肉豆蘧酸、棕櫚酸、山嵛酸、月桂酸、亞油酸、α -亞麻酸、硬脂酸等被發現可以作為游離脂肪酸和/或原位存在於生長培養基中和/或從溼藻類生物質產物和/或藻類勻漿物和/或冷凍乾燥或空氣乾燥後的藻類得到，並在合適的有機溶劑的存在下和/或超聲或超臨界CO2提取。
[0120]在本發明的某些實施方案中，當帶有藻類的生長培養基(用水修復或養分改良的水)流過生物反應器時，所述培養基被暴露於調整的多組LED燈庫下，所述多組LED燈庫位於生物反應器內部或外部，並包括發射紅光和藍光二極體(LED)獨特模式,根據藻類藻株，將其設置為以不同波長運行。優化LED的角度以將輻照度最大化地送遞到生長於PBR中的藻類培養物，以促進和維持藻類的指數生長期。不但監測藻類生物質的細胞密度，而且還監測其脂質/脂肪酸含量，以檢查它們是否已經達到了目標水平。然後將生物質脫水並傳遞到合適的下遊工藝，用於提取生物燃料或高價值脂肪酸。剩餘的廢生物質可用於動物飼料(如在生物反應器使用純水)或用於在厭氧沼氣池(AD)或熱解系統進行能源生產。
[0121]生物反應器
[0122]本發明提供了一種集成方法，其使用標準或可再生能源的任意組合，來向光生物反應器提供動力並產生持續的高產率藻類生物質，所述能源如太陽能、風能、水能、地熱、熱和/或其他可再生能源。通過使用高效和有成本效益的方法，進一步精製藻類生物質來生產生物柴油、生物煤油、汽油、乙醇和其他有價值的副產品。
[0123]所述系統包括高度調整的LED光源，其設計為使不同藻類藻株的生長最大化。所述系統包括但不限於，高度調整的LED光源，其設計為從生物反應器中心提供360度照明，從而使不同類藻株的生長最大化(在光源周圍生長)。
[0124]能量來源
[0125]所述系統可以使用來自太陽能、風能、水能、地熱和熱和/或可再生能源的能量自供能。這些不同的能量源通過商業電力管理系統來管理，所述電力管理系統利用通過一個可擴展的存儲設備(如蓄電池組)來存儲和供應能量。
[0126]所述方法的溫度通 過兩種方式來控制:通過供應天然來自工業系統或家庭廢水的工藝用水，加熱水，由溫控器或換熱器調節或通過自動化處理控制單元管理。
[0127]低能光源
[0128]所述方法使用多種由標準和/或可再生能源組合提供動力的低壓燈(如LED以及其他獨特的發光源)，其中將燈調整為優化藻類的生長，而不損害脂質或其他有商業價值的
副廣品。
[0129]在優選的實施方案中，一組燈配備於PBR的外部或內部，所述燈以精確的光束髮射角發射的光涵蓋的波長位於400-700nm的光合有效輻射(PAR)波長範圍內。這有助於刺激藻類，從而以具有成本效益的生產速率使生物質生長最大化。
[0130]從現有環境自適應條件，採用特定的光源和波長、工藝用水、溫度和pH值管理，選擇藻類，以產生能在能源輸入降低的情況下生長最佳的藻株。
[0131]在一個實施方案中，本發明提供了在任意光生物反應器系統內提高攝食膠網藻ALG03藻類的胞外多糖(EPS)的新方法。這包括:(a)預培養，以使藻株適應光合有效輻射(PAR)波長內的調整的LED光照和工業工藝用水條件(如二級處理的工藝用水)；(b)使形成EPS的藻株生長於PBR中，所述PBR補充了調整的LED PAR(光合有效輻射400_700nm)光照，以便每天在任何地方為藻類提供1-24小時的持續照明，(c)在指數生長期峰值後，將一部分例如約50%的產量移動到溫和通風(環境空氣，未添加CO2)的靜態照明容器系統中，超過3-4天，以提高的EPS的形成；(d)使藻類糊狀物(paste)脫水，用於提取生物聚合物或如上所述的其他用途，或用於通過乙醇發酵或其他方法生產能源(如厭氧消化或生物質氣化)。
[0132]適合在本發明中使用的凝膠塗層微藻藻株的實例，可在綠藻門中並選自膠網藻科。[0133]適應的藻類藻株
[0134]在標準燒瓶培養中，將用於EPS生產的微藻藻株維持在工業生產用水的異質供應物中，並通過低能LED設備以調整的光模式供應PAR光照。所述光在PBR的內部或外部供應。每個月將培養物進行傳代培養，以選擇適應廢水成分和LED光照的細胞。這種表型選擇方法包括在每一次傳代培養時檢查EPS生產的評估步驟。將母本培養物維持在這些生長條件下，以繼續該適應過程。
[0135]藻類在光生物反應器(PBRs)的生長
[0136]為了發展生產微型藻類(G)的小規模PBRs，已經做了大量工作。商業規模的PBRs (>100, 000L)應該有大體積容量，並且佔用空間而言應具有小足跡。此外，它們應該有透明的表面、高質量轉移速率並且應該能夠生產大的生物質產量。此外，任何PBR設計都應考慮採取個別微藻藻株的獨特需求，並且應當是低成本維護和穩健的。
[0137]有人曾提出，PBRs也可以作為室外池塘生長系統的培養容器。鑑於戶外PBRs通常是利用太陽光自然照明， 生物質生產力將取決於當地現行的全年環境條件。在已經測試的大部分地區(通常沙漠環境)，全年存在溫度和日光的季節性變化，因此在這類地區難以一年到頭在室外進行大量藻類培養。公共領域存在正被商業出售的PBRs設計，在學術文章中也有許多PBRs設計，但不存在確定的「最佳實踐」標準模型。
[0138]在第一組實施方案中，可以使用任何PBR設備(氣升管設計或扁容器)，所述設備具有每天排空或收穫細胞的裝置，該裝置可以採用LED(內部或外部)光照的PAR波長部分連續一天24小時照亮。藻類生長情況由連接的進程控制裝置測量0D680nm的值來檢測，該值通過事先推算與細胞數量有關並允許由PBR調試確定指數增長峰值。所述系統包括但不限於，包括高度調整的LED光源，所述光源設計為從生物反應器中心提供360度的照明，以使不同藻類藻株的生長最大化(在光源周圍生長)。
[0139]到達指數生長峰值後，每天將50%的細胞收穫到一個單獨批次的存儲罐(holdingtank)，其具有連接的通風裝置(aeration)(環境空氣混合)和LED光照24/7。為了生產EPS,藻株在規定的條件下生長3-4天，每天在顯微鏡下可視化監視從所述存儲罐中取出的樣品。最後，將這些細胞通過脫水提取用於碳水化合物提取或前面描述的用途。
[0140]光源
[0141]藻類培養系統可以由人工燈、日光或兩者照明。在封閉的PBR中控制高生物質微藻生產的最重要因素之一是，送遞的光譜質量和光輻照度。如果PBR位於戶外，它可以受限於白天和夏季幾個月期間見到的高光水平，但這會因地域而不同。自然日光中紫外光(「UV」)的水平也能在一天某些時間引起藻類的光抑制，因此缺乏對使用人造光的PBR生長的潛在控制。
[0142]一個可以提供特定的光波長的主要光源是發光二極體(「LED」)，其目前正在由幾個主要的燈製造商開發。LEDs能節約能源且預期壽命很長。它們的電氣效率有助於最大限度地減少熱量產生。這種高效率和尖銳的光譜已經消除了冷卻系統和過濾器的需要，因此顯著降低了能量輸入的要求。這些因素開拓了優化用於特定微藻藻株的光送遞的潛能。
[0143]已知哪部分光合有效輻射(PAR)光譜(400_700nm之間，涵蓋了紅色和藍色的頻譜兩端)通常有助於使藻類的有效光合作用最大化，但少量數據存在(在公共領域)這種光輻照在用於對於生長於PBR內、人造光源下的不同藻類藻株而言，(在公共領域)有關這類光輻照度與生物燃料前體(脂質/碳水化合物)的生長和生理狀態的相互作用的數據很少。 申請人:已經發現了紅/藍色LED要求和為一系列微藻和本文EPS生產的雙階段方法送遞的輻照度水平。
[0144]PBR系統的可持續能量輸入
[0145]「廢水」流的潛在用途一直在文獻中被連篇累牘地爭論，純淨的煙氣為用作藻類生長的營養培養基的改良的工藝用水提供co2。目前存在幾個已經確立的有意義的或成功的示範項目。據估計，使用混合系統，藻類可用於回收電力行業20%的二氧化碳排放量。如果可以開發捕獲二氧化碳的新型和便宜來源，這會降低PBRs的成本和能量需求。
[0146]使藻類在工業工藝用水中生長的方法，能將養分水平降低至通過世界各地逐步形成嚴格的立法目標而對水排放至環境尤其是特定貯水池所潛在要求的水平。
[0147] 申請人:已發現在控制的溫度和光輻照度水平下，本文所述藻類有成本效益地生長所需的最佳養分水平。
[0148]藻類生物質和生物聚合物
[0149]海藻多糖目前已被商業應用(d)，人們已知土壤藻類分泌多種胞外聚合物(EPS)，尤其是多糖，其對藻類的生命功能發揮了重要作用(e)。形成胞外多糖(EPS)的藻類藻株還具有用於水中來通過將潛在的有毒元素隔離在分批階段和分批階段之前所形成的EPS中修復的優點。有明確的證據證明，如同銅的元素可以被這些粘液化合物(I)約束。如果以下遊排放和使用作為水清理的主要目的，則這具有明確的價值。對EPS組成進行的碳水化合物分析表明94-95%的中性單糖和約5-6%的糖醛酸。後者對重金屬的結合特別重要。
[0150]已知的是，土壤藻類增強土壤形成和水分保持、穩定土壤、增加附近生長的植物的養分的有效性以及減少水土流失。它們作為土壤調理劑在許多國家得到介紹，並且它們也被建議用作生物肥料(J)。
[0151]在使用灌溉系統的以色列，降低』甜』水供應，會增加使用再生水的需要，並且二級處理水已用於市場新鮮蔬菜和水果生產。然而，對於其廣泛使用，在許多國家確實需要修訂法規，即使使用SDI，其中處理水沒有達到作物的可食用部分(地上)。
[0152]傳統的滴灌見於地上，但最近許多生產滴灌系統的公司發明並實施了地下滴灌(SDI)系統。為了更長的壽命，該線路被埋入地面以下。地下灌溉允許將水、養分和其他農用化學品直接精確應用到植物根區。這允許農民優化生長環境並產生更高質量的作物產量。
[0153]如果正確管理，SDI是灌溉植物最有效的方法之一，其效率>90%。與其他方法相t匕，應用水的節約可高達50%。可供灌溉的水量預計將在未來幾十年下降，因此對水的保護更重要。這是SDI通過延長含水層壽命而體現其關鍵性之處。其用於生物燃料作物有很大的潛力，並且在貧瘠的土壤中已經證明，使用SDI能使甘蔗產量增加一倍，在保留70%的用水需求的同時糖含量增加(k)。攝食膠網藻ALG03的適應藻株的胞外多糖，也可用於使用所提取的碳水化合物進行生物乙醇的下遊生產。剩餘的碳水化合物和蛋白質可用於其他副產物，例如食品添加劑和動物飼料。
[0154]通過參考以下非限制性實施例，會進一步理解本發明。
實施例[0155]實施例1
[0156]將屬於肋胞藻科或藍球藻目集胞藻屬和聚球藻屬的藻類在養分改良的水和連續PAR光照條件下(400-700nm的波長內)預培養6個月的時期，並以有規律的間隔進行傳代培養。將分離的培養物進一步傳代培養，使它們進入指數生長期，並用於一系列50L的生物反應器中。傳代培養的藻類被轉移到含有養分改良水的50L生物反應器中，並允許在持續PAR光照條件存在下(波長在400-700nm之間)達到指數生長期，取自所述傳代藻類的接種物的起始細胞密度為每毫升IO6個細胞。控制所述方法的各種參數，包括:pH值(保持在6-9之間)、溫度(保持在20-40°C之間)、通風(0.02~1.0v/v/m(體積/體積/分鐘)-空氣體積/液體體積/每分鐘)和/或CO2 (啟動時0%，第一次收穫完成至少0.7%，但在系統內隨時間可以達到5% ) ;02(保持在500-800mV之間)；在PBR通風的第一室最大的光輻照度(600 μ mol !Λ-1)，CO2 (在開始時添加的CO2為O %，通過收穫上升到0.7%)，細胞密度，溫度(27°C平均)和光送遞(每天24小時)。在到達最大指數生長附近後，從反應器中取出500g溼藻類生物質產物。加入含有甲醇/乙醯氯/己烷的溶劑混合物，生產天然脂質酸的甲基酯。通過層析使用己烷和丙酮溶液分離該甲基酯，隨後蒸發，獲得1.6g 二十碳五烯酸。層析還提供了肉豆蘧酸、棕櫚酸山嵛酸、月桂酸、亞油酸、α-亞麻酸、硬脂酸等的純樣品。
[0157]實施例2
[0158]50.08g生物質在105°C乾燥6小時。在容器中冷卻後，將樣品在烘箱中於105°C下放置I小時，再次稱重。在索氏提取器(Soxhlet extraction device)中，將乾燥生物質在提取容器(extraction capsule)中用260ml石油醚提取8小時。在真空旋轉蒸發器中蒸發掉溶劑後，通過使氮氣細流在樣品上通過，進一步乾燥樣品，再次冷卻後稱重。為了獲得脂質，將樣品溶解於50ml己烷，並分為兩半。向第一個樣品中加入IOg活性炭，將溶液過濾，再次蒸發、流出氮氣並稱重。仍然存在一些顏色，因此第二個樣品使用20g活性炭。
[0159]樣品分析使用安捷倫科技(Agilent Technologies) 6890N和柱HP88,氰丙基-長度:100m-直徑:0，25mm,層寬度:0.20 μ m。
[0160]表1.來自3個不同批次PBR周期的、代謝途徑連接的3種脂肪酸百分比的分析結果
[0161]
【權利要求】
1.用於提高微藻和/或藍藻的一種或多種代謝物生產的方法，所述方法包括以下步驟: (i)在生產階段培養微藻或藍藻藻株； (ii)將所述微藻或藍藻培養物曝露在刺激下，其中所述刺激包括:(a)將pH降低至不超過約PH6，隨後將pH增加至不低於約pH7，及(b)將光輻照度增加到至少400 μ mol/m2/seco
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述刺激包括pH從約pH7-pH9降低至約pH5_pH6。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其中所述刺激包括LED送遞的輻照度從約50-200 μ mol/m2/sec 增加至約 400-2000 μ mol/m2/sec。
4.根據權利要求1-3中任一項所述的方法，其中所述生產階段對應於指數生長期。
5.根據權利要求1-4中任一項所述的方法，其中所述生產階段包括使所述藍藻或微藻在允許指數生長的條件下生長。
6.根據權利要求1-5中任一項所述的方法，其中所述生產階段包括使所述微藻或藍藻在光生物反應器中生長。
7.根據權利要求1-6中任一項所述的方法，其中所述生產階段包括使所述微藻和/或藍藻在LED下生長，所述LED發射的紅光和藍光的兩個峰位於400-700nm PAR光譜內。
8.根據權利要求1-7中任一項所述的方法，其中不將所述培養物暴露在自然日光下。
9.根據權利要求1-8中任一項所述的方法，其中將所述微藻或藍藻培養物在指數生長期的峰值和/或穩定生長期的起始時暴露在刺激下。
10.根據權利要求1-9中任一項所述的方法，其中所述刺激還包括添加碳源。
11.根據權利要求1-10中任一項所述的方法，其中通過添加CO2啟動所述pH的降低。
12.根據權利要求1-11中任一項所述的方法，其中將所述pH在約30分鐘至2小時的期間內降低到約pH5-pH6，且所述期間在所述光輻照度增加之前。
13.根據權利要求12所述的方法，其中在所述pH值下降後，將所述pH值增加至約pH7-pH9。
14.根據權利要求1-13中任一項所述的方法，其中將所述微藻或藍藻曝露在刺激下後，在收穫代謝物之前，再將所述微藻或藍藻培養約48小時。
15.根據權利要求1-14中任一項所述的方法，其中所述方法用於提高脂質的生產。
16.根據權利要求15所述的方法，其中所述脂質為二十碳五烯酸。
17.根據權利要求1-14中任一項所述的方法，其中所述方法用於提高碳水化合物的生產。
18.根據權利要求17所述的方法，其中所述碳水化合物為胞外多糖。
19.根據權利要求1-18中任一項所述的方法，其中所述微藻/藍藻是綠微藻/藍藻。
20.根據權利要求1-18中任一項所述的方法,其中所述微藻/藍藻是淡水微藻/藍藻。
21.根據權利要求1-18中任一項所述的方法，其中所述微藻藻株選自綠藻門(Chlorophyta)。
22.根據權利要求1-18中任一項所述的方法，其中所述微藻藻株選自肋胞藻科(Pleurochloridaceae)。
23.根據權利要求1-18中任一項所述的方法,其中所述微藻藻株選自Trachydiscussp.和綠蛇藻(Chlorogibba sp.)。
24.根據權利要求1-18中任一項所述的方法，其中所述微藻藻株選自攝食膠網藻(Dictyosphaerium chlorelloides)。
25.根據權利要求1-18中任一項所述的方法，其中所述藍藻藻株選自藍球藻目(Chroococcales)。
26.根據權利要求1-18中任一項所述的方法，其中所述藍藻藻株選自集胞藻屬(Synechocystis)或聚球藻屬(Synechoccocus)。
27.根據權利要求1-18中任一項所述的方法，其中所述微藻藻株是保藏在藻類和原生動物培養中心，保藏號為CCAP817/1的阿洛格綠蛇藻(Chlorogibba allorgei)藻株,或是由其衍生的突變藻株。
28.根據權利要求1-18中任一項所述的方法，其中所述微藻藻株是保藏在藻類和原生動物培養中心，保藏號為CCAP222/98的攝食膠網藻藻株，或是由其衍生的突變藻株。
29.用於生產或增長微藻和/或藍藻或由其衍生的一種或多種代謝物的方法，所述方法包括: (i)適應階段，包括 將微藻或藍藻培養於: (a)工藝用水原料中，並選擇能夠在工藝用水原料中生長的微藻或藍藻，和/或 (b)發光二極體(LED)下，所述發光二極體(LED)所發射的紅光和藍光的2個峰位於光波長為約400-700nm的光譜內； (ii)生產階段，包括在與所述適應階段所用相同的工藝用水原料中和/或在與所述適應階段所用相同的光照條件下培養(i)中所選擇的微藻或藍藻。
30.根據權利要求29所述的方法，其中所述工藝用水的pH為約pH7-pH9。
31.根據權利要求29或30所述的方法，其中在所述適應階段中將溫度保持在200C -29°C之間。
32.根據權利要求29-31中任一項所述的方法，其中將所述微藻和/或藍藻暴露在波長為約400nm-700nm的光下。
33.根據權利要求29-32中任一項所述的方法，其中將所述微藻和/或藍藻暴露於發光二極體(LED)下,所述發光二極體(LED)發射的紅光峰值在約500_665nm的範圍內，優選為約660nm，所述發光二極體(LED)發射的藍光峰值在約440_500nm的範圍內，優選為約460nmo
34.根據權利要求29-33中任一項所述的方法，其中將所述微藻和/或藍藻暴露在輻射度水平為約50-200 μ mol/m2/s的光下。
35.根據權利要求29-34中任一項所述的方法，其中所述適應階段包括將所述微藻或藍藻藻株培養至少約3個月。
36.根據權利要求29-35中任一項所述的方法，其中所述適應階段包括將微藻或藍藻藻株培養至少6代生長。
37.根據權利要求35或36所述的方法，其中所述適應階段包括對所述微藻或藍藻藻株進行多輪傳代培養。
38.根據權利要求37所述的方法,其中將所述微藻或藍藻每月傳代培養一次。
39.根據權利要求29-38中任一項所述的方法，其中所述生產階段包括使適應的微藻或藍藻藻株在光生物反應器中生長。
40.根據權利要求29-39中任一項所述的方法，其中所述生產階段包括在允許指數生長的條件下培養所述適應的微藻和/或藍藻藻株。
41.根據權利要求29-40中任一項所述的方法，其中不將所述培養暴露在自然日光下。
42.根據權利要求29-41中任一項所述的方法，其中所述生產階段包括，在與所述適應階段生長所用相同的光照條件下培養所述適應的微藻和/或藍藻藻株。
43.根據權利要求42所述的方法，其中所述光是由發光二極體(LED)產生的，所述發光二極體(LED)發射的藍光和紅光的2個峰位於光波長為約400-700nm的光譜內。
44.根據權利要求29-43中任一項所述的方法，其中所述生產階段之後的步驟包括將所述微藻或藍藻培養物暴露在刺激下，以誘導代謝物生產的提高。
45.根據權利要求44所述的方法，其中所述刺激包括:(a)將pH降低至不超過約pH6，隨後將pH增加至不低於約pH7,及(b)將光福照度增加到至少400 μ mol/m2/sec。
46.根據權利要求45所述的方法，其中所述刺激包括pH從約pH7-pH9降低至約pH5-pH6。
47.根據權利要求45或46中任一項所述的方法，其中所述刺激包括將LED送遞的輻照度從約 50-200 μ mol/m2/sec 增加至約 400-2000 μ mol/m2/sec。
48.根據權利要求45-47中任一項所述的方法,其中，一旦微藻或藍藻暴露培養物到達指數期生長峰值和/或穩定生長 期開始，則將所述培養物暴露在所述刺激下。
49.根據權利要求45-48中任一項所述的方法，其中所述刺激還包括添加碳源。
50.根據權利要求45-49中任一項所述的方法，其中通過添加CO2啟動所述pH降低。
51.根據權利要求45-50中任一項所述的方法，其中將所述pH在約30分鐘至2小時的期間內降低到約pH5-pH6，以及所述期間在所述光輻照度增加之前。
52.根據權利要求51所述的方法，其中在pH降低後，將所述pH增加至約pH7-pH9。
53.根據權利要求45-52所述的方法，其中將所述微藻或藍藻曝露在所述刺激下後，在收穫代謝物之前，將所述微藻或藍藻再培養約48小時。
54.根據權利要求29-53中任一項所述的方法，其中所述方法用於提高脂質的生產。
55.根據權利要求54所述的方法，其中所述脂質為二十碳五烯酸。
56.根據權利要求29-53中任一項所述的方法，其中所述方法用於提高碳水化合物的生產。
57.根據權利要求56所述的方法，其中所述碳水化合物為胞外多糖。
58.根據權利要求29-57中任一項所述的方法,其中所述微藻/藍藻是綠微藻/藍藻。
59.根據權利要求29-57任一項所述的方法,其中所述微藻/藍藻是淡水微藻/藍藻。
60.根據權利要求29-57中任一項所述的方法,其中所述微藻藻株選自綠藻門。
61.根據權利要求29-57中任一項所述的方法,其中所述微藻藻株選自肋胞藻科。
62.根據權利要求29-57中任一項所述的方法,其中所述微藻藻株選自Trachydiscussp.和綠蛇藻。
63.根據權利要求29-57中任一項所述的方法，其中所述微藻藻株選自攝食膠網藻。
64.根據權利要求29-57中任一項所述的方法,其中所述藍藻藻株選自藍球藻目。
65.根據權利要求29-57中任一項所述的方法,其中所述藍藻藻株選自集胞藻屬或聚球藻屬。
66.根據權利要求29-57中任一項所述的方法，其中所述微藻藻株是保藏在藻類和原生動物培養中心，保藏號為CCAP817/1的阿洛格綠蛇藻藻株，或是由其衍生的突變藻株。
67.根據權利要求29-57中任一項所述的方法，其中所述的微藻藻株是保藏在藻類和原生動物培養中心，保藏號為CCAP222/98的攝食膠網藻藻株，或是由其衍生的突變藻株。
68.根據權利要求29-67中任一項所述的方法，其中所述方法用於提高藻類和/或藍藻生物質的生產。
69.根據權利要求68所述的方法，其中所述藻類和/或藍藻生物質用於生產生物燃料。
70.根據權利要求68所述的方法，其中所述藻類和/或藍藻生物質用作土壤調理劑或生物肥料。
71.—種微生物，其是保藏在藻類和原生動物培養中心，保藏號為CCAP817/1的阿洛格綠蛇藻藻株，或是由其衍生的突變藻株，或具有所述藻株的識別特徵。
72.—種微生物，其是保藏在藻類和原生動物培養中心，保藏號為CCAP222/98的攝食膠網藻藻株，或是由其衍生的突變藻株，或具有所述藻株的識別特徵。
73.用於提高屬於肋胞藻科且含有下述物質的微藻生產的方法:具有商業價值的生物蛋白質，脂類和代謝物，如二十碳五烯酸、肉豆蘧酸、棕櫚酸山嵛酸、月桂酸、亞油酸、α-亞麻酸、和硬脂酸等，所述方法利用優化的光波長，優選在光生物反應器中培養和生產富含脂質的綠藻門且選自肋胞藻科的微藻藻株。
74.根據權利要求73所述的方法，其中工業副產品如廢工藝用水和CO2被用作養分和碳的再生源，以利用這些 輸入提高生長來調整/適應所述藻類。
75.根據權利要求73或74所述的方法，包括使用優化的光波長、工藝用水和養分添加。
76.根據權利要求73-75中任一項所述的方法，其中將所述藻類維持在適應刺激下(選擇PAR光波長和光源、工藝用水源和其他生長培養基成分)，以繼續藻類細胞的適應選擇。
77.用於生產諸如二十碳五烯酸、肉豆蘧酸、棕櫚酸山嵛酸、月桂酸、亞油酸、α-亞麻酸、硬脂酸等脂肪酸的方法，包括下述步驟:準備屬於肋胞藻科和來自藍球藻目聚球藻屬和集胞藻屬的藍藻藻株的藻類生物質，並從脂質中分離具有商業價值的產物。
78.根據權利要求77所述的方法，用於在所選擇的持續光PAR波長存在的情況下，通過調整光合效率來獲得脂質組成(lipid profile)中特定脂肪酸的生產。
79.根據權利要求73-78中任一項所述的方法，用於獲取脂質組成中特定的脂肪酸產品，其通過調整生長培養基中的養分水平和光輻照來為食品或化妝品行業或生物燃料生產提供產物/組分。
80.—種用於改善藻類細胞生長狀態(growth profile)和/或改變或控制所述藻類細胞的代謝物生產狀態如脂肪酸組成的方法，包括:通過將所述藻類細胞暴露於特定條件下進數輪傳代培養，使所述藻類細胞適應所述特定條件，之後從所述藻細胞中回收代謝物。
81.根據權利要求80所述的方法，其中所述特定條件為對非適應藻類生長而言次優的條件。
82.根據權利要求80或81所述的方法，其中使所述藻類細胞適應LED光照，任選地其波長在約400-700nm之間。
83.根據權利要求80-82中任一項所述的方法，其中所述藻類細胞適應於處理後的工藝用水。
84.—種基本上如本文參考附圖所描述的方法。
85.—種微生物，其是保藏在藻類和原生動物培養中心，保藏號為CCAP817/1的阿洛格綠蛇藻藻株，或是由其衍生的突變藻株，或具有所述藻株的識別特徵。
86.—種基本上如本文參考附圖所描述的微生物。
87.—種雙階段連續生產胞外多糖(EPS)的方法，在存在溶解的二氧化碳和LED提供的經調整的入射光能的情況下，將微藻培養於養分改良的含水培養物中，其中通過使所述培養從有利於細胞分裂的生長期轉變為有利於EPS生產的穩定期，提高EPS生產，包括: (a)在以連續模式運行的第一階段，進行所述生長期，其中新鮮的營養培養基或二次工藝用水供應用於使所述培養物生長，以維持細胞指數生長，和 (b)隨同將新鮮的營養培養基和CO2供應於所述第一階段，將一部分所述培養物轉移至第二階段，所述第二階段與所述第一階段分離，且在所述第二階段中限制CO2和養分的供應，同時由調整的LED繼續供應設定輻照度水平的調整的PAR光，以便在第二階段產生提高EPS生產的條件，同時任選地，將新鮮的營養培養基或工藝用水添加到所述第一階段，以繼續所述生長期，任選地同時進行。
88.根據權利要求87所述的方法，其中入射光能的照明率在所述第一階段要高於所述第二階段。
89.根據權利要求87或88所述的方法，其中所述第一階段在任選厚度為3-11釐米的培養容器中進行。
90.根據權利要求87-89中任一項所述的方法，還包括以下步驟:監測所述第一階段的細胞密度和向所述第一階段添加新鮮營養培養基，以及將培養物從所述第一階段轉移到第二階段以響應在所述第一階段細胞密度的增加高於指定水平，從而將所述細胞密度保持在所述指定水平。
91.根據權利要求87-90中任一項所述的方法，其中通過將培養物從所述第一階段連續地轉移到第二階段，實施步驟(b)，由此細胞在第一階段生長的同時，在所述第二階段反應容器中發生EPS生產。
92.根據權利要求87-91中任一項所述的方法，其中通過培養攝食膠網藻，任選地ALG03藻株，或同一科中的其他物種，生產EPS。
93.根據權利要求87-92中任一項所述的方法，其中離光源最近的細胞上入射光能的照明率在所述第一階段位於50-500ymOl HT2s-1的範圍內，在所述第二階段位於30-200 μ mo I m 2S 1 的範圍內。
94.根據權利要求87-93中任一項所述的方法，其中在所述第二階段所述入射光能的能量含量主要在400-700nm範圍內。
95.根據權利要求87-94中任一項所述的方法，還包括利用藻類生物質作為根土壤調理劑。
96.根據權利要求95所述的方法，其中通過地下滴灌系統送遞所述生物質。
97.土壤調理劑，含有權利要求87-96中任一項所述方法生產的藻類生物質。
98.地下滴灌系統，包括權利要求97所述土壤調理劑。
99.用於生產藻類EPS的系統，包括:第一階段反應室，適於容納藻細胞培養物，並具有用於將營養培養基和CO2引入所述反應室的入口和用於從中回收培養物的出口； 用於檢測所述反應室中的細胞密度並產生對應控制功能的裝置； 響應所述控制功能，用於調節營養培養基和CO2向所述入口的引入和培養物自所述出口的回收的裝置； 多個第二階段反應室，適於容納來自所述第一階段反應室的培養物；以及 用於將培養物從所述第一階段反應室的出口順序轉移到所述第二階段反應室的裝置。
100.—種基本上如本文參考附圖所描述的方法。
101.一種基本上如本文參考附圖所描述的土壤調理劑。
102.一種基本上如本文參考附圖所描述的系統。
103.—種基本上如本文參考附圖所描述的地下滴灌系統。
104.一種微生物，其是保藏在藻類和原生動物培養中心，保藏號為CCAP222/98的攝食膠網藻藻株，或是由其衍生的突變藻株，或具有所述藻株的識別特徵。
105.—種基本上如本文參 考附圖所描述的微生物。
【文檔編號】C12P19/04GK103459585SQ201280015125
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2012年1月30日 優先權日:2011年1月28日
【發明者】約翰·多德, 巴拉索羅·馬薩萊克, 米羅斯拉夫·沃薩提克, 納齊爾·巴希爾 申請人:奧格賽特斯有限公司