一種培養甲烷氧化菌的方法
2023-05-27 10:42:41 2
專利名稱：一種培養甲烷氧化菌的方法
技術領域：
本發明涉及微生物的培養方法，特別是涉及一種甲烷氧化菌的快速培養方法。
背景技術：
甲烷氧化菌是自然界中一類非常特殊的微生物，它以甲烷為唯一的碳源及能源。雖然某些甲烷氧化菌也可以同時利用甲醇，但所有的甲烷氧化菌都不能利用多碳化合物。研究表明甲烷氧化菌可以廣泛地應用於生物轉化及環境治理中。甲烷單加氧酶是甲烷氧化菌利用甲烷的關鍵酶，在該酶的作用下，甲烷氧化菌能夠利用空氣中的氧氣作為電子受體將甲烷直接氧化為甲醇。一般情況下，由於甲烷在水溶液中的溶解度較低，導致甲烷氧化菌生長速率慢、所得細胞濃度低，成為限制甲烷氧化菌工業化應用的瓶頸。提高氣液傳質是強化甲烷氧化菌生長和甲醇生產的關鍵技術之一。因此，如何強化氣液傳質，提高氣液傳質速率，是實現甲烷氧化菌的高密度細胞培養首先需要解決的問題。傳統的解決辦法是增加氣速和攪拌速率。但增加氣速和攪拌速率，一方面可導致大量的泡沫生成，從而降低反應器使用效率；另一方面氣速和攪拌速率的增加必然增大動力消耗，增加操作成本。和一般好氧微生物細胞的培養不同，甲烷氧化菌的細胞培養過程，不僅需要空氣或氧氣，而且需要甲烷。甲烷與空氣或氧氣的混合比例超過一定範圍時具有爆炸危險，而且，增大氣流速度必然導致氣體的大量循環，且工藝複雜，動力消耗增加。
傳統的甲烷氧化菌的固體平板培養法操作複雜，培養時間長。不僅需要每天換氣，而且培養到菌落出現一般需4-6周的時間，在反覆地換氣過程中又極易造成雜菌的汙染。因此有必要發明一種快速、簡便的甲烷氧化菌的固體平板培養方法。
發明內容
本發明的目的是提供一種可顯著提高甲烷氧化菌的生長速率的培養方法。
本發明所提供的甲烷氧化菌的快速培養方法，是在常規培養甲烷氧化菌的培養基中添加石蠟油。
上述培養方法對甲烷氧化菌的液體培養和固體培養同時適用。
對甲烷氧化菌進行液體培養時，只需將石蠟油直接加入培養基中即可。石蠟油的使用量與培養容器的形狀有關，其在培養基中的質量百分含量優選為0.1-20％，勿使培養基表面覆蓋的石蠟油層太厚。
對甲烷氧化菌進行固體培養時，需將經甲烷飽和的石蠟油塗布在固體培養基表面。
所述對石蠟油用甲烷進行飽和的方法，是將石蠟油置於充滿甲烷的密閉器皿中進行振蕩，使甲烷分子儘可能地溶解於石蠟油中；若在50-250rpm的振速下，振蕩12-24小時即可。
在固體培養基表面塗布的石蠟油層的厚度可為0.5-3mm，勿使培養基表面覆蓋的石蠟油層太厚。
為獲得更好的培養效果，可將表面塗布有用甲烷飽和的石蠟油的固體培養基在30℃下放置12-24小時，再按常規方法進行接種、培養。
本發明提供了一種甲烷氧化菌的快速培養方法。在用本發明的方法對甲烷氧化菌進行振蕩培養過程中，石蠟油受到機械力的作用形成微小的小球，這些小球可以在氣相與菌體之間穿梭運動，從而源源不斷地將空氣中的甲烷直接供給菌體生長之用，該方法與傳統培養方法的區別如圖1所示(A為常規培養方法，B為本發明的培養方法)，與常規培養方法相比，本發明的方法可以成倍地提高甲烷氧化菌的生長速度，最高可達10倍。此外，在用本發明的方法對甲烷氧化菌進行固體平板培養時，不再需要頻繁地給固體平板補充甲烷氣體，同時菌體的生長速度也得到顯著提高。基於上述優點，本發明將在甲烷氧化菌及其相關產品的工業化生產中發揮巨大作用，具有廣闊的應用前景。
下面結合具體實施例對本發明作進一步說明。
圖1為本發明的甲烷氧化菌的培養方法與該菌傳統培養方法的比較示意2為經甲烷飽和的不同甲烷溶劑對甲烷氧化菌生長速度影響的比較試驗中培養第2、3、4天菌液OD600光密度值的測定結果圖3為經甲烷飽和的不同甲烷溶劑對甲烷氧化菌生長速度影響的比較試驗中培養結束後細胞乾重的統計結果具體實施方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法，所有百分比濃度均為質量百分比濃度，所有培養基中的溶劑均為去離子水。
NMS培養基配方每升培養基中含有NaNO30.85克，KH2PO40.53克，Na2HPO42.17克，K2SO40.17克，MgSO4·7H2O 0.037克，CaCl2·2H2O 0.007克，微量元素貯存液2mL，1mmol/L H2SO40.5毫升，FeSO4·7H2O 11.2毫克，CuSO4·5H2O 2.5毫克(固體培養基再添加1.5％的瓊脂)，pH 7.0。
微量元素貯存液的配方為每升溶液中含有ZnSO4·7H2O 0.2042克，MnSO4·4H2O0.223g，H3BO30.062g，Na2MoO4·2H2O 0.048g，CoCl2·6H2O 0.048g，KI 0.083g。
實施例1、甲烷氧化菌的種子培養1)用滅菌的接種環挑取甲烷氧化菌保存液(Methylosinus trichosporium)OB3b(Sullivan JP et al.Methanotrophs，Methylosinus trichosporium OB3b，sMMO，and their application to bioremediation，Crit.Rev.Microbiol.，1998，4(24)335-373；Takeguchi M et al.，Properties of the membranes containing theparticulate methane monooxygenase from Methylosinus trichosporium OB3b，Biometals，1998，11229-234)，用劃線的方法將其接種於NMS平板固體培養基表面，每天用注射器通過0.2μ的過濾器向培養皿中加入5-10毫升的甲烷氣體，30℃培養四周後，平板上有明顯的單菌落產生。
2)取50毫升的培養瓶，裝入NMS液體培養基10毫升，滅菌後，從步驟1)的固體平面上挑一單菌落接種到該NMS液體培養基中，每天用注射器通過0.2μ的過濾器加入5-10毫升的甲烷氣體，30℃、150rpm振蕩培養四周後，培養基可見混濁，用此甲烷氧化菌的常規培養方法獲得了甲烷氧化菌的種子。
實施例2、不同甲烷溶劑對甲烷氧化菌生長速度影響的比較1、甲烷溶劑的飽和處理取6個50毫升的培養瓶，分別裝入20毫升的苯、環己烷、癸烷、辛烷、甲苯和石蠟油，121℃ 15分鐘滅菌後，通過0.2μ的過濾器加入40毫升的甲烷，在30℃的搖床上振蕩12小時(中間通過0.2μ的過濾器補充甲烷數次)，得到經甲烷飽和的不同甲烷溶劑。
2、經甲烷飽和的不同甲烷溶劑對甲烷氧化菌生長速度影響的比較試驗取50毫升的培養瓶7個，均裝入NMS液體培養基10毫升，滅菌後每個培養瓶中分別加入1毫升上述經甲烷飽和的不同甲烷溶劑，再加入500微升實施例1製備的種子液，然後用注射器通過0.2μ的過濾器加入20毫升的甲烷氣體，在30℃、150rpm下培養1周，以常規培養方法為對照，並分別於第2、3、4天記錄菌液OD600的光密度值，光密度值測定結果如圖2所示(1為常規的甲烷氧化菌培養結果；2為利用苯作為甲烷溶劑的培養結果；3為利用環己烷作為甲烷溶劑培養甲烷氧化菌的培養結果；4為利用癸烷作為甲烷溶劑的培養結果；5為利用辛烷作為甲烷溶劑的培養結果；6為利用甲苯作為甲烷溶劑的培養結果；7為利用石蠟油作為甲烷溶劑的培養結果)，培養結束後，統計細胞乾重，統計結果如圖3所示，石蠟油試驗組的甲烷氧化菌的細胞濃度明顯高於其它處理組，OD600的光密度值約可達到1.6，幹細胞回收率可達4.06克/升。
實施例3、利用石蠟油進行甲烷氧化菌的固體平面培養取200微升實例2中的經甲烷飽和的石蠟油，塗布於NMS固體平板的培養基表面，30℃放置20小時後，用接種環取實例1中的菌液劃線接種於固體培養平板上，30℃培養，以傳統的甲烷氧化菌的固體培養為對照。結果培養一周後有明顯的菌落戶生，而對照組在4-6周後才有菌落產生，且操作複雜。該試驗表明本發明的培養方法也可顯著提高甲烷氧化菌固體培養的生長速率。
權利要求
1.一種培養甲烷氧化菌的方法，是在常規培養甲烷氧化菌的培養基中添加石蠟油。
2.根據權利要求1所述的培養方法，其中對甲烷氧化菌進行液體培養時，將石蠟油直接加入培養基中，石蠟油在培養基中的質量百分含量為0.1-20％。
3.根據權利要求1所述的培養方法，其中對甲烷氧化菌進行固體培養時，將經甲烷飽和的石蠟油塗布在固體培養基表面。
4.根據權利要求3所述的培養方法，其中經甲烷飽和的石蠟油是將石蠟油置於充滿甲烷的密閉器皿中進行振蕩得到的。
5.根據權利要求4所述的培養方法，其中所述振蕩的速度為50-250rpm，振蕩時間為12-24小時。
6.根據權利要求3所述的培養方法，其中所述在固體培養基表面塗布的石蠟油層的厚度為0.5-3mm。
7.根據權利要求3-6任一項所述的培養方法，其特徵在於所述將表面塗布有經甲烷飽和的石蠟油的固體培養基在30℃下放置12-24小時，再進行接種。
全文摘要
本發明公開了一種甲烷氧化菌的快速培養方法。該方法是在甲烷氧化菌常規培養方法的基礎上，在培養基中添加石蠟油。在用本發明的方法對甲烷氧化菌進行振蕩培養過程中，石蠟油受到機械力的作用形成微小的小球，這些小球可以在氣相與菌體之間穿梭運動，從而源源不斷地將空氣中的甲烷直接供給菌體生長之用，與常規培養方法相比，本發明的方法可以成倍地提高甲烷氧化菌的生長速度，大大地縮短了該菌的培養時間，培養時間從數周縮短為數天即可完成。同時也提高了該菌的培養密度，菌體密度最高可提高達10倍。此外，在用本發明的方法對甲烷氧化菌進行固體平板培養時，不再需要頻繁地給固體平板補充甲烷氣體，同時菌體的生長速度也得到顯著提高。基於上述優點，本發明將在甲烷氧化菌及其相關產品的工業化生產中發揮巨大作用，具有廣闊的應用前景。
文檔編號C12N1/26GK1769427SQ200510105989
公開日2006年5月10日 申請日期2005年10月8日 優先權日2005年10月8日
發明者緱仲軒, 邢新會, 韓冰, 吳昊, 王磊 申請人:清華大學