人溶菌酶的生產的製作方法
2023-05-27 06:20:31
專利名稱:人溶菌酶的生產的製作方法
本發明涉及生產人溶菌酶的DNA重組技術。更具體地說，本發明涉及人溶菌酶基因的表達、重組質粒、轉化細胞及其產物。
溶菌酶是一種較小的酶蛋白，分子量約為14，000。溶菌酶分布於活體組織中，人們認為它是作為防禦物質而起作用的，它通過溶解各種細菌而抵抗細菌感染。溶菌酶的功能可能是通過β-葡糖苷酶活性來溶解細菌細胞壁的多糖。雞蛋清中含有大量溶菌酶，因此從其中能夠比較容易地分離到高純度的溶菌酶。這樣的溶菌酶可為了防腐目的加到乾酪、香腸和海產品中，或用於將牛奶轉化成人的哺乳奶(Katsuya Hayashi和Taiji Imofo，《溶菌酶》，Nankodo，Japan，1974)。而且，溶菌酶作為醫療藥劑可用於止血、消炎、組織再生和抗腫瘤等(參見「Saikin-no-Shinyaku」(日本新藥)Vol.34.107，Yakuji Nippo，Tokyo，Japan，1983)，並且，它已經作為消炎酶藥劑上市了。
將來自雞蛋清的溶菌酶用於醫療目的時，通常導致過敏症狀如疹子和發紅等。這些現象一般稱為對外源蛋白免疫應答的副作用。為了克服上述弊病，本發明者開始了研究以建立一種大量生產人溶菌酶的方法。
人溶菌酶的胺基酸序列是已知的，它由130個胺基酸組成(「Biochemical Data Book」，1189，1979，日本生化學會主編)。以此胺基酸序列為基礎，化學合成了編碼人溶菌酶的DNA片段(Ikehara，M.等人，Chem.Pharm.Bull.，342202，1986)。
為了利用DNA重組技術生產人溶菌酶，Muraki等人試圖在大腸桿菌中進行表達，但用這種表達系統沒能得到活性人溶菌酶(Muraki，M等人，Agric.Biol.Chem.，50713，1986)。
已經發現，通過酵母的分泌作用得到了一種活性人溶菌酶(Jigami等人，《1986年日本農業化學學會概要》，P.343，1986)。但其產量非常低，只有600微克/升。根據Jigami等人的報導，在人溶菌酶的表達中，與編碼人溶菌酶的DNA片段相結合，使用了一種編碼信號肽的CDNA片段，此信號肽具有將所需蛋白分泌到細胞外的信息。作為編碼信號肽的CDNA片段，使用的是編碼雞蛋清溶菌酶信號肽的CDNA片段(天然型)(此信號肽的序列與Proc.Natl.Acad.Sci.USA，775759-5763，1980中公開的相同)。然而，進行了這樣的結合後，如上所述，從酵母細胞中分泌到胞外的溶菌酶數量仍然很少。
本發明者利用DNA重組技術對於活性人溶菌酶的大規模生產進行了詳盡的研究，研究結果是完成了本發明。
雖然，人溶菌酶基因目前還未被克隆，但已經確定了溶菌酶的胺基酸序列。因此，以此胺基酸序列為基礎，Ikehara等人已經化學合成了編碼人溶菌酶的DNA(Ikehara，M.等人，同上)。
因此，有可能利用此化學合成的DNA通過DNA重組技術大量生產人溶菌酶。
作為與編碼人溶菌酶的DNA片段一起使用的編碼信號肽的DNA片段，可以提及的有編碼下述結構式的信號肽的DNA片段M-R-S-F-L-L-L-A-L-C-F-L-P-L-A-A-L-G考慮到要在酵母中進行表達，因此，最好是利用酵母中高頻率使用的密碼製備編碼蛋清溶菌酶信號肽的DNA片段。使用這樣的DNA片段，發現能以增加的水平達到大量獲取人溶菌酶的預定目標。密碼子使用率已有過報導(J.Biol.Chem.，2573026-3031，1982)。優選的酵母密碼子的實例在下面以RNA密碼子的形式給出。
胺基酸 密碼子 胺基酸 密碼子 胺基酸 密碼子Ala GCU，GCC His CAC Tyr UACSer UCU，UCC Glu GAA Cys UGUThr ACU，ACC Gly GGU Asn AACVal GUU，GUC Gln CAA Pro CCAIle AUU，AUC Lys AAG Met AUGAsp GAC Leu UUG Trp UGGPhe UUC Arg AGA圖1給出了通過寡聚核苷酸的集中和連接合成人溶菌酶基因的方法的示意圖;
圖2表明人溶菌酶基因中TaqⅠ-XhoⅠ片段的DNA序列;
圖3表明信號肽的DNA序列;
圖4是構建人溶菌酶分泌質粒的示意圖;
根據Ikehara等人製備合成基因時，DNA序列的選擇要考慮到下述因素1)使用最適於酵母的且被認為適於合成基因表達的密碼子，2)造成一個限制性酶(此處是XbaⅠ)的專一性識別位點，它可作為克隆的標記使用，或有助於表達載體建成後的基因的再構建，3)避免在單鏈或雙鏈中的自我互補或互相互補的序列(適當組合者除外)。
人溶菌酶基因可以根據上述進行化學合成。
必須將合成基因插入適當的載體中，以通過再克服使它增殖。雖然，只要能插入此基因的任何載體都可使用，但這兒引用幾個具體的實例大腸桿菌載體pACYC 177、大腸桿菌-酵母穿梭載體pPH017、pGLD906和pGLD906-1(日本專利，未審查公開號為61-43991)、枯草桿菌(Bacillus Subtilis)載體pTEX201(Yoshimura，K.等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.，23250，1986)。
利用含有這樣得到的合成基因的載體轉化各種宿主生物。轉化本身的方法是眾所周知的，但如果使用大腸桿菌作為宿主生物，則根據Cohen等人的方法進行轉化(Cohen，S.N.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，692110，1972)，如果使用酵母作為宿主生物，則使用Hinnen等人的方法(Hinnen.A等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，751927，1978)，如果使用枯草桿菌作為宿主生物，則利用原生質體法(Chang，S.和Cohen，S.N.，Gen.Genet.，168111，1979)或感受態法(Dubnau，D.和Abelson，R.D.，J.Mol.Biol.，56209，1971)。作為宿主生物，可以使用的有例如大腸桿菌294、大腸桿菌W3110、大腸桿菌C600、啤酒酵母(Saccharomyces Cerevisiae)AH22R-、枯草桿菌1A1、枯草桿菌1A339和枯草桿菌1A340等。
然後，為了表達此基因，首先通過例如鹼性提取法(Birnboim，H.C.和Doly，J.，Nucleic Acids Res.，71513 1979)從轉化體中分離插入了基因的質粒DNA。通過用合適的限制性酶處理所得到的質粒DNA，可以將插入的基因切出來，並可通過瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯醯胺凝膠電泳進行分離。所有這些方法都是已知的並在文獻中有詳細記載(參見例如《分子克隆》，1982，冷泉港實驗室)。將分離的基因以正確定向連接到一個合適的表達載體中，使它位於啟動子和信號肽編碼區的下遊，從而建成一個表達質粒。
作為編碼信號肽的優選的DNA，可以提及的有根據酵母密碼本化學合成的DNA。雖然，化學合成DNA中的合適密碼子是酵母中最常用的密碼子，但製備限制性酶識別位點時可以使用較低頻率的密碼子。DNA的化學合成可以根據例如Crea等人的方法進行(Crea，R.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，755765，1978)。
如前所述，將編碼信號肽的DNA片段連在編碼人溶菌酶的DNA片段的5′，即可製得這樣一個DNA片段其中編碼信號肽的DNA段與編碼人溶菌酶的DNA段的5′端相連接。
DNA片段也可通過下述方法製備a)使編碼信號肽和人溶菌酶N-端部分的DNA段與編碼缺乏N-端部分的人溶菌酶的DNA段相連接，b)使編碼缺乏C-端部分的信號肽的DNA段與編碼信號肽的C-端部分和人溶菌酶的DNA段相連接，c)使編碼缺乏C-端部分的信號肽的DNA段、編碼信號肽C-端部分和人溶菌酶N-端部分的DNA段、以及編碼缺乏N-端部分的人溶菌酶的DNA段相連接。
有許多表達載體在本領域內是已知的，只要能用來表達此基因，則其中的任何一個都可使用。合適的表達載體的例子有pPHO17、pGLD906、pGLD906-1(同上)、pcDX(Okayama，H.和Berg，P.，Mol.Cell.Biol.，3280，1983)和pKSV-10(Pharmacia公司產品)。
作為啟動子，如果用酵母作為宿主，可以使用的有例如PHO5啟動子、GLD啟動子、PGK啟動子、ADH啟動子、PHO81啟動子。如果用動物細胞作為宿主，可以作為啟動子使用的有例如SV40早期基因啟動子、金屬硫蛋白(Metallothionein)啟動子及熱休克啟動子等。
使用促進劑也對表達起作用。
作為用於表達的宿主，可以提及的有酵母(如啤酒酵母)、鼠L細胞和中國倉鼠卵母細胞。但也可使用其它的真核細胞。
轉化酵母的方法前面已有過描述。轉化真核細胞(如動物細胞)的方法記載於下述文獻中，例如，蛋白、核酸和酶，28(1983)「重組DNA的導入細胞及表達」(Kyoritsu Shuppan)。
利用這樣得到的分泌質粒轉化宿主細胞，從而得到所需的轉化體。然後以任何已知方法培養轉化體。
用於酵母的培養基可以是例如Burkholder基本培養基(Bostian，K.L.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，774505，1980;Amer.J.Bot.，30206，1943)或它的修改培養基。培養一般可在15-40℃的溫度下進行10-96小時，較好是在24-37℃下培養24-72小時，如果需要則伴以通氣和/或攪動。
對於用真核細胞(如動物細胞)作為宿主的轉化體的培養，可以作為培養基使用的有Eagle培養基(H.Eagle，Science，130432，1959)、Dulbecoo改進的Eagle培養基(Orgad Larb和William J.Ritter，J.Biol.Chem.，2586043，1983)或類似的培養基等。培養一般可在30-42℃，較好是在35-37℃的溫度下進行大約1-10天。
完成培養以後，通過公知的方法分離細胞和上清液。為了收集殘留在細胞中的人溶菌酶，通過常規方法使細胞破碎，例如用超聲波或French加壓法進行破碎、進行機械破碎(如壓榨)和用溶解酶進行破碎等。如果有必要，可以用表面活性劑(如Triton-X100和脫氧膽酸鹽)對這樣製備的人溶菌酶進行進一步萃取。為了得到需要的人溶菌酶，通過常規的蛋白純化方法純化上清液中或這樣製備的萃取液中的人溶菌酶，這些方法包括鹽析、等電點沉澱、凝膠過濾、離子交換層析和高效液相層析(HPLC、FPLC等)等。
具有醫療活性如消炎、止血、組織再生和抗腫瘤等的人溶菌酶，可作為消炎酶藥劑用於洗眼劑中或作為防腐劑用於食品中。將人溶菌酶用於醫療目的時，它不會表現出使用雞蛋清溶菌酶時由於免疫應答導致的副作用。然而，迄今為止，人們只是以很小的數量得到人溶菌酶。
如上所述，本發明使得提供大量可作為藥物使用的人溶菌酶成為可能。對於通過分泌生產人溶菌酶來說，本發明的信號肽優於蛋清溶菌酶的信號肽。
實例下面，將通過參考實例和實例更為詳細地說明本發明。但是，這些實例不能認為是對本發明範圍的限制。
實例3中公開的啤酒酵母AH22R-/pGFL735已寄存於日本大阪發酵研究所(IFO，寄存號為IFO-10227)，並從1987年2月5日起，寄存於日本國際商業和工業部工業科技署的發酵研究所(FRI，寄存號為FERM P-9173)，該寄存物已轉換成根據布達佩斯條約的寄存物，並以FERM BP-1346的寄存號貯藏於FRI。
參考實例1 克隆載體pBR322X的構建使5微克大腸桿菌載體pBR322與1.5單位BalⅠ限制性酶在40微升反應緩衝液(10毫克分子/升Tris-Hcl pH7.5，10毫克分子/升MgCl2，1毫克分子/升二硫蘇糖醇)中於37℃下反應5小時，然後，用苯酚萃取反應混合物，並根據常規方法用乙醇沉澱DNA。在此DNA中加入50毫微克磷酸化的Xhol連接子d〔pCCTCGAGG〕(New England Biolabs產品)，並根據常規方法用T4DNA連接酶將它們互相連接起來。用此反應液轉化大腸桿菌DH1，並根據上述鹼性提取法從這樣得到的氨苄青黴素抗性和四環素抗性菌落中提取質粒，從而得到在BalⅠ位點處帶有XhoⅠ位點的質粒pBR322X。
參考實例2 在N-端附近帶有TaqⅠ位點的人溶菌酶基因片段的製備在Ikehara等人的報導(同上)中，人溶菌酶基因是通過示於表1中的52個寡聚核苷酸組製備的。
表1上鏈號碼 下鏈號碼U1 TCGAGATGAAGGTTT L26 TCGAGCTATTAAACU2 TTGAGAGATGCGAAT L25 ACCACAACCTTGAACU3 TAGCCAGAACTTTGAAG L24 GTATTGTCTGACATCU4 AGATTGGGTATGGAC L23 TCTATTTTGGCATCTU5 GGCTACCGTGGTATT L22 GTTTCTCCAAGCGACU6 TCTTTAGCCAACTGG L21 CCAGGCTCTAATACCCTGU7 ATGTGTCTTGCTAAG L20 TGGGTCACGGACAACU8 TGGGAATCCGGCTATAAC L19 TCTCTTAGCGCAGGCU9 ACTAGAGCTACCAAT L18 AACAGCATCAGCAATU10 TACAACGCTGGCGAC L17 GTTGTCCTGAAGCU11 CGTTCTACAGACTATGG L16 AAAGCTGAGCAAGATU12 TATTTTCCAAATTAACT L15 AAGTGACAGGCGTTGACU13 CTAGATATTGGTG L14 GGCACCTGGAGTCTTGCU14 TAACGATGGCAAGACTC L13 CATCGTTACACCAATATU15 GAGGTGCCGTCAACGCC L12 CTAGAGTTAATTTGGU16 TGTCACTTATCTTGC L11 AAAATACCATAGTCTGTU17 TCAGCTTTGCTTCAG L10 AGAACGGTCGCCAGCU18 GACAACATTGCTGAT L9 GTTGTAATTGGTAGC
U19 GCTGTTGCCTGCGCT L8 TCTAGTGTTATAGCCGU20 AAGAGAGTTGTCCGT L7 GATTCCCACTTAGCAAGU21 GACCCACAGGGTATT L6 ACACATCCAGTTGGCU22 AGAGCCTGGGTCGCT L5 TAAAGAAATACCACGU23 TGGAGAAACAGATGC L4 GTAGCCGTCCATACCU24 CAAAATAGAGATGTC L3 CAATCTCTTCAAAGTU25 AGACAATACGTTCAAGG L2 TCTGGCTAATTCGCATCU26 TTGTGGTGTTTAATAGC L1 TCTCAAAAACCTTCATC根據Ikehara等人的報導，合成稱為U2-taq的CGAGAGATGCGAAT和稱為L2-taq的TCTGGCTAATTCGCATCTCT以分別代替表1中的U2和L2。然後根據Ikehara等人的報導，用U2-taq、U3至U26、L2-taq、L3至L26等片段中的每一種形成寡聚核苷酸組的雜交體(圖1)。根據實例2記載的方法，將這些組中的每一種片段連接起來，然後使兩個5′端進行酶促磷酸化。
參考實例3 含有Taql位點的人溶菌酶基因片段的再克隆使2.6微克參考實例1中構建的質粒pBR322X與6單位限制性酶Xhol和6單位限制性酶ClaⅠ在35微升反應液(33毫克分子/升乙酸緩衝液pH7.9，66毫克分子/升乙酸鉀，10毫克分子/升乙酸鎂，0.5毫克分子/升二硫蘇糖醇，0.01%牛血清清蛋白(BSA)中於37℃下反應1小時，用苯酚去掉反應液中的蛋白並用冷乙醇進行沉澱。將此DNA(200毫微克)與100毫微克參考實例2中製備的人溶菌酶基因片段混合，並使之在10微升反應液(66毫克分子/升Tris-Hcl pH7.6，10毫克分子/升ATP，10毫克分子/升亞精胺，100毫克分子/升Mgcl2，150毫克分子/升DTT，2毫克/毫升BSA，5單位T4DNA連接酶)中於14℃下反應過夜，使它們相互連接起來。根據Cohem等人的方法用此反應液轉化大腸桿菌DH1。根據上述的鹼性提取法從這樣得到的轉化體中分離質粒。檢測其分子量和限制性酶切圖譜，從而得到了插入了人溶菌酶基因片段的pLYS22年。分離pLYS221中的EcoRⅠ-XhoⅠ片段並根據雙脫氧核苷酸鏈終止法測定其鹼基序列，其結果是得到了人溶菌酶基因的Taql-XhoⅠ片段，此片段與示於圖2中的假設片段完全一致。
此片段編碼人溶菌酶胺基酸序列的第4穀氨酸至第130纈氨酸。
實例1 編碼信號序列的DNA片段的製備用苯丙氨酸、亮氨酸和丙氨酸分別取代已知的蛋清溶菌酶信號肽胺基酸序列中的第四亮氨酸、第六異亮氨酸和第八纈氨酸(Jung，A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.，775759，1980)。為了得到高水平的表達，確定核苷酸序列時要進一步考慮下述因素(1)優先選擇酵母中高頻率使用的密碼子;
(2)為了增強表達，在ATG的上遊使用一個酵母PGK基因的序列;
(3)有可能構建雜交信號。
這樣合成的核苷酸序列示於圖3中。如圖所示，在含有溶菌酶編碼區的5′端有一個XhoⅠ位點，在3′端有一個TaqⅠ位點。完整序列由八個寡聚核苷酸組(＃1-＃8)組成，它們是通過磷醯胺法製備的(Caruthers，M.H.等人，Tetrahedron Letters，221859，1981)。
使核苷酸組＃2至＃7(每種10微升，含5微克)相互混合，在其中進一步加入10倍濃度的20微升激酶緩衝液(0.5克分子/升Tris-Hcl，0.1克分子/升Mgcl2，0.1克分子/升巰基乙醇，pH7.6)，20微升的10毫克分子/升ATP、20微升(50單位)的T4寡聚核苷酸激酶(Takara Shuzo Inc.產品)和80微升蒸餾水。然後使混合物於37℃下反應2小時，然後在65℃下處理20分鐘以終止反應。在反應混合物中加入核苷酸組＃1和＃8每種10微升(5微克)，並加入10微升T4連接酶(NEB Inc.產品)，使混合物於14℃下反應過夜。使得到的反應混合物在10%聚丙烯醯胺凝膠上電泳。從凝膠上切下76bp的片段，通過電洗脫將它從凝膠中提取出來。將它溶於45微升蒸餾水中，在其中加入6微升10倍濃度的激酶緩衝液(同上)、6微升10毫克分子/升ATP和2微升(5單位)T4寡聚核苷酸激酶(同上)。使混合物於37℃下反應1小時後保存在-20℃下。
在圖3中採用了胺基酸的單字母表達法(由IUPAC-IUB生物化學命名所確定的規則)。
例如A丙氨酸B天冬氨酸或天冬醯胺C半脫氨酸D天冬氨酸E穀氨酸
F苯丙氨酸G甘氨酸H組氨酸I異亮氨酸K賴氨酸L亮氨酸M蛋氨酸N天冬醯胺P脯氨酸O穀氨醯胺R精氨酸S絲氨酸T蘇氨酸V纈氨酸W色氨酸Y酪氨酸Z穀氨酸或穀氨醯胺X未知的或其它胺基酸實例2 分泌表達質粒的構建用120單位的EcoRⅠ(Nippon Gene Inc.產品)和120單位的XhoⅠ(Nippon Gene Inc.產品)於37℃下對參考實例3中得到的質粒pLYS221(236微克)處理2個小時，以切下人溶菌酶編碼區的片段。該片段進一步用26單位的TaqⅠ(Nippon Gene Inc.產品)於65℃下處理1小時，從而得到缺乏N-端部分的人溶菌酶編碼區的片段。
使大約1微克所得片段與0.5微克實例1中得到的編碼信號序列的DNA混合，使混合物在800單位T4連接酶(同上)的存在下於16℃下反應16小時，跟著用XhoⅠ(42單位)進行處理。
將這樣得到的XhoⅠ片段(10毫微克)與1毫微克用XhoⅠ處理酵母表達載體pGLD906-1(日本專利未審查，公開號61-43991)得到的DNA混合，使二者在T4連接酶存在下連接起來。
用與上述相同的方式用反應混合物轉化大腸桿菌DH1，從而得到許多含有GLD啟動子的質粒，在啟動子的下遊插入有信號序列編碼區和人溶菌酶基因，方向與啟動子的方向相同。這種質粒之一命名為pGFL735並用於下述試驗中(參見圖4)。
實例3 酵母轉化體的製備根據Hinnen等人的方法(同上)，用實例2中得到的質粒pGFL735轉化啤酒酵母AH22R-，從而得到轉化體啤酒酵母AH22R-/pGFL735。
實例4 轉化體的培養在一隻試管中倒入5毫升Burkholder修改培養基Ⅲ(Amer.J.Bot.，30206，1943;KH2PO40.44克/升，葡萄糖11克/升，天冬醯胺5.6克/升，蔗糖89克/升)，在其中接種啤酒酵母AH22R-/pGFL735轉化體，於30℃下搖床培養3天。將1毫升培養物轉移到含有4毫升同一培養基的另一試管中，在30℃下搖床培養1天。將2毫升培養物進一步轉移到含有18ml同樣的Burkholder修改培養基Ⅲ的200毫升培養瓶中，使混合物在30℃下搖床培養4天。培養期間，在24、50和72小時時取樣。
實例5 人溶菌酶產量的測定使實例4中得到的培養物離心，檢測所得上清液中的人溶菌酶。
根據《Worthigton Enzyme Manual》(P.100，Worthigton Biochemical Corporation，USA，1972)的方法測定人溶菌酶活性。用Sigma公司生產的人溶菌酶作為標準。「一個單位」定義為用Micrococcus Lysodeikticus(Sigma產品)作為底物，在0.1克分子/升磷酸緩衝液(pH6.2)中於25℃下反應1分鐘，使450nm的光吸收降低0.001所需的酶量。生成的人溶菌酶的數量如下人溶菌酶(毫克/升)培養時間 上清液24 0.850 3.272 5.2實例6 表達的人溶菌酶的純化和分離首先用與實例4所述相似的方法培養轉化體啤酒酵母AH22R-/pGFL735。
使得到的培養物(1.9升)離心，將這樣得到的上清液吸附在用50毫克分子/升磷酸鈉緩衝液(pH6.5)平衡的CM-Cellulose柱(φ1.6釐米×12.5釐米)上。用150毫升上述緩衝液洗滌柱子，然後用含有0.5克分子/升Nacl的上述緩衝液洗脫，則得到幾乎形成單峰的人溶菌酶。發現回收率大約為70%。
使上述得到的人溶菌酶進行HPLC以進一步純化。這樣，將0.25毫升含有0.2毫克人溶菌酶的洗脫液上到TSK凝膠ODS120T柱中。用水+0.1%三氟乙酸(TFA)洗滌後，通過在0.1%TFA中的含有0-100%CH3CN的梯度法進行洗脫，從而得到均一的人溶菌酶。
實例7 人溶菌酶的性質(1)分子量用2-巰基乙醇處理實例6中得到的蛋白，並使它進行SDS-聚丙烯醯胺凝膠(15%)電泳(180V，2小時)。考馬斯亮藍染色顯示出單一蛋白區帶。此帶表現出來的泳距和與之同時進行電泳的人溶菌酶樣品的非常相同。因此，認為此蛋白質的分子量為14.7kd，與人溶菌酶的分子量一致。
(2)氨基末端的胺基酸序列利用汽相蛋白質序列儀(Applied Biosystem Inc.生產，470型)使實例6中得到的蛋白進行自動Edman降解(J.Biol.Chem.，2567990，1981)，以分析其氨基末端的胺基酸序列。利用Micropack SPC 18-3柱，通過高效液相層析(Varian Inc.產品)對產生的乙內醯苯硫脲胺基酸(PTH-胺基酸)進行鑑別和定量分析，從而得到示於下表中的結果。因此，揭示出胺基酸序列為H-Lys-Val-Phe-Glu-Arg-X-Glu-Leu-Ala-Arg-(X未鑑別)。
循環 PTH-胺基酸(微微摩爾) (%)1 Lys 1071 57.42 Val 1176 63.03 Phe 1013 54.34 Glu 1043 55.95 Arg -＊-6 X＊＊- -7 Glu 1046 56.08 Leu 1106 59.29 Ala 1246 66.710 Arg -＊-＊未計算＊＊未鑑別(3)胺基酸組成將實例6中得到的蛋白置於一玻璃管中進行水解和真空乾燥。在試管中加入6當量濃度Hcl或含有4%巰基乙酸的6當量濃度Hcl並在真空下密封。水解在110℃下進行24小時。水解以後，在真空中去掉鹽酸，使殘餘物溶於0.02當量濃度Hcl中進行胺基酸分析。胺基酸分析值從兩種水解物得到的值取平均值。然而，對於色氨酸，採用用含有4%巰基乙酸的鹽酸進行水解得到的值。結果示於下表中。
胺基酸組成胺基酸 分析值 測定的＊ 理論的Asp 0.7475(微摩爾) 18 18Thr 0.2153 5.2 5Ser 0.2324 5.6 6Glu 0.3972 9.6 9Pro 0.0561 1.4 2Gly 0.4652 11.2 11Ala 0.5925 14.3 14Half Cys -＊＊- 8Val 0.3550 8.5 9Met 0.0823 2.0 2Ile 0.2025 4.9 5Leu 0.3415 8.2 8Tyr 0.2550 6.1 6Phe 0.0839 2.0 2Lys 0.2168 5.2 5His 0.0412 1.0 1Arg 0.5723 13.8 14Trp 0.2032 4.9 5＊以Asp的值為18計算＊＊未測定如上所述，實例中得到的人溶菌酶的胺基酸組成與人溶菌酶胺基酸組成的理論值非常一致。因此，實例中得到的人溶菌酶被認為是天然型的人溶菌酶。
勘誤表文件名稱 頁 行 補正前 補正後說明書 1 10 Imofo， Imoto，5 倒2 片段的5′ 片段的5′端11 8 pLYS22年。 pLYS221。
12 倒3 C半脫氨酸 C半胱氨酸15 10 使450nm 使450mμ17 倒3｝濃度Hcl 濃度HCl倒權利要求
1.一種DNA序列，其中一個編碼信號肽並具有下述結構M-R-S-F-L-L-L-A-L-C-F-L-P-L-A-A-L-G的DNA片段連接於編碼人溶菌酶DNA段的5′。
2.根據權利要求
1的DNA序列，其中編碼信號肽的DNA段具有示於圖3中的DNA序列。
3.根據權利要求
1的DNA序列，此序列是pGFL735。
4.一種用權利要求
1、2或3中的DNA片段轉化的細胞。
5.根據權利要求
4的細胞，此細胞是啤酒酵母AH22R-/pGFL735(FERM BP-1346)。
6.一種生產人溶菌酶的方法，其特徵在於該方法包括培養權利要求
4的細胞，在培養物中積累人溶菌酶並對它進行回收。
專利摘要
公開了一種DNA序列，其中編碼信號肽並具有下述結構 M-R-S-F-L-L-L-A-L-C-F-L-P-L-A-A-L-G的DNA段結合於編碼人溶菌酶的DNA段的5′端，還公開了一種用上述DNA序列轉化的細胞和生產人溶菌酶的方法，該方法包括培養上述在培養物中積累人溶菌酶的細胞並對人溶菌酶進行回收等。
上述技術使得大量生產可作為藥物使用的人溶菌酶成為可能。對於通過分泌生產人溶菌酶來說，本發明的信號肽優於雞蛋清溶菌酶的信號肽。
文檔編號A61K38/00GK87104540SQ87104540
公開日1988年2月24日 申請日期1987年6月30日
發明者菊池正和, 吉村浩二, 中濱一雄 申請人:武田藥品工業株式會社導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan