一種微量核酸檢測方法
2023-06-10 04:45:56 1
專利名稱：一種微量核酸檢測方法
技術領域：
本發明涉及核酸檢測方法，具體是一種微量核酸檢測方法。
背景技術：
近年來，DNA分析技術廣泛應用於醫學、法學、環境等諸多領域，成為科學研 究的一大重點。然而，用於分析的樣本DNA含量可能極其有限，少有遺損就可能導致無 法成功檢測或者沒有足夠的樣本DNA來滿足再次檢測的需要。因此如何對獲得的極其微 量的DNA樣本進行準確的定量，成為目前相關學科關注的熱點之一。因此開發一種經 濟、簡便、快速的檢測手段顯得十分重要與迫切。石英晶體微天平可以適時檢測DNA， 操作較為簡便快捷，但是缺點是檢測精度不高，無法達到臨床檢測的要求，從而限制了 它的推廣。如(l)Patolsky，F. ； Lichtenstein，A. ； Willner, LJ.Am.Chem.Soc.2001， 123，5194-5205 ； (2) Patolsky, F. ； Lichtenstein，A. ； Willner，LJ.Am.Chem.Soc.2000， 122, 418-419 ； (3) Bardea A ； Dagan A ； Ben—Dov I.A.Bardea，A.Dagan, I.Ben—Dov, B.Amitand I.Willner, Chem.Commun. (1998)，839-840，。國內學者利用多重置換擴增技術用於法醫學微量DNA檢測，陳玲，劉超，王慧 君，邱平明.Evidence Science，2008Vol.l6, No.6, 754-756。但是這種方法操作較為繁 瑣，同時需要知道原始DNA樣本的濃度，因此該方法在實際使用中受到了很大限制。還 有人學者，對微量DNA檢測也是採用PCR方法，但是他們採用乙醇沉澱法回收PCR中 的模版從而較少了微量DNA樣本的損失，該操作的缺點一是操作較為繁瑣費時，另外在 PCR過程和乙醇沉澱過程中模版DNA都會有損失，因此實際應用仍然受限。基於上述不足，本發明研究了新的微量核酸定量檢測方法，研究基於 UltraPowerDNA核酸染料與核酸結合螢光信號會增強800-1000倍的原理，可以方便的進 行微量DNA的檢測，而且檢測的DNA分子量範圍寬，更具實用性。同時引入了計算機 程序分析手段，不僅提高了解析度同時降低了誤差，最低可檢出12.5pg/yL核酸。
發明內容
本發明的目的在提供一種微量核酸檢測方法，以解決背景技術中的不足。一種微量核酸檢測方法，利用UltraPowerDNA核酸染料與核酸結合螢光信號會 增強800-1000倍的原理，採用了電腦程式進行分析最低可檢出12.5pg/μ L核酸，該方 法的具體步驟為(1)儀器安裝首先將UltraPower可見光凝膠透射儀置於水平桌面；使用時，直接把變壓器電 源插頭接變壓器插口，安裝完畢待用；(2)試驗操作將待測樣品準備好，同時準備已知濃度的標準品DNA，染料為自主研發的 UltraPower核酸染料(即用型)，具體操作步驟
A標準品的處理標準品的濃度並不十分固定，可根據需要進行調整，一般核 酸的終濃度在10-2000pg/y L的條件下，可以得到比較好的線性關係。因此可將標準品 用蒸餾水稀釋至濃度為1600，800，400，200，100，50，25pg/ μ L,同時以用於稀釋 標準品核酸的蒸餾水做空白對照；B在透明管內進行操作，如可以使用PCR管或八連管等。將標準品和樣品與 UltraPower核酸染料(即用型)等體積混勻(如5 μ L核酸溶液與5 μ L UltraPower 核酸 染料(即用型)混勻)此時標準品核酸的終濃度為800，400，200，100，50，25，12.5， Opg/ μ L,在室溫下避光放置30min，使UltraPower 核酸染料與待測DNA充分反應，反 應結束後將反應管放在透射儀的藍色顯色板上，將暗箱蓋好；(3) DNA 成像打開UltraPower可見光凝膠透射儀的電源，由於UltraPower核酸染料與待測 DNA反應後會發出螢光，通過暗箱上方的顯色片就可以清楚的觀測到發光的DNA樣品， 用數位相機拍照；(4) DNA樣品濃度分析拍照後，打開計算機，進入pgdetect程序，將上步中拍好的圖片導入pgdetect程
序，點擊檢測按鈕進行DNA濃度分析；
pgdetect程序界面主要有以下幾個部分組成
A添加控制點首先點擊添加控制點，對標準品進行設定，滑鼠點擊對應的標 在pgdetect的界面右上角的表格中的序號一列中會自動出現控制點序號即1，2， 5等，雙擊序號在濃度一欄中輸入相應的濃度； B刪除選中控制點對控制點進行刪除，首先選中要刪除的控制點，點擊此按
對控制點信息進行保存。點擊此按鈕，即可保存當前界面 點擊此按鈕，即可利用已經保存的控制點信息，對當前的 點擊此按鈕後，滑鼠點擊樣品點處，在程序左下角即會出
準品， 3，4，
鈕即可，C保存控制點信息. 的控制點信息。D讀取控制點信息 未知樣品進行定量檢測。E計算當前點濃度 現未知樣品濃度值。在本發明中，檢測的核酸鹼基數大於幾十bp，所用的檢測器為UltraPower可見
光凝膠透射儀。在本發明中，所述的成像系統主要由發射光源、濾光片和暗箱三部分組成，其 中光源由順序排列的多個發光二極體構成，濾光片由塑料材質的亞克力板構成，暗箱是 由特質材料製備的箱體和長波濾光片兩部分構成。在本發明中，所用的檢測染料為的UltraPower核酸染料。在本發明中，待測核酸的終濃度在10_2000pg/yL範圍內效果較好。在本發明中，核酸與UltraPower核酸染料的反應容器為透明的PCR管、八連管 等質地均勻的透明薄壁管。在本發明中，用於分析DNA濃度的電腦程式為pgdetect程序。本發明中，首先選擇一種DNA染料，該染料可需具備以下幾個特點，第一染料能和核酸樣品結合併發出螢光，第二該染料靈敏度必須非常高，即有微量的DNA與之結 合便可以發出能被有效檢測，第三染料最好對不同大小的DNA分子都有較好的結合效 果，然後必須找到一臺對應的儀器可以準確的檢測到DNA與核酸染料結合後發出的熒 光，並進行記錄。最後為了克服人眼的主觀性，保證檢測數據有更高的可信度，應該有 一套計算程序用於對DNA與核酸染料結合後發出的螢光信號進行分析。有益效果本發明極大的避免外部因素如鹽離子濃度、pH、DNA提取試劑殘留(如乙醇， 苯酚，氯仿等)的影響，尤其適用於對微量DNA的定量。
圖1 標準品 DNA 樣品的測定。I8OOpg/ μ 1，2 400pg/ μ 1，3 200pg lOOpg/μΙ, 5 50pg/yl, 6 25pg/yl, 7 12.5pg/yl, 8 空白對照。圖2未知濃度的DNA樣品的測定。1原液，2稀釋2倍，3稀釋4倍， 倍，5稀釋16倍，6稀釋32倍，7稀釋64倍，8空白對照。
具體實施例方式以下結合實施例對本發明所涉及納米焦磷酸氧鈦新型光催化材料的製備及其光 催化降解應用作進一步說明。實施例1 標準品DNA樣品的測定將10ug/ul的DNA標準品進行梯度稀釋，稀釋至濃度為1600，800，400， 200，100，50，25pg/yL。(1)取上述不同濃度的標準品DNA5ul於八連管中，每管中加入5ulUltraPower
核酸染料，用微量移液器混勻，避光放置30min。(2)將反應好的八連管放置於UltraPower可見光凝膠透射儀表面上，蓋好透射儀 的蓋子，打開電源進行觀察，用數位相機進行拍照。(3)打開計算機，進入pgdetect程序，將照片輸入計算機進行數據處理，用於未 知濃度的DNA樣品濃度的分析。實施例2未知微量DNA濃度的檢測取一根正常人的頭髮，從毛囊部分提取的DNA樣本，將樣品分別稀釋O、2、 4、8、16、32、64 倍。(1)取上述不同濃度的標準品DNA5ul於八連管中，每管中加入5ul UltraPower核
酸染料，用微量移液器混勻，避光放置30min。(2)將反應好的八連管放置於UltraPower可見光凝膠透射儀表面上，蓋好透射儀 的蓋子，打開電源進行觀察，用數位相機進行拍照。(3)打開計算機，進入pgdetect程序，將照片輸入計算機進行數據處理，根據標 準品DNA的濃度分析未知濃度的DNA樣品濃度。以上顯示和描述了本發明的基本原理和主要特徵和本發明的優點。本行業的
/μ ，2 4
4稀釋8技術人員應該了解，本發明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是 說明本發明的原理，在不脫離本發明精神和範圍的前提下，本發明還會有各種變化和改 進，這些變化和改進都落入要求保護的本發明範圍內。本發明要求保護範圍由所附的權 利要求書及其等效物界定。
權利要求
1.一種微量核酸檢測方法，其特徵在於該方法的步驟為(1)儀器安裝首先將UltraP0wer可見光凝膠透射儀置於水平桌面；使用時，直接把 變壓器電源插頭接變壓器插口，安裝完畢待用；(2)試驗操作將待測樣品準備好，同時準備已知濃度的標準品DNA，染料為自主 研發的UltraPower核酸染料(即用型)，具體操作步驟A標準品的處理標準品的濃度並不十分固定，可根據需要進行調整，一般核酸的 終濃度在10-2000pg/yL的條件下，可以得到比較好的線性關係，將標準品用蒸餾水稀 釋至濃度為1600，800，400，200，100，50，25pg/L，同時以用於稀釋標準品核酸的 蒸餾水做空白對照；B在透明管內進行操作，如可以使用PCR管或八連管，將標準品和樣品與UltraPower 核酸染料(即用型)等體積混勻(如5 μ L核酸溶液與5 μ LUltraPower 核酸染料(即用 型)混勻)此時標準品核酸的終濃度為800，400，200，100，50，25，12.5，Opg/ μ L, 在室溫下避光放置30min，使UltraPower 核酸染料與待測DNA充分反應，反應結束後 將反應管放在透射儀的藍色顯色板上，將暗箱蓋好；(3)DNA 成像打開UltraPower可見光凝膠透射儀的電源，由於UltraPower核酸染料與待測DNA反應後會發出螢光，通過暗箱上方的顯色片就可以清楚的觀測到發光的DNA樣品，用數碼 相機拍照；(4)DNA樣品濃度分析拍照後，打開計算機，進入pgdetect程序，將上步中拍好的 圖片導入pgdetect程序，點擊檢測按鈕進行DNA濃度分析；Pgdetect程序界面主要有以下幾個部分組成A添加控制點首先點擊添加控制點，對標準品進行設定，滑鼠點擊對應的標準 品，在pgdetect的界面右上角的表格中的序號一列中會自動出現控制點序號即1，2，3， 4，5等，雙擊序號在濃度一欄中輸入相應的濃度；B刪除選中控制點對控制點進行刪除，首先選中要刪除的控制點，點擊此按鈕即可，C保存控制點信息對控制點信息進行保存。點擊此按鈕，即可保存當前界面的控 制點信息；D讀取控制點信息點擊此按鈕，即可利用已經保存的控制點信息，對當前的未知 樣品進行定量檢測；E計算當前點濃度點擊此按鈕後，滑鼠點擊樣品點處，在程序左下角即會出現未 知樣品濃度值。
2.根據權利要求書1所述的一種微量核酸檢測方法，其特徵在於可以檢測的核酸 鹼基數大於十bp。
3.根據權利要求書1所述的一種微量核酸檢測方法，其特徵在於所用的檢測器為 UltraPower可見光凝膠透射儀。
4.根據權利要求書1所述的一種微量核酸檢測方法，其特徵在於所述成像系統主 要由發射光源、濾光片和暗箱三部分組成，其中光源由順序排列的多個發光二極體構 成，濾光片由塑料材質的亞克力板構成，所述暗箱是由特質材料製備的箱體和長波濾光片兩部分構成。
5.根據權利要求書1所述的一種微量核酸檢測方法，其特徵在於所用的檢測染料 為的UltraPower核酸染料。
6.根據權利要求書1所述的一種微量核酸檢測方法，其特徵在於待測核酸的終濃 度在10-2000pg/yL範圍內效果較好。
7.根據權利要求書1所述的一種微量核酸檢測方法，其特徵在於核酸與UltraPower 核酸染料的反應容器為透明的PCR管、八連管等質地均勻的透明薄壁管。
8.根據權利要求書1所述的一種微量核酸檢測方法，其特徵在於用於分析DNA濃 度的電腦程式為pgdetect程序。
全文摘要
一種微量核酸檢測方法，本方法利用UltraPower DNA核酸染料與核酸結合螢光信號會增強800-1000倍的原理，採用了電腦程式進行分析最低可檢出12.5pg/μL核酸。本發明極大的避免外部因素如鹽離子濃度、pH、DNA提取試劑殘留(如乙醇，苯酚，氯仿等)的影響，尤其適用於對微量DNA的定量。
文檔編號C12Q1/68GK102010893SQ20101011472
公開日2011年4月13日 申請日期2010年2月26日 優先權日2010年2月26日
發明者萬俊松, 周志圖, 胡勝標 申請人:萬俊松