蛭弧菌遊泳體作為除菌劑在清洗水果中的應用的製作方法

2023-06-09 17:18:56

專利名稱：蛭弧菌遊泳體作為除菌劑在清洗水果中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種蛭弧菌遊泳體的應用，特別是在消除水果表面及其加工環境中攜 帶的致病菌的應用。
背景技術：
近年來，與農產品相關的傳染病不斷發生，人們越來越關注農產品微生物安全問 題。爆發傳染病涉及的農產品大致有西瓜、漿果和未經高溫消毒的果汁等。常見的病原菌 有大腸桿菌、沙門氏菌、李斯特菌、A型肝炎病毒。因此，通過清洗殺菌技術，清除或殺滅果 蔬中的病原微生物，達到預防和控制由於食用水果引發的傳染病的目的。目前，水果的工業化清洗過程，主要是採用物理清洗和化學除菌劑配合的方式進 行，首先根據水果的不同類型選擇不同的清洗設備，比如DT5A1型清洗機、鼓風式清洗機、 XGJ-2型清洗機，主要原理是水果與清洗水之間的摩擦與相互作用，同時輔助於刷輥，將水 果表面汙物洗淨；其次選擇適合的清洗劑，現市場上銷售的清洗劑種類很多，有洗滌、去汙 作用的，有殺菌功能的，傳統的清洗方法對除去果蔬中的泥土效果雖好，但對微生物清除效 果不明顯。目前使用的水果除菌劑多為氯系除菌劑，但此類不僅不能殺滅水果表面存在致 病菌比如大腸桿菌0157:H7菌株、沙門氏菌、志賀菌、單核李斯特菌、金黃色葡萄球菌等而 且還會與食品中某些成份反應生成氯化物，對人體產生危害，清洗過後的廢水中含有由於 氯的殘留與水中有機物反應生成的三氯甲烷，不僅汙染水體、大氣，還對人體產生致癌作 用。因此開發一種新型的除菌劑作為水果的清洗方法保證水果加工的安全，是十分必 要的。蛭弧菌(Bdellovibrio)是由Stolp和Petzhold從菜豆葉燒病假單胞菌 ATCC11355中分離發現的一類以攻擊和裂解其它細菌來完成自身生長和繁殖的寄生菌。蛭 弧菌具有類似噬菌體的功能，它具有的廣泛的宿主範圍，對致病微生物較強的滅活能力以 及很少有抗蛭弧菌的細菌突變株的存在等，為利用蛭弧菌作為除菌劑清除致病菌提供了依 據，從而保證水果加工過程的安全性。蛭弧菌遊泳體是指蛭弧菌侵入宿主細菌前的生長形 式。蛭弧菌遊泳體侵入宿主細菌的過程非常快，一般幾秒鐘內即可完成。相對於蛭弧菌蛭 質體而言，雖然存在著製備繁瑣、不易保存的缺點，但用蛭弧菌遊泳體消除水果中致病菌具 有起效快、活力強的優點。這些優點使得蛭弧菌遊泳體同樣適合作為抑止或清除生物體及 其環境中致病菌的生物淨化因子，能在加工前，先進行致病菌的生物消除工作，又可以減少 或消除食物中毒的機率，降低藥物殘留的可能性，提高產品質量安全係數，保護消費者的健 康。已有的研究表明，作為一種有益微生物製劑，無論是在食品工業還是在(海洋)水 產養殖等領域，蛭弧菌的應用均是安全的。例如在國外，Lenz andHespell(1978)研究發 現，蛭弧菌及對動物及人的細胞不具侵染性[Lenz R.W. , Hespell R. B. Attempts to grow bedellovibrios micurgically-injected into animalcells. Archives ofMicrobiology,1978，119(3) :245-248]。在國內，林茂等(2006)研究了蛭弧菌對魚類細胞的作用，發現它 對魚類細菌沒有侵染作用[林茂，楊先樂，薛暉，曹海鵬，邱軍強。蛭弧菌BDH2102對魚類細 胞及病原菌的作用。微生物學通報，2006，33(1) :7-11]。

發明內容
本發明的目的在於克服現有技術存在的不足，提供一種蛭弧菌遊泳體在消除水果 表面及其加工環境中攜帶的致病菌的應用。為了達到上述目的，本發明的技術方案如下一種蛭弧菌，其特徵在於，該菌株為蛭弧菌(Bdellovibrio sp. )BDM01於2008年 4月28日保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCCNO :M208066。所述蛭弧菌BDM01(CCTCC M208066)由蛭弧菌 BDJ01 (CCTCCM208011)進行紫外 誘變得到，對其進行負染後於電子顯微鏡下形態觀察該蛭弧菌呈單細胞，弧形，大小為 1.7X1.0um,端生鞭毛，鞭毛長度為3. 5 y m ；將其以雙層平板法於28°C培養三天可形成直 徑3-4mm的透明圓形噬菌斑。蛭弧菌BDM01遊泳體作為除菌劑在清洗水果中的應用，將蛭弧菌遊泳體菌液作為 除菌劑添加在清洗用水中，然後對水果進行清洗。蛭弧菌BDM01遊泳體作為除菌劑在水果加工環境中的應用，將蛭弧菌遊泳體菌液 作為除菌劑噴灑在水果加工環境中，使蛭弧菌遊泳體的濃度至少達到10pfU/mL，使用量為 30-50mL/m2;水果加工環境包括水果的加工車間、清洗設備及水果的傳送帶及水果加工設備等。優選地，所述蛭弧菌遊泳體菌液在清洗用水中的濃度至少為10pfu/mL。所述的蛭弧菌遊泳體菌液優選通過申請號「200710031166. X」的發明專利公開的 高密度蛭弧菌遊泳體的發酵方法進行製備，具體步驟如下在含lOmLX 10lclcfu/mL嗜水氣單胞菌的100mL DNB培養基中，接入10mLX 103pfu/ mL蛭弧菌BDM01，恆溫搖床160rpm 250rpm、25 32 °C培養12 24h ；培養物經過 6000rpm、4°C離心20min，取上清液，再將上清液16000rpm、4°C條件下離心20min，棄上清 液，向沉澱中加入5mL DNB液體培養基重新懸浮蛭弧菌沉澱物，製得蛭弧菌遊泳體菌液。優選地，將蛭弧菌遊泳體菌液加入到清洗用水中，蛭弧菌遊泳體的濃度範圍為 101 109pfu/mL。優選地，所述清洗時先將水果放入蛭弧菌遊泳體菌液中浸泡20 40min，以消除 水果中的致病菌。所述致病菌為大腸桿菌(Escherichia coli)、沙門氏菌(Salmonella)、金黃色葡 萄球菌(staphylococcus aureus)、單核李其jf特菌(Listeriamonocytogenes)等。所述沙 門氏菌包括鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)和豬霍亂沙門氏菌(Salmonella cholerae-suis)。本發明相對於現有技術，具有如下的優點及效果(1)本發明蛭弧菌遊泳體作為除菌劑在消除水果攜帶的菌落總數、致病菌中效果 顯著，如圖1，2，致病菌的消除率可達到90%以上。(2)在加工或食用前用蛭弧菌消除水果表面致病菌安全性好。蛭弧菌消除水果攜帶的致病菌的方法是生物的方法，蛭弧菌可侵染、裂解宿主細菌的特性使之適合作為抑止 或清除生物體及其環境中致病菌的生物淨化因子，且其在裂解完宿主細菌後，會因飢餓而 自動消亡，因此對人和動物無毒副作用，也為水果的綠色加工生產提供保障。(3)蛭弧菌遊泳體消除水果中致病菌具有起效快、活力強的優點，因此蛭弧菌遊泳 體同樣適合作為抑制或清除生物體及其環境中致病菌的生物淨化因子。(4)本發明為消除水果所攜帶的食源性致病菌提供一種新的方法，並適合推廣應 用於水果的從農田到餐桌的整個產業鏈，特別有利於減少或消除化學藥物如除菌劑的殘 留，確保水果的優質，從根本上避免水果食物中毒事件的發生，保證消費者的健康。


圖1不同濃度蛭弧菌遊泳體作為除菌劑在消除青蘋果表面菌落總數的試驗效果 比較圖。圖2不同濃度蛭弧菌遊泳體作為除菌劑在消除青蘋果表面致病菌的試驗效果比 較圖。圖3不同濃度蛭弧菌遊泳體作為除菌劑在消除番石榴表面菌落總數的試驗效果 比較圖。圖4不同濃度蛭弧菌遊泳體作為除菌劑在消除番石榴表面致病菌的試驗效果比 較圖。圖5清洗用水中加入不同的除菌劑後殺菌效果比較。圖6101 pfu/mL蛭弧菌遊泳體對加工環境、加工與清洗設備的除菌效果。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明作進一步具體詳細描述，但本發明的實施方式不限 於此，對於未特別註明的工藝參數，可參照常規技術進行。所述方法對大腸桿菌、沙門氏菌、志賀菌、單核李斯特菌、金黃色葡萄球菌等致病 菌均有效，但為實驗結果及圖表數據表達清晰，致病菌以大腸桿菌、豬霍亂沙門氏菌、單核 李斯特菌、金黃色葡萄球菌為例。實施例1青蘋果表面常見致病菌的消除(1)消除青蘋果表面致病菌的蛭弧菌遊泳體的製備所述蛭弧菌BDM01由蛭弧菌BDJ01進行紫外誘變得到，對其進行負染後於電子顯 微鏡下形態觀察蛭弧菌BDM01呈單細胞，弧形，大小為1. 7 XL Oil m，端生鞭毛，鞭毛長度 為3. 5 y m ；將其以雙層平板法於28°C培養三天可形成直徑3_4mm的透明圓形噬菌斑。蛭弧菌遊泳體菌液通過申請號「200710031166. X」的國家發明專利申請公開的高 密度蛭弧菌遊泳體的發酵方法進行製備在1個裝有lOOmL NB(Nutrient broth)液體培 養基的錐形瓶中接種10mL 10lclcfu/mL嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila，購於廣東 省微生物所菌種保藏中心，編號GIM1. 172)，250rpm、30°C搖床培養24小時，培養液於4°C、 5000rpm離心15min，棄上清。沉澱菌體用5mL無菌水重新懸浮，之後加入到1個裝有100mL DNB液體培養基(營養肉湯0. 8g，酪蛋白酸水解物0. 5g，酵母精提物0. lg，NaCl 30g，溶於1000mL蒸餾水中，pH值為7. 2 7. 6)的錐形瓶中，再接入10mL濃度為103pfu/mL蛭弧菌 BDM01菌液，恆溫搖床250rpm、30°C培養24h。培養液於4°C 6000rpm離心20min，取上清液， 再將上清液分別於4°C 16000rpm離心20min，保留沉澱，然後用5mL DNB液體培養基懸浮蛭 弧菌遊泳體沉澱，得到菌液的濃度為1011 1012pfu/mL的蛭弧菌遊泳體菌液。(2)青蘋果攜帶的常見致病菌的製備於4瓶各含lOOmL普通營養肉湯培養基中，分別接種10mL X 1010cfu/mL大腸 桿菌(Escherichia coli，購於廣東省微生物研究所，編號GIM1. 137)、豬霍亂沙門氏菌 (Salmonella cholerae-suis，購於廣東省微生物研究所，編號GIM1. 244)、單核李斯特菌 (Listeria monocytogenes，購於廣東省微生物研究所，編號GIM1. 228)和金黃色葡萄球 菌(Staphylococcusaureus，購於廣東省微生物研究所，編號GIM1. 142)，搖床培養，160rpm 28°C，培養12-16h。增殖培養液經6000rpm、4°C離心20min，棄上清液，沉澱菌體用5mL無菌 PH7. 2的PBS (磷酸鹽緩衝溶液)懸浮，得到濃度為109cfu/ml的原液，最後製備上述四種菌 的混合液，使混合液中每種菌的終濃度為103cfu/ml。(3)蛭弧菌遊泳體應用消除加工前青蘋果攜帶的菌落總數及致病菌實驗分為實驗組和對照組。所有對照組和實驗組的青蘋果先經75%酒精殺菌後浸泡到步驟(2)製備好的混 合菌液中lmin，取出後浙幹，然後對照組取三個青蘋果，為三個平行樣，將青蘋果浸泡在自來水中，30min ；實驗組將青蘋果分五組浸泡在自來水中，自來水中分別添加蛭弧菌遊泳體A、B、 C、D、E，並且其濃度分別達到 lOipfu/mLUOYfu/mLUCfpfu/mLUOSpfu/mLUO'pfu/mL，浸泡 30min,每個濃度設三個平行樣。然後檢測菌落總數、致病菌的數目。檢測方法取青蘋果，放入無菌絞碎機中，同時加入50mL的無菌磷酸鹽緩衝液，攪 碎，青蘋果攪碎後取出10mL混合液放於無菌離心管中。根據GB4789. 2-2010菌落總數用營 養瓊脂培養基檢測、根據國標4789. 38-2008大腸桿菌用VRB_MUG(中性紅-膽鹽培養基) 培養基檢測、根據國標4789. 4-2010沙門氏菌用BS (亞硫酸鉍瓊脂)培養基檢測、根據國標 4789. 30-2010單核李斯特菌用李斯特氏菌顯色培養基檢測、根據國標4789. 10-2010金黃 色葡萄球菌用Baird-Parker瓊脂平板檢測。檢測結果如圖1，2所示蛭弧菌消除實驗組菌落總數與致病菌的殘留量要遠遠低於單純用自來水衝洗的 殘留量，而且蛭弧菌濃度越高，消除菌落總數與致病菌的效果越好，最低濃度lObfu/mL對 於致病菌的消除率已經達到90%，而且蛭弧菌在水果表面通過裂解而消除病原菌，不會對 水果的質量產生影響，也不會導致除菌劑在水果中的殘留。殺菌快速，高效，安全使得蛭弧 菌在消除水果攜帶的致病菌方面應用潛力廣大，將其作為一種水果的新型的清洗方法既能 達到殺菌的目的，也能保護水果製品的食用安全。實施例2番石榴表面常見致病菌的消除步驟(1)、⑵和(3)均同實施例1檢測結果如圖3、4所示蛭弧菌消除實驗組菌落總數與致病菌的殘留量要遠遠低於單純用自來水衝洗的殘留量，而且隨著蛭弧菌濃度提高，菌落總數與致病菌的殘留數越來越少，最低濃度 lObfu/mL對於致病菌的消除率已經達到90%，而且蛭弧菌在水果表面通過裂解而消除病 原菌，不會對水果的質量產生影響，也不會導致除菌劑在水果中的殘留。殺菌快速，高效，安 全使得蛭弧菌在消除水果攜帶的致病菌方面應用潛力廣大，將其作為一種水果的新型的清 洗方法既能達到殺菌的目的，也能保護水果製品的食用安全。實施例3新型除菌劑與傳統除菌劑除菌效果的比較步驟(1) (2)均同實施例1步驟(3)不同除菌劑對致病菌的消除試驗選用梨作為作用水果，分為實驗組與對照組。所有對照組和實驗組的梨先經75%酒精殺菌後浸泡到步驟(2)製備好的混合菌 液中lmin，取出後浙幹，然後採用不同除菌劑進行殺菌處理。對照組取三個梨，為三個平行樣，將梨浸泡在自來水中；實驗組分四組，每小組取三個梨，為三個平行樣(1)將梨浸泡在含有濃度為lObfu/mL菌液A的清洗用水；(2)將梨浸泡在加入過氧化氫的清洗用水，濃度達到5% ；(3)將梨浸泡在通入臭氧的清洗用水，濃度達到0. 8mg/L ；(4)將梨浸泡在加入次氯酸鈉的清洗用水，濃度達到80mg/L ；分別浸泡30min後取出浙幹，然後每30min檢測梨表面殘留的致病菌的總菌數。檢測結果如圖5所示最初的殺菌效果為過氧化氫 > 臭氧 > 次氯酸鈉> 蛭弧菌遊泳體，但是隨著時間的 延長，過氧化氫、臭氧、次氯酸鈉的殺菌效果逐漸減弱，致病菌又再次滋生，而蛭弧菌則持續 消除致病菌，分析得蛭弧菌製劑通過菌裂解消除致病菌需要一個過程，所以起效慢，但是較 為持久，可以預防致病菌的再次寄居和繁殖。同時由於過氧化氫的強氧化性有損水果的 品質，臭氧殺菌裝置耗費過大而次氯酸鈉則對熱不穩定且容易與有機物反應生成氯化物殘 留，因此蛭弧菌遊泳體可以成為理想的水果除菌劑，其通過裂解消除致病菌屬於生物防治， 使用安全不會對環境造成汙染，也不會對水果品質造成影響。實施例4蛭弧菌在消除水果的加工環境、清洗設備攜帶的常見致病菌的應用試驗試驗包括以下具體步驟及其條件步驟(1)及(2)均同實施例1步驟(3)致病菌的消除試驗採用本發明的應用方法，分成多個不同試驗組，對水果加工車間地面和牆體、運輸 水果的傳送帶及水果清洗設備的表面，均勻噴灑自來水和最低濃度10pfU/mL的蛭弧菌遊 泳體，噴灑使用量則按試驗組的不同分別為10mL/m2、30mL/m2、、50mL/m2、70mL/m2、或lOOmL/ m2，每天噴灑一次，連續噴灑兩天，在隨後的環境病菌檢測中，結果圖6所示，僅在噴灑量為 10mL/m2試驗組中檢測到少量的單核李斯特菌，其他噴灑量的試驗組沒有檢測到沙門氏菌， 單核李斯特菌，金黃色葡萄球菌及大腸桿菌等常見致病菌。本試用研究的結果表明蛭弧菌 在較低濃度消除水果加工過程中致病菌方面的效果十分顯著，同時考慮到清洗水果的成本，30-50mL/m2可以作為最適宜的噴灑範圍。由此可見，蛭弧菌作為除菌劑可以廣泛地推廣 應用於水果的清洗加工過程中。 上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實施例的 限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護範圍之內。
權利要求
蛭弧菌遊泳體作為除菌劑在清洗水果中的應用，其特徵在於，將蛭弧菌遊泳體菌液作為除菌劑添加在清洗用水中，然後對水果進行清洗；該菌株為蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDM01，由中國典型培養物保藏中心保藏，其簡稱為CCTCC，保藏編號為CCTCC NOM208066，保藏日期為2008年4月28日。
2.根據權利要求1所述的應用，其特徵在於，所述蛭弧菌遊泳體在清洗用水中的濃度 至少為10pfu/mL。
3.根據權利要求2所述的應用，其特徵在於，將蛭弧菌遊泳體菌液加入到清洗用水中， 所述蛭弧菌遊泳體的濃度範圍為101 109pfu/mL。
4.根據權利要求3所述的應用，其特徵在於，所述清洗時先將放入蛭弧菌遊泳體菌液 中浸泡20 40min。
5.根據權利要求1或2或3或4所述的應用，其特徵在於，所述蛭弧菌遊泳體菌液的制 備步驟如下在含10mL 10lclcfu/mL嗜水氣單胞菌的100mL DNB培養基中接入10mL103pfu/mL蛭弧菌 BDM01，恆溫搖床 160rpm 250rpm、25 32°C培養 36 48h，經過 6000rpm、4°C離心 20min， 取上清液，再將上清液16000rpm、4°C條件下離心20min，棄上清液，向沉澱中加入5mL DNB 液體培養基重新懸浮蛭弧菌沉澱物，製得蛭弧菌遊泳體菌液。
6.根據權利要求1所述的應用，其特徵在於，將蛭弧菌遊泳體菌液作為除菌劑噴灑在 水果加工環境中，使蛭弧菌遊泳體的濃度至少達到10pfu/mL，使用量為30-50mL/m2。
7.根據權利要求6所述的應用，其特徵在於，將蛭弧菌遊泳體菌液加入到清洗用水中， 所述蛭弧菌遊泳體的濃度範圍為101 109pfu/mL。
8.根據權利要求6或7所述的應用，其特徵在於，所述蛭弧菌遊泳體菌液的製備步驟如下在含10mL 10lclcfu/mL嗜水氣單胞菌的100mL DNB培養基中接入10mL103pfu/mL蛭弧菌 BDM01，恆溫搖床 160rpm 250rpm、25 32°C培養 36 48h，經過 6000rpm、4°C離心 20min， 取上清液，再將上清液16000rpm、4°C條件下離心20min，棄上清液，向沉澱中加入5mL DNB 液體培養基重新懸浮蛭弧菌沉澱物，製得蛭弧菌遊泳體菌液。
全文摘要
本發明公開了一種蛭弧菌遊泳體作為除菌劑在清洗水果中的應用，其特徵在於，該菌株為蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDM01於2008年4月28日保藏於中國典型培養物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC NOM208066；使用上述蛭弧菌遊泳體菌液作為除菌劑對水果及其加工環境進行清洗時，蛭弧菌遊泳體對水果表面的常見致病菌有很強的消除作用。利用遊泳體作為清洗劑對水果進行清洗，可以殺滅水果攜帶90％的致病菌。蛭弧菌遊泳體控制和消除水果致病菌具有起效快、活力強的優點可以為水果的綠色加工生產提供保障並且為控制和消除新鮮水果表面的致病菌提供了一種新方法。
文檔編號C12R1/01GK101978861SQ20101027078
公開日2011年2月23日 申請日期2010年8月31日 優先權日2010年8月31日
發明者蔡俊鵬, 鮑星 申請人:華南理工大學