哺乳動物細胞因子樣多肽－10的製作方法

2023-06-10 06:30:31

專利名稱：哺乳動物細胞因子樣多肽－10的製作方法
背景技術：
激素和多肽生長因子調控多細胞生物的細胞增殖和分化。這些可擴散分子使細胞相互交流並一齊作用以形成細胞和器官，及修復和再生損傷組織。激素和生長因子的例子包括類固醇激素(如雌激素、睪丸素)、甲狀旁腺激素、促卵泡激素、白細胞介素、血小板衍生生長因子(PDGF)、表皮生長因子(EGF)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、促紅細胞生成素(EPO)和降鈣素。
激素和生長因子通過結合蛋白質影響細胞代謝。蛋白質可以是與細胞內信號傳導途徑有關的整合膜蛋白，諸如第二信使系統。其它類的蛋白質是可溶性分子。
尤其令人感興趣的是細胞因子，即促進細胞增殖和／或分化的分子。細胞因子的例子包括促紅細胞生成素(EPO)，它刺激紅細胞的發育；血小板生成素(TPO)，它刺激巨核細胞譜系細胞的發育；及粒細胞集落刺激因子(G-CSF)，它刺激嗜中性粒細胞的發育。這些細胞因子有助於恢復貧血症病人或接受癌症化療病人體內正常的血細胞水平。這些細胞因子已經證實的體內活性說明了其它細胞因子、細胞因子興奮劑及細胞因子拮抗物的巨大臨床潛力和對它們的需求。
發明簡述本發明通過提供新多肽及相關組合物和方法來滿足此需求。一方面，本發明提供了編碼被稱為Zcyto10之哺乳動物四α-螺旋細胞因子的分離多核苷酸。人Zcyto10多肽包括如SEQ ID NO1和SEQ ID NO2中所示之帶起始甲硫氨酸的176個胺基酸的序列。現認為胺基酸殘基1-24是信號序列，包含第25位殘基(亮氨酸)至176位胺基酸殘基(穀氨酸)、由SEQ ID NO12所限定的胺基酸序列代表成熟Zcyto10多肽。本發明的另一實施方案由SEQ ID NO3和SEQ ID NO4的序列所限定。SEQ ID NO4的多肽包括151個胺基酸殘基，其中第1-24位胺基酸含信號序列，成熟序列包括也由SEQ ID NO13限定的第25位胺基酸殘基(亮氨酸)至第151位胺基酸(穀氨酸)。另一活性變體包括SEQ ID NO2中第33位胺基酸殘基(半胱氨酸)至第176位胺基酸殘基。該變體也由SEQ ID NO26限定。
小鼠Zcyto10也是包括如SEQ ID NO18和19所限定之176個胺基酸殘基的多肽。小鼠Zcyto10具有從SEQ ID NO19的第1位胺基酸殘基甲硫氨酸延伸至並包括第24位胺基酸殘基甘氨酸的信號序列。因而，成熟小鼠Zcyto10從SEQ ID NO19的第25位胺基酸殘基亮氨酸延伸至並包括第176位胺基酸殘基亮氨酸，也由SEQ ID NO20所限定。另一活性變體被認為自SEQ ID NO19的第33位胺基酸半胱氨酸延伸至第176位胺基酸。該變體也由SEQ ID NO25確定。在另外的實施方案中，該多肽進一步包括親和標誌。
SEQ ID NO33和34表示小鼠Zcyto10的一種變體。該變體為154個胺基酸殘基長，並具有從SEQ ID NO34第1位胺基酸殘基甲硫氨酸延伸至並包括第24位胺基酸殘基甘氨酸的信號序列。因而，成熟序列從SEQ ID NO34的第25位胺基酸殘基亮氨酸延伸至並包括第154位胺基酸殘基亮氨酸。成熟序列也用SEQ ID NO35表示。
本發明的第二方面提供了表達載體，其中含(a)轉錄啟動子；(b)編碼Zcyto10多肽的DNA區段，和(c)轉錄終止子，其中啟動子、DNA區段和終止子有效連接。
本發明的第三方面提供了已引入如上所述表達載體的人工培養真核或原核細胞，其中所說細胞表達該DNA區段所編碼的多肽。
本發明的進一步方面提供了基本上由通過肽鍵連接之第一部分和第二部分組成的嵌合多肽。該嵌合多肽的第一部分基本上由以下組成(a)如SEQ ID NO2中所示的Zcyto10多肽；(b)SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO12、SEQ ID NO13、SEQ ID NO19、SEQ ID NO20、SEQ ID NO25、SEQ ID NO26、SEQ ID NO34或SEQ ID NO35的等位變體；和(c)與(a)或(b)至少90％相同的蛋白質多肽。嵌合多肽的第二部分基本上由諸如親和標誌之類的另一多肽組成。某實施方案中，親和標誌是免疫球蛋白Fc多肽。本發明還提供編碼嵌合多肽的表達載體及被轉染以產生嵌合多肽的宿主細胞。
本發明的另一方面提供了能特異結合如上所公開Zcyto10多肽的抗體，以及能中和抗Zcyto10多肽抗體的抗獨特型抗體。
本發明的另一方面提供了含與藥用可接受載體聯合之純化Zcyto10多肽的藥物組合物。如本文所進一步論述的，在特徵在於不適當細胞增殖、細胞分化或細胞因子產生的紊亂的預防和治療中，這樣的組合物可有助於調節細胞增殖、細胞分化或細胞因子產生。更特異的是，Zcyto10多肽可通過抑制細胞免疫應答而有助於自身免疫疾病的預防和治療。可用Zcyto10治療的自身免疫疾病包括IDDM、多發性硬化症、類風溼性關節炎等等。同樣，本發明的Zcyto10多肽可有助於抑制癌細胞生長或增殖。
本發明的Zcyto10多肽還可刺激免疫系統以更好地抵禦微生物或病毒感染。尤其是，可系統性服用Zcyto10以提高個體的血小板產量。此外，本發明的Zcyto10多肽可用於氣管特異或氣管支氣管特異的應用中，諸如用於氣管支氣管上皮或其基底細胞的維持或傷口修復中，用於調節粘液產生或殘渣的粘纖毛清除中或用於哮喘、支氣管炎或氣管支氣管道其它疾病的治療中。它還可增強傷口癒合及促進受影響組織的再生，尤其有助於牙周疾病的治療。此外，Zcyto10多肽可用於治療皮膚病，大體上有諸如牛皮癬、溼疹和幹皮病。
本發明的另一實施方案涉及具Zcyto10多肽帶表位部分之胺基酸序列的肽或多肽，該Zcyto10多肽具有上述胺基酸序列。儘管長達並包括上述本發明多肽整個胺基酸序列的任何長度帶表位多肽也包括於本發明中，但具本發明Zcyto10多肽帶表位部分的胺基酸序列的肽或多肽包括具至少9個，優選至少15個，更優選至少30-50個胺基酸的多肽部分。還要求保護的是任何與另一多肽或載體分子融合的這些多肽。這樣的表位變體包括但不局限於SEQ ID NO25-32。自Zcyto10這些帶表位部分產生的抗體可用於從細胞培養基中純化Zcyto10。
參照以下詳述和附圖
，本發明的這些和其它方面將更加明顯。發明詳述此文所引用的所有參考文獻均全部引用作為參考。
在詳述本發明之前，定義以下術語有助於對其的理解術語「親和標記」在此用於指能附著到第二種多肽上以利於第二種多肽的純化和檢測或者為第二種多肽與底物的結合提供位點的多肽片段。原則上，可得到抗體或其它特異結合劑的任何肽或蛋白質都可用作親和標記。親和標記包括多聚組氨酸片段、蛋白A[Nilsson等人，EMBO J．41075(1985)；Nilsson等人，酶學方法，1983(1991)]、穀胱甘肽S轉移酶[Smith和Johnson，基因6731(1988)]、穀氨酸-穀氨酸親和標記[Grussenmeyer等人，美國國家科學院院報827952-4(1985)]、P物質、FlagTM肽[Hopp等人，生物技術學61204-1210(1988)]、鏈黴親和素結合肽、或其它抗原性表位或結合結構域。通常參閱Ford等人，蛋白質表達和純化295-107(1991)。編碼親和標記的DNA可從商品供應商處購得(如Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)。
術語「等位變體」在此用於指一個基因佔據相同染色體位點的兩種或多種變換形式中的任一種。等位變異是通過突變自然發生的，並可能導致種群內的表型多態性。基因突變可以是沉默的(所編碼多肽無變化)或編碼具有改變了的胺基酸序列的多肽。等位變體一詞在本文中也用於指由基因的等位變體編碼的蛋白質。
術語「氨基末端」和「羧基末端」在此用於表示多肽中的位置。在內容允許之處，這些術語用於表示參照某一多肽特定序列或部分的接近度或相對位置。例如，位於多肽中參照序列羧基端的某序列即是在參照序列羧基末端附近，但不必在完整多肽的羧基末端。
術語「互補物／反互補物對」表示在適當條件下形成非共價結合的穩定對的不相同部分。例如，生物素和抗生物素蛋白(或鏈黴親和素)是互補物／反互補物對的典型成員。其它例子的互補物／反互補物對包括受體／配體對、抗體／抗原(或半抗原或表位)對、有義／反義多核苷酸對，等等。在需要隨後解離的互補物／反互補物對中，優選互補物／反互補物對的結合親和力小於109M-1。
術語「多核苷酸分子的互補物」是具有與參照序列反向互補的鹼基序列的多核苷酸分子。例如，序列5′ATGCACGGG 3′與5′CCCGTGCAT3′是互補的。
術語「毗連序列」表示具有與另一多核苷酸相同或互補之鄰接序列的多核苷酸。鄰接序列被稱為與所給多核苷酸序列的一段全部或該多核苷酸部分「重疊」。例如，多核苷酸序列5′-ATGGCTTAGCTT-3′的代表性毗連序列是5′-TAGCTTgagtct-3′和3′-gtcgacTACCGA-5′。
術語「簡併核苷酸序列」表示包括一個或多個簡併密碼子(與編碼多肽的參照多核苷酸分子相比)的核苷酸序列。簡併密碼子包括不同的核苷酸三聯體，但編碼相同的胺基酸殘基(即，GAU和GAC三聯體均編碼天冬氨酸)。
術語「表達載體」用於表示含與用於轉錄的附加片段有效連接的目的多肽編碼片段的線性或環狀DNA分子。這些附加片段包括啟動子和終止子序列，還可包括一個或多個複製起點、一個或多個選擇標記、增強子、聚腺苷酸化信號，等等。表達載體通常來源於質粒或病毒DNA，或可能兩者的成分都包括。
術語「分離」當用於多核苷酸分子時，是指多核苷酸分子已從天然遺傳環境中脫離，並因此去掉了其它多餘的或不想要的編碼序列，處於一種適用於基因工程化蛋白生產系統的形式。這樣的分離分子是那些脫離其天然環境的分子，包括cDNA和基因組克隆。本發明的分離DNA分子無通常相關的其它基因，但可包括天然存在的5′和3′不翻譯區，諸如啟動子和終止子。相關區域的鑑定對本領域常規技術人員來說是明顯的[例如參閱，Dynan和Tijan，自然316774-78(1985)]。
「分離」的多肽或蛋白質是處於其天然環境之外的條件下的多肽和蛋白質，例如從血液和動物組織中分離的多肽或蛋白質。在優選的形式中，分離多肽基本上無其它多肽，尤其是動物來源的其它多肽。優選提供高純化形式的多肽，即純度超過95％，更優選純度超過99％。應用於本文中時，術語「分離的」不排除相同多肽以其它物理形式存在，如二聚體或者糖基化的或衍生的形式。
術語「有效連接」在指DNA片段時，表示片段被適當排列以使其功能與目的相一致，如轉錄起始於啟動子並貫穿編碼序列進行到終止子。
術語「正同系物(ortholog)」表示得自一個物種、為另一物種的多肽或蛋白質的功能對應物的多肽或蛋白質。正同系物之間的序列差異是物種形成的結果。
「副同系物(parolog)」是由一種生物體產生的相互區別但又結構相關的蛋白質。副同系物被認為是通過基因重複產生的。例如α-珠蛋白、β-珠蛋白和肌紅蛋白互為副同系物。
「多核苷酸」為從5′末端讀至3′末端的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸鹼基的單鏈或雙鏈多聚體。多核苷酸包括RNA和DNA，可分離自天然來源，可體外合成，或結合天然分子與合成分子而製成。多核苷酸的大小表示為鹼基對(縮寫「bp」)、核苷酸(「nt」)或千鹼基(「kb」)。只要內容允許，後兩個術語可描述單鏈或雙鏈的多核苷酸。當該術語用於指雙鏈分子時，表示的是全長，應理解為等同於術語「鹼基對」。本領域內技術人員將認識到雙鏈多核苷酸的兩條鏈長度可能稍有不同，其末端可能因酶切而成交錯切口狀；因而雙鏈多核苷酸分子中的所有核苷酸不一定配對。這些未配對的末端長度一般不超過20nt。
「多肽」是天然產生的或合成的以肽鍵連接的胺基酸殘基多聚體。不足約10個胺基酸殘基的多肽通常稱為「肽」。
術語「啟動子」在此用其本領域公認的含義，表示含有可結合RNA聚合酶並起始轉錄的DNA序列的基因部分。啟動子序列常發現位於基因的5′非編碼區，但並不總是這樣。
「蛋白質」是包含一條或多條多肽鏈的大分子。蛋白質也可含非肽成分，如糖基。糖和其它非肽取代基可由產生該蛋白質的細胞加在蛋白質上，且在不同細胞類型中各不相同。蛋白質在本文以其胺基酸骨架結構表示；取代基如糖基通常不特別指明，但仍可能存在。
術語「受體」表示可與生物活性分子(即配體)相結合併介導配體作用於細胞上的細胞相關蛋白。膜結合受體特徵在於有多結構域的結構，包括胞外配體結合結構域及一般涉及信號轉導的胞內效應子結構域。配體與受體結合導致了受體的構象轉變，從而引起效應子結構域與細胞中其它分子間的相互作用。這一相互作用依次導致細胞代謝的改變。與受體-配體相互作用有關聯的代謝活動包括基因轉錄、磷酸化、去磷酸化、環腺苷酸產量的提高、細胞鈣的轉移、膜脂的移動、細胞粘附、肌醇脂的水解和磷脂的水解。一般說來，受體可以是膜結合的、胞質的或核的；單體的(如促甲狀腺素受體、β-腎上腺素能受體)或多聚體的(如PDGF受體、生長激素受體、IL-3受體、GM-CSF受體、G-CSF受體、促紅細胞生成素受體和IL-6受體)。
術語「分泌信號序列」表示編碼多肽(「分泌肽」)的DNA序列，所述多肽作為一個更大多肽的組分，可指導該更大的多肽穿過合成它的細胞的分泌途徑。在通過分泌途徑轉運的過程中該更大的多肽通常被裂解以去除分泌肽。
術語「剪接變體」在此用於表示由基因轉錄出來的RNA的諸可互換形式。剪接變體一般通過利用轉錄RNA分子內(或較少情況下是分別轉錄的RNA分子之間)的可互換剪接位點而天然產生，並可導致由同一基因轉錄好幾種mRNA。剪接變體可編碼含不同胺基酸序列的多肽。術語剪接變體用在本文中還表示由基因轉錄出來的mRNA的剪接變體編碼的蛋白質。
用不精確的分析方法(如，凝膠電泳)測定的多聚體分子量和長度應理解為近似值。當該值表達為「大約」X或「近似」X時，所說的X值應理解為精確至±10％。
Zcyto10的螺旋D中的保守胺基酸可用作鑑別新家族成員的工具。螺旋D是最高度保守的，與IL-10的螺旋D具有約32％的相同性。例如，逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)可用於擴增編碼獲自種種組織來源或細胞系之RNA保守區(以上結構域、區域或基元)的序列。尤其是，設計自Zcyto10序列的高度簡併引物可用於此目的。
在本發明的優選實施方案中，分離的多核苷酸可在嚴謹條件下與SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO18、SEQ ID NO33或其互補序列的相似大小區域雜交。一般說來，嚴謹條件選擇為在確定的離子強度和pH下較該特異序列的熱熔點(Tm)低約5℃。Tm是50％靶序列與完全匹配探針雜交的溫度(在確定的離子強度和pH下)。一般的嚴謹條件是鹽濃度約0．02M或pH低於7及溫度至少約60℃。如前面所提及，本發明的分離多核苷酸包括DNA和RNA。用於分離DNA和RNA的方法在本領域是眾所周知的。用鹽酸胍提取隨後以氯化銫梯度離心分離可製備總RNA[Chirgwin等人，生物化學1852-94，(1979)]。poly(A)+RNA可用Aviv和Leder，美國國家科學院院報691408-1412(1972)的方法製備自總RNA。互補DNA(cDNA)可用已知方法製備自poly(A)+RNA。然後可用例如雜交或PCR鑑別和分離編碼Zcyto10多肽的多核苷酸。
此外，本發明的多核苷酸可用DNA合成儀合成。通常所選方法是亞磷醯胺方法。如果諸如基因或基因片段合成之類應用需要化學合成的雙鏈DNA，那麼分別製備各互補鏈。短基因(60-80bp)的生產在技術上是簡單的，可通過合成互補鏈然後將其退火而完成。然而，對於較長基因(＞300bp)的生產，必須實行特殊的策略，因為在DNA化學合成中各循環的偶聯效率很少能達到100％。為了克服這一問題，合成的基因(雙鏈)由長度為20-100個核苷酸的單鏈片段以模塊形式裝配成。參閱Glick，Bernard R．和Jack J．Pasternak，分子生物技術學，重組DNA的原理及應用(ASM出版社，華盛頓特區，1994)，Itakura，K等人，合成寡核苷酸的合成和用途，生物化學年鑑(Annu．Rev．Biochem．)53323-356(1984)，和Climie，S．等人，胸苷酸合成酶基因的化學合成，美國國家科學院院報87633-637(1990)。
本領域技術人員將認識到，公開於SEQ ID NO1，2，3和4中的序列代表了人的兩個等位基因，而SEQ ID NO18，19，33和34代表了小鼠的兩個等位基因。可按標準步驟探測來自不同個體的cDNA或基因組文庫而克隆這些序列的其它等位變體。可按標準步驟通過探測來自不同個體的cDNA或基因組文庫而克隆該序列的等位變體。SEQ IDNO1中所示DNA序列的等位變體，包括那些含沉默突變的變體及其中突變導致胺基酸序列改變的變體，均在本發明範圍內，作為SEQ IDNO2等位變體的蛋白質也一樣。產生自其它方式剪接mRNA的保留了Zcyto10多肽特性的cDNA，也包括於本發明範圍內，由這些cDNA和mRNA所編碼的多肽也一樣。按本領域已知標準步驟通過探測來自不同個體或組織的cDNA或基因組文庫，可克隆這些序列的等位變體和剪接變體。
本發明進一步提供了來自其它物種的相應蛋白質和多核苷酸(「物種正同系物」)。目前特別感興趣的是來自其它哺乳動物的Zcyto10多肽，包括鼠的、豬的、綿羊的、牛的、狗的、貓的、馬的及其它靈長類的Zcyto10多肽。可將本發明提供的信息和組合物與常規克隆技術聯合起來複製人Zcyto10蛋白質的物種正同系物。例如，可用獲自表達該蛋白質的組織或細胞類型的mRNA克隆cDNA。可用按本文公開序列設計的探針，通過探測Northern印跡鑑定mRNA的合適來源。隨後從陽性組織或細胞系的mRNA製備文庫。然後可用各種方法分離編碼蛋白質的cDNA，如用人或小鼠整個或部分cDNA進行探測，或用基於公開序列的一套或多套簡併探針進行探測。cDNA也可用聚合酶鏈式反應或PCR(Mullis等人，美國專利第4，683，202號)方法，使用按本文公開序列設計的引物進行克隆。在另外的方法中，可利用cDNA文庫轉化或轉染宿主細胞，並用該蛋白質的抗體檢測目的cDNA的表達。相似技術也可用於基因組克隆的分離上。正如使用和要求專利保護的，「編碼多肽的分離多核苷酸，所說的多核苷酸由SEQ ID NO2、4、12、13、19、20、25、26、34和35表示」這一措詞意指包括這些多肽的所有等位變體和物種正同系物。
本發明還提供了與SEQ ID NO2的蛋白質多肽和其物種正同系物基本相同的分離蛋白質多肽。「分離的」意指存在於其天然環境之外的條件下的蛋白質或多肽，如脫離自血液和動物組織。在一優選形式中，分離的多肽基本上無其它多肽，尤其是動物來源的其它多肽。優選提供的多肽是高度純化形式的，即純度高於95％，更優選純度超過99％。本文所用的「基本相同」一詞意指多肽與SEQ ID NO2、4、12、13、19、20、25、26、34和35所示序列或其物種正同系物有50％、優選60％、更優選至少80％相同。這樣的多肽優選與SEQ ID NO2或其物種正同系物有至少90％相同，最優選95％或更多相同。序列相同性百分率可用常規方法測定。參閱，例如，A1tschul等人，Bull．Math．Bio．48603-616(1986)和Henikoff和Henikoff，美國國家科學院院報8910915-10919(1992)。簡短地說，就是用缺口開放罰分為10、缺口延伸罰分為1及如表1所示(胺基酸用標準單字母符號表示)Henikoff和Henikoff(同上)的「blossom62」評分矩陣，將兩個胺基酸序列進行比對，以使比對評分最佳。相同性百分率計算如下 表1A RNDCQEGHILKMFPSTWYVA 4R -1 5N -2 06D -2 -216C 0 -3 -3 -39Q -1 100 -35E -1 002 -425G 0 -20 -1 -3 -2 -26H -2 01 -1 -300 -28I -1 -3 -3 -3 -1 -3 -3 -4 -34L -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -324K -1 20 -1 -311 -2 -1 -3． -25M -1 -1 -2 -3 -10 -2 -3 -212 -15F -2 -3 -3 -3 -2 -3 -3 -3 -100 -306P -1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -47S 1 -110 -1000 -1 -2 -20 -1 -2 -14T 0 -10 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -115W -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -11 -4 -3 -211Y -2 -2 -2 -3 -2 -1 -2 -32 -1 -1 -2 -13 -3 -2 -2 27V 0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -331 -21 -1 -2 -20-3 -14利用如上所公開的比率通過相似方法測定多核苷酸分子間的序列相同性。
變體Zcyto10多肽或基本相同的蛋白質和多肽特徵是具一個或多個胺基酸取代、刪除或添加。這些改變優選較小性質的改變，即保守胺基酸取代(見表2)和其它不會顯著影響蛋白質或多肽摺疊或活性的取代；小的刪除，一般約1-30個胺基酸的刪除；及小的氨基或羧基端延伸，諸如氨基端甲硫氨酸殘基、高達約20-25個殘基長的小連接肽，或利於純化的小延伸(親和標記)，諸如多聚組氨酸片段、蛋白A[Nilsson等人，EMBO J．41075(1985)；Nilsson等人，酶學方法，1983(1991)]、穀胱甘肽S轉移酶[Smith和Johnson，基因6731(1988)]，或其它抗原性表位或結合結構域。通常參閱Ford等人，蛋白質表達和純化295-107(1991)。編碼親和標記的DNA可購自商品供應商處(如，Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)。表2保守胺基酸取代鹼性的精氨酸賴氨酸組氨酸酸性的穀氨酸天冬氨酸極性的穀氨醯胺天冬醯胺疏水的亮氨酸異亮氨酸纈氨酸芳香族的 苯丙氨酸色氨酸酪氨酸小的 甘氨酸丙氨酸絲氨酸蘇氨酸甲硫氨酸本發明進一步提供了各種其它多肽融合體(及含一個或多個多肽融合體的相關多聚化蛋白質)。例如，可按美國專利第5，155，027和5，567，584號所公開的將Zcyto10多肽製備成與二聚化蛋白質的融合體。在該方面的優選二聚化蛋白質包括免疫球蛋白恆定區結構域。免疫球蛋白-Zcyto10多肽融合體可於基因工程化細胞中表達(以產生各種多聚體Zcyto10類似物)。可將輔助結構域融合至Zcyto10多肽上，以將它們定向於特異細胞、組織、或大分子(如膠原)。例如，通過將多肽與特異結合靶細胞表面受體之配體融合，可將Zcyto10多肽或蛋白質定向於預定細胞類型。以此方式，可將多肽和蛋白質定向用於治療或診斷目的。可將Zcyto10多肽與兩個或多個部分融合，諸如用於純化的親和標記和定向結構域。多肽融合體還可包括一個或多個切割位點，尤其是在結構域之間的切割位點。參閱，Tuan等人，結締組織研究(Connective Tissue Research)341-9(1996)。
本發明的蛋白質還可以包括非天然存在的胺基酸殘基。非天然存在的胺基酸包括不局限於反式-3-甲基脯氨酸、2，4-甲撐脯氨酸、順式-4-羥脯氨酸、反式-4-羥脯氨酸、N-甲基甘氨酸、別蘇氨酸、甲基蘇氨酸、羥乙基半胱氨酸、羥乙基高半胱氨酸、硝基穀氨醯胺、高穀氨醯胺、六氫吡啶羧酸、噻唑烷羧酸、脫氫脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸、3，3-二甲基脯氨酸、叔亮氨酸、正纈氨酸、2-氮雜苯丙氨酸(2-azaphenylalanine)、3-氮雜苯丙氨酸、4-氮雜苯丙氨酸和4-氟苯丙氨酸。本領域已知幾種方法可用於將非天然存在胺基酸殘基摻入蛋白質。例如，可利用一個體外系統，其中無義突變均用化學氨醯化抑制子tRNA進行抑制。合成胺基酸和氨醯tRNA的方法為本領域內已知。
本發明多肽中的必需胺基酸可按本領域內已知的方法，如定點誘變或丙氨酸掃描誘變進行鑑定[Cunningham和Wells，科學2441081-1085(1989)；Bass等人，美國國家科學院院報884498-4502(1991)]。在後一技術中，於分子中的每個殘基處導入單個丙氨酸突變，檢驗所得突變分子的生物學活性(如配基結合和信號轉導)以鑑定對分子活性比較關鍵的胺基酸殘基。也可通過對諸如核磁共振、晶體學技術或光親和標記之類的技術確定的晶體結構進行分析而測定配體-蛋白質相互作用的位點。參閱，例如，de Vos等人，科學255306-312(1992)；Smith等，分子生物學雜誌224899-904(1992)；Wlodaver等，FEBS Lett．30959-64(1992)。必需胺基酸也可從與相關蛋白質的同源性分析推斷出。
可用已知誘變和篩選方法製備並檢驗多重胺基酸取代，如Reidhaar-Olson和Sauer所公開的方法(科學24153-57，1988)或Bowie和Sauer所公開的方法(美國國家科學院院報862152-2156，1989)。簡單地說，這些作者公開的方法是同時使多肽中的兩個或多個位置隨機化，選擇功能性多肽，然後測序經誘變的多肽以確定每個位置處的容許取代範圍。其它可用的方法包括噬菌體展示(如Lowman等，生物化學3010832-10837(1991)；Ladner等，美國專利號5，223，409；Huse，WIPO公開WO92／06204)和區域定向誘變(Derbyshire等，基因46145，1986；Ner等，DNA7127，1988)。
如上所公開的誘變方法可結合高容量篩選方法以檢測宿主細胞中克隆的誘變蛋白質的活性。在這一點上優選的試驗包括細胞增殖試驗和基於生物傳感器的配體結合試驗，以下對這些試驗有描述。編碼活性蛋白或其部分(如配體結合片段)的誘變DNA分子可從宿主細胞中回收並用現代裝置迅速測序。這些方法可快速測定目的多肽中各胺基酸殘基的重要性，並可適用於未知結構的多肽。
用上述方法，本領域常規技術人員能製備與SEQ ID NO2、4、12、13、19、20、25、26、34和35或其等位變體基本相同並保留野生型蛋白質特性的種種多肽。正如本文所表達和聲稱的，「SEQ ID NO2表示的多肽」包括該多肽的所有等位變體和物種正同系物。
本發明的蛋白多肽，包括全長蛋白質、蛋白質片段(如配體結合片段)及融合多肽均可按常規技術在基因工程化宿主細胞中生產。合適的宿主細胞是那些能被外源DNA轉化或轉染並能培養生長的細胞類型，包括細菌、真菌細胞及培養的高等真核細胞。優選真核細胞，尤其是多細胞生物的培養細胞。操作克隆DNA分子和將外源DNA引入各種宿主細胞的技術公開於以下文獻中Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊，第二版(冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約，1989)，及Ausubel等人，同上。
本發明的多核苷酸，通常為cDNA序列，編碼上述多肽。編碼本發明多肽的DNA序列由一系列密碼子組成，多肽的每一胺基酸殘基均由密碼子編碼，每個密碼子由3個核苷酸組成。胺基酸殘基由如下相應密碼子編碼。
丙氨酸(Ala)由GCA、GCC、GCG或GCT編碼；半胱氨酸(Cys)由TGC或TGT編碼；天冬氨酸(Asp)由GAC或GAT編碼；穀氨酸(Glu)由GAA或GAG編碼；苯丙氨酸(Phe)由TTC或TTT編碼；甘氨酸(Gly)由GGA、GGC、GGG或GGT編碼；組氨酸(His)由CAC或CAT編碼；異亮氨酸由ATA、ATC或ATT編碼；賴氨酸(Lys)由AAA或AAG編碼；亮氨酸(Leu)由TTA、TTG、CTA、CTC、CTG或CTT編碼；甲硫氨酸(Met)由ATG編碼；天冬醯胺(Asn)由AAC或AAT編碼；脯氨酸(Pro)由CCA、CCC、CCG或CCT編碼；穀氨醯胺(Gln)由CAA或CAG編碼；精氨酸(Arg)由AGA、AGG、CGA、CGC、CGG或CGT編碼；絲氨酸(Ser)由AGC、AGT、TCA、TCC、TCG或TCT編碼；蘇氨酸(Thr)由ACA、ACC、ACG或ACT編碼；纈氨酸(Val)由GTA、GTC、GTG或GTT編碼；色氨酸(Trp)由TGG編碼；及酪氨酸(Tyr)由TAC或TAT編碼。
根據本發明可以認識到，當cDNA如上所述要求專利保護時，應理解為要求專利保護的是有義鏈、反義鏈及有義和反義鏈通過各自氫鍵一起退火形成的雙鏈DNA。要求專利保護的還有編碼本發明多肽的信使RNA(mRNA)及由上述cDNA所編碼的mRNA。信使RNA(mRNA)用與上文指示的相同密碼子編碼多肽，只是每個胸苷(T)均被尿苷(U)所取代。
通常，在表達載體中，編碼Zcyto7多肽的DNA序列與其表達所需的其它遺傳元件有效連接，所述元件一般包括轉錄啟動子和終止子。儘管本領域技術人員會認為在某些系統中選擇標記可提供於分離載體上，且外源DNA的複製可通過整合進入宿主細胞基因組而提供，但載體通常還包含一個或多個選擇標記及一個或多個複製起點。啟動子、終止子、選擇標記、載體及其它元件的選擇是在本領域普通技術人員水平之內的常規設計問題。許多這些元件在文獻中都有描述，並可購自商品供應商處。
為了指導Zcyto10多肽進入宿主細胞的分泌途徑，可在表達載體中提供分泌信號序列(也稱前導序列、前原序列或前序列)。分泌信號序列可以是該蛋白質本身的，或可來自另一分泌蛋白質(如t-PA)或從頭合成。分泌信號序列以正確閱讀框架與Zcyto10 DNA序列連接。儘管某些信號序列可位於目的DNA序列中的其它位置(參閱，如Welch等人，美國專利第5，037，743；Holland等人，美國專利第5，143，830)，但分泌信號序列通常位於編碼目的多肽之DNA序列的5′端。
將外源DNA引入哺乳類宿主細胞的方法包括磷酸鈣介導的轉染[Wigler等人，細胞14725(1978)；Corsaro和Pearson，體細胞遺傳學7603，1981；Graham和Van der Eb，病毒學52456(1973)]，電穿孔[Neumann等人，EMBO J．1841-845(1982)]，DEAE-葡聚糖介導的轉染[Ausubel等人編，分子生物學通用手冊(John Wiley和Sons，Inc．，NY，1987)]，及脂質體介導的轉染[Hawley-Nelson等人，Focus 1573(1993)；Ciccarone等人，Focus 1580(1993)]。培養的哺乳類細胞中重組多肽的生產公開於如下文獻中Levinson等人，美國專利第4，713，339號；Hagen等人，美國專利號4，784，950；Palmiter等人，美國專利號4，579，821；及Ringold，美國專利號4，656，134。合適的培養哺乳類細胞包括COS-1(ATCC NO．CRL1650)、COS-7(ATCC NO．CRL1651)、BHK(ATCC NO．CRL1632)、BHK570(ATCC NO．CRL10314)、293[ATCC NO．CRL1573；Graham等人，普通病毒學雜誌(J．Gen．Virol)3659-72(1977)]和中國倉鼠卵巢細胞(如CHO-Kl；ATCC NO．CCL61)細胞系。另外的合適細胞系在本領域中是已知的，並可獲自公共保藏單位，如美國典型培養物保藏中心，洛克菲勒，馬裡蘭州。一般說來，優選強轉錄啟動子，如來自SV-40或巨細胞病毒的啟動子。參閱如，美國專利號4，956，288。其它合適啟動子包括來自金屬硫蛋白基因的啟動子(美國專利號4，579，821和4，601 978)和腺病毒主要晚期啟動子。
通常利用藥物選擇來選出已插入外源DNA的培養哺乳類細胞。這些細胞通常稱為「轉染子」。已在有選擇劑存在的條件下培養並能將目的基因傳給子代的細胞稱為「穩定的轉染子」。優選的選擇標記是編碼對抗生素新黴素的抗性的基因。選擇在新黴素型藥物(如G418等等)存在的條件下進行。選擇系統也可用於提高目的基因的表達水平，此過程稱為「擴增」。擴增通過如下過程進行在低水平選擇劑存在的條件下培養轉染子，然後增加選擇劑的量以選擇出產生高水平引入基因之產物的細胞。優選的可擴增選擇標記是二氫葉酸還原酶，它賦予對氨甲蝶呤的抗性。其它的藥物抗性基因(如潮黴素抗性、廣譜抗藥性、嘌呤黴素乙醯轉移酶)也可使用。導入改變表型的其它標記，如綠色螢光蛋白，或細胞表面蛋白(如CD4、CD8、MHC Ⅰ類分子)，胎盤鹼性磷酸酶均可用來通過FACS分選術或磁珠分離技術之類的方法從未轉染細胞中選出轉染細胞。
其它高等真核細胞也可用作宿主，包括昆蟲細胞、植物細胞和禽細胞。昆蟲細胞的轉化及其中外源多肽的生產已公開於Guarino等人的美國專利第5，162，222、Bang等人的美國專利第4，775，624和WIPO公開WO94／06463中。用髮根農桿菌作載體在植物細胞中表達基因已由Sinkar等人作了回顧[生物科學雜誌(J．Biosci．)(Bangalore)1147-58(1987)]。昆蟲細胞可用杆狀病毒重組體[通常衍生自苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)]感染。見King，L．A．和Possee，R．D．，杆狀病毒表達系統實驗室指南(Chapman＆Hall，倫敦)；O′Reilly，D．R．等人，杆狀病毒表達載體實驗室手冊(牛津大學出版社，紐約，1994)；以及Richardson，C．D．編輯，杆狀病毒表達方案，分子生物學方法(Humana出版社，Totowa，NJ，1995)。第二種製備重組Zcyto10桿狀病毒的方法應用了基於轉座子的系統，該系統綜述於Luckow，V．A．，等人，病毒學雜誌674566-79，1993中。這一應用了轉移載體的系統在Bac-to-BacTM試劑盒(LifeTechnologies，Rockville，MD)中有售。此系統利用含Tn7轉座子的轉移載體pFastBaclTM(Life Technologies)以將編碼Zcyto10多肽的DNA轉移入作為被稱為「杆粒」的大質粒保持於大腸桿菌中的杆狀病毒基因組中。見Hill-Perkins，M．S．和Possee，R．D．，普通病毒學雜誌71971-6，(1990)；Bonning，B．C．等人，普通病毒學雜誌751551-6(1994)；以及Chazenbalk，G．D．和Rapoport，B．，生物化學雜誌2701543-9(1995)。此外，轉移載體可包含在所表達Zcyto10多肽的C-或N-末端融合了表位標記(如Glu-Glu表位標記)的編碼DNA的框內融合體[Grussenmeyer，T．等人，美國國家科學院院報827952-4(1985)]。用本領域已知技術可將含Zcyto10的轉移載體轉化進入大腸桿菌，並篩選出含有指示為重組杆狀病毒的間斷LacZ基因的杆粒。用常規技術分離含重組杆狀病毒基因組的杆粒DNA並用於轉染草地夜蛾細胞(如Sf9細胞)。表達Zcyto10的重組病毒即可產生。用本領域常用方法製備重組病毒原種。
重組病毒可用於感染宿主細胞，通常是衍生自秋粘蟲(草地夜蛾)的細胞系。總見，Glick和Pasternak，分子生物技術學重組DNA的原理和應用，ASM出版社，華盛頓特區(1994)。另一合適細胞系是衍生自粉紋夜蛾的High Five OTM細胞系(Invitrogen)(美國專利號5，300，435)。生產商提供的無血清培養基可用於培養和維持細胞。合適的培養基對於Sf9細胞是Sf900 ⅡTM(Life Technologies)或ESF 921TM(Expression Systems)；對於粉紋夜蛾細胞是Ex-Cell0405TM(JRH Biosciences，Lenexa，KS)或Express Five OTM(LifeTechnologies)。細胞從約為2-5×105個細胞的接種密度生長至1-2×106個細胞密度時，以0．1至10(更通常為近3)的感染複數(MOI)加入重組病毒原種。所用程序常描述於實驗室手冊中(King，L．A．和Possee，R．D．，同上；O′Reilly，D．R．等，同上；Richardson，C．D．，同上)。隨後可用本文所述方法從上清中純化出Zcyto10多肽。
真菌細胞，包括酵母細胞，尤其是酵母屬的細胞也可用於本發明中，如用於生產蛋白質片段或融合多肽。用外源DNA轉化酵母細胞並從中產生重組多肽的方法公開於下述文件，例如，Kawasaki，美國專利號4，599，311；Kawasaki等，美國專利號4，931，373；Brake，美國專利號4，870，008；Welch等，美國專利號5，037，743；和Murray等，美國專利號4，845，075。通過由選擇標記確定的表型，通常是藥物抗性或在缺乏某種特殊養分(如亮氨酸)的條件下生長的能力，來選擇出轉化細胞。用於酵母中的優選載體系統是POT1載體系統，公開於Kawasaki等人的美國專利第4，931，373中，該系統可通過在含葡萄糖的培養基上生長而選擇出轉化細胞。用於酵母中的合適啟動子和終止子包括來自糖酵解基因(見，如，Kawasaki，美國專利號4，599，311；Kingsman等人，美國專利號4，615，974；和Bitter，美國專利號4，977，092)和乙醇脫氫酶基因的啟動子和終止子。也可參閱美國專利第4，990，446號；第5，063，154號；第5，139，936號和第4，661，454號。本領域已知用於其它酵母的轉化系統，所述酵母包括多形漢遜酵母、粟酒裂殖酵母、乳酸克魯維酵母、脆壁克魯維酵母、玉蜀黍黑粉菌、巴斯德畢赤酵母、甲醇畢赤酵母(Pichiamethanolica)、季也蒙畢赤酵母和麥芽糖假絲酵母(Candidamaltosa)。參閱，如Gleeson等，普通微生物學雜誌1323459-3465(1986)和Cregg，美國專利第4，882，279號。可根據McKnight等的美國專利第4，935，349號的方法利用麴黴屬細胞。轉化產黃枝頂孢(Acremonium chrysogenum)的方法公開於Sumino等人的美國專利第5，162，228號中。轉化脈孢菌屬的方法公開於Lambowitz的美國專利第4，486，533號。
用甲醇畢赤酵母作為宿主生產重組蛋白質的方法描述於WIPO公開WO97／17450、WO97／17451、WO98／02536、和WO98／02565中。用於轉化甲醇畢赤酵母的DNA分子將通常製成雙鏈環狀質粒，優選在轉化之前先線性化。為了在甲醇畢赤酵母中生產多肽，優選質粒中的啟動子和終止子為甲醇畢赤酵母內基因，如甲醇半赤酵母醇利用基因(AUG1或AUG2)的啟動子和終止子。其它有用的啟動子包括二羥基丙酮合成酶(DHAS)基因，甲酸脫氫酶(FMD)基因和過氧化氫酶(CAT)基因的啟動子。為了便於DNA整合入宿主染色體，優選質粒的整個表達片段兩側均為宿主DNA序列。優選用於甲醇畢赤酵母的選擇標記為甲醇畢赤酵母ADE2基因，它編碼磷酸核糖基-5-氨基咪唑羧化酶(AIRC；EC4．1．1．21)，此酶可使得ade2宿主細胞在缺乏腺嘌呤時生長。為了進行希望少用甲醇的大批量工業化生產，優選用其中兩個甲醇利用基因(AUG1和AUG2)均缺失的宿主細胞。為了生產分泌型蛋白質，優選液泡蛋白酶基因(PEP4和PRB1)有缺陷的宿主細胞。可利用電穿孔促進含目的多肽編碼DNA的質粒引入甲醇畢赤酵母細胞。優選用電穿孔方法轉化甲醇畢赤酵母細胞，所用電場為指數級衰減的脈衝電場，電場強度為2．5-4．5kV／cm，優選約為3．75kV／cm，時間常數(τ)為1-40毫秒，最優選約20毫秒。
原核宿主細胞，包括大腸桿菌、芽孢桿菌屬及其它屬的菌株也可用作本發明的宿主細胞。轉化這些宿主並表達克隆其中的外源DNA的技術為本領域內眾所周知(見，如，Sambrook等，同上)。當在諸如大腸桿菌之類的細菌中表達Zcyto10多肽時，該多肽可保留在細胞質中(通常為不溶顆粒)，或可由細菌分泌序列引導至周質空間中。在前一種情況中，將細胞裂解，回收顆粒並用如異硫氰酸胍或尿素變性。然後可通過稀釋變性劑，如對尿素溶液透析，和結合使用還原型和氧化型穀胱甘肽，再對緩衝鹽溶液透析，使變性多肽重新折迭和二聚化。在後一種情況中，多肽可從周質間隙中以可溶性有功能形式回收，即通過破碎細胞(如通過超聲處理或滲透休克)以釋放周質間隙的內容物並回收蛋白質而完成，這樣可不必變性和再摺疊。
轉化的或轉染的細胞根據常規程序培養於含有所選宿主細胞生長必需的營養物和其它成分的培養基中。各種合適的培養基，包括已知成分培養基和複合培養基，在本領域中都是已知的，並通常包括碳源、氮源、必需胺基酸、維生素和礦物質。如果需要，培養基中也可包含諸如生長因子或血清之類的組分。培養基通常將通過例如藥物選擇或缺少某種必需養分來選擇含外源導入DNA的細胞，這種缺少的必需養分可通過表達載體上攜帶的或共轉染進入宿主細胞的選擇標記得到補充。在約25℃-35℃將甲醇畢赤酵母細胞培養於含足夠碳源、氮源和微量養分的培養基中。用常規方法向液體培養物中提供足夠通氣量，諸如小搖瓶或發酵罐噴霧。甲醇畢赤酵母的優選培養基是YEPD(2％D-葡萄糖、2％BactoTMPeptone(Difco實驗室，底特律，MI)、1％BactoTM酵母提取物(Difco實驗室)、0．004％腺嘌呤和0．006％L-亮氨酸)。
在本發明的一方面，通過培養細胞產生新的蛋白質，該細胞被用於篩選此蛋白質的一個或多個受體，包括天然受體，以及天然配基的激動劑和拮抗劑。
蛋白質分離優選純化本發明多肽至不低於80％純度，更優選不低於90％的純度，甚至更優選不小於95％的純度，尤其優選藥學上的純度，即相對於雜質大分子，特別是其它蛋白質和核酸，純度超過99．9％，且不合傳染因子和致熱因子。優選地，純化多肽基本不含其它多肽，特別是其它動物源多肽。
表達的重組多肽(或嵌合多肽)可用分級分離和／或常規純化方法和介質進行純化。硫酸銨沉澱及酸或離液劑提取可用於樣品的分級分離中。典型的純化步驟可包括羥基磷灰石層析、尺寸排阻層析、FPLC和反相高效液相層析。合適的陰離子交換介質包括葡聚糖衍生物、瓊脂糖、纖維素、聚丙烯醯胺、特殊性能二氧化矽，等等。PEI、DEAE、QAE和Q衍生物是優選的，特別優選DEAE Fast-Flow Sepharose(Pharmacia，Piscataway，NJ)。典型的層析介質包括那些苯基、丁基或辛基衍生的介質，如Phenyl-SepharoseFF(Pharmacia)、Toyopearl butyl 650(Toso Haas，Montgomeryville，PA)、Octyl-Sepharose(Pharmacia)，等等；或聚丙烯樹脂，如AmberchromCG71(Toso Haas)等。合適的固相支持體包括玻璃珠、矽基樹脂、纖維素樹脂、瓊脂糖珠、交聯瓊脂糖珠、聚苯乙烯珠、交聯聚丙烯醯胺樹脂等等，它們在所要使用的條件下是不溶的。這些支持物可用反應基團修飾，使得蛋白質可通過氨基、羧基、巰基、羥基和／或碳水化合物部分附著於支持物上。偶聯化學法的例子包括溴化氰活化、N-羥基琥珀醯亞胺活化、環氧化物活化、巰基活化、醯肼活化及用於碳二亞胺偶聯化學法的羧基和氨基衍生物。這些及其它固相介質在本領域中是眾所周知並廣泛應用的，且可購自產品供應商處。將受體多肽結合到支持介質上的方法在本領域中是眾所周知的。特定方法的選擇是一個常規設計的問題，它部分是由所選支持物的特性決定的。參閱例如《親和層析原理和方法》(Pharmacia LKBiotechnology，Uppsala，Sweden，1988)。
可利用它們的特性分離本發明的多肽。例如，固定化金屬離子吸附(IMAC)層析可用於純化富含組氨酸的蛋白質。簡單說，凝膠先帶上二價金屬離子，形成螯合物(E．Sulkowski，生化動態31-7，1985)。富含組氨酸的蛋白質將以不同的親和力吸附於該基質上(這取決於所用的金屬離子)，並可通過競爭性洗脫作用，降低pH，或用強螯合劑而洗脫。其它的純化方法包括用凝集素親和層析和離子交換層析純化糖基化的蛋白質(酶學方法，182卷，「蛋白質純化指南」，M．Deutscher，(編)，529-539頁，Acad出版社，San Diego，1990)。或者，可構建目的多肽與親和標記(如多聚組氨酸、麥芽糖結合蛋白質、免疫球蛋白結構域)的融合體以有助於純化。
用途本發明多肽具有四螺旋束細胞因子的結構特性。如果一種蛋白質可溶並具有通過細胞表面受體作用而傳導信號和調節細胞增殖的能力，通常將它描述為細胞因子。細胞因子有數種三級結構摺疊分類，包括富半胱氨酸的二聚體(如胰島素、PDGF)、β-三葉形折迭(如FGF、IL-1)、及全α四螺旋束。後者的特徵在於具有獨特上-上-下-下拓撲結構的4個螺旋，標記為A、B、C和D，其中兩個自上而下環連接螺旋A和B以及螺旋C和D。參閱，例如，Manavalan等，蛋白質化學雜誌11(3)321-31(1992)。有時將四螺旋束細胞因子進一步再分成短鏈(如IL-4、IL-2、GM-CSF)和長鏈(如TPO、生長激素、leptin、IL-10)，其中後者通常具有較長的A和D螺旋和自上而下的環。今後我們可同義地使用術語「細胞因子」和「四螺旋束細胞因子」。Zcyto10的螺旋A包括胺基酸殘基35(異亮氨酸)至胺基酸殘基49(異亮氨酸)，也由SEQ ID NO14表示；螺旋B包括第91位胺基酸亮氨酸至第105位胺基酸蘇氨酸，也由SEQ ID NO15表示；螺旋C包括第112位胺基酸殘基亮氨酸至第126位胺基酸殘基半胱氨酸，也由SEQ ID NO16表示；螺旋D包括第158位胺基酸殘基纈氨酸至第172位胺基酸殘基甲硫氨酸，也由SEQ ID NO17表示。
人Zcyto10在Cys33和Cys126之間有分子內二硫鍵。預期其它4個半胱氨酸Cys80、Cys132、Cys81和Cys134形成Cys80-Cys132和Cys81-Cys134形式的兩個分子內二硫鍵。預計對Zcyto10的結構穩定性比較重要的殘基包括Cys33、Cys126、Cys80、Cys132、Cys81和Cys134。預期這些殘基中任何一個突變成其它殘基均會使Zcyto10功能失活。
Zcyto10的結構穩定性還取決於維持四個α-螺旋上的埋藏的疏水面。預計殘基Ile42、Phe46、Ile49、Leu91、Val94、Phe95、Tyr98、Leu112、Phe116、Ile119、Leu123、Val158、Leu162、Leu165、Leu168、Leu169和Met172埋藏於蛋白質核心中，如果它們改變，則取代胺基酸殘基必須是疏水胺基酸。
預期涉及Zcyto10與細胞表面受體結合的殘基包括螺旋A和B間自上而下的環中的Asp57，和預計暴露於螺旋D表面的帶電殘基Lys160和Glu164。在蛋白質表面上，環AB和螺旋D區域上是含殘基Ile62、Leu71、Ile167和Trp171的疏水表面塊。這些殘基可能與細胞表面受體上的疏水表面塊相互作用。
本發明的人Zcyto10多肽與白介素-10(IL-10)有約28％的相同性。小鼠Zcyto10多肽與人IL-10具有約24％的相同性，與小鼠IL-10有約27％的相同性。人Zcyto10多肽與小鼠Zcyto10多肽有約76％的相同性。
小鼠Zcyto10的螺旋A包括SEQ ID NO19的第35位胺基酸殘基異亮氨酸至第49位胺基酸殘基精氨酸，也用SEQ ID NO21表示。小鼠Zcyto10的螺旋B包括SEQ ID NO19的第91位胺基酸殘基亮氨酸至第105位胺基酸殘基蘇氨酸，也用SEQ ID NO22表示。小鼠Zcyto10的螺旋C包括SEQ ID NO19的第112位胺基酸殘基亮氨酸至第126位胺基酸殘基半胱氨酸，也用SEQ ID NO23表示。小鼠Zcyto10的螺旋D包括SEQ ID NO19的第158位胺基酸殘基纈氨酸至第172位胺基酸殘基甲硫氨酸，也用SEQ ID NO24表示。
IL-10是一種細胞因子，它可抑制其它細胞因子的產生、誘導活化B淋巴細胞增殖和分化、抑制HIV-1複製並對γ幹擾素呈現拮抗效應。IL-10似乎以由180°旋轉相關的兩α-螺旋多肽區形成的二聚體形式存在。參閱，例如，Zdanov等，結構3(6)591-601(1996)。已報導IL-10是活化Th2T-細胞、B-細胞、角質細胞和單核細胞／巨噬細胞的產物，能調節Th1T-細胞應答。可通過抑制Th1 T-細胞的細胞因子合成來完成這樣的調節。參閱，例如，Hus等，Int．Immunol．4563(1992)和D』Andrea等，實驗醫學雜誌(J．Exp．Med．)1781042(1992)。也已報導IL-10可抑制天然殺傷細胞和單核細胞／巨噬細胞的細胞因子合成。參閱，例如，Hus等(上文所引用)和Fiorentino等，免疫學雜誌，1463444(1991)。此外，已發現IL-10對胰島素依賴型糖尿病具保護作用。
在相應於該新DNA之mRNA的組織分布分析中，觀察到有單個轉錄物，大約為1．2Kb。利用Clontech多組織Northern，觀察到在氣管、胎盤、睪丸、皮膚、唾液腺、前列腺、甲狀腺中明顯有人轉錄物，而在胃和胰中表達較低。Zcyto10表達於以下小鼠組織中腎、骨骼肌、唾液腺、肝和皮膚。
Zcyto10表達的組織特異性顯示，在氣管和唾液腺、胃、胰和肌肉中Zcyto10可能是生長和／或維持因子；且在局部免疫應答中可能是重要的。而且，Zcyto10基因定位在染色體lq32．2上，這表明Zcyto10是生長／分化因子或如同IL-10一樣在免疫應答調節中是重要的。
本發明還提供了可用於診斷應用中的試劑。含Zcyto 10 DNA或RNA或其亞序列的探針可用於測定Zcyto 10基因是否存在於染色體1上或是否發生了突變。
本發明還提供具顯著治療價值的試劑。Zcyto 10多肽(天然或重組形式)、其片段、它們的抗體和抗獨特型抗體以及鑑定為與Zcyto 10多肽具結合親和力的化合物，在異常生理或發育相關性疾病(包括異常增殖，如患癌或變性疾病或免疫性改變)的治療中是有用的。
可純化抗Zcyto 10多肽抗體並隨後施用於病人。為了治療的作用，這些試劑可與另外的活性或惰性成分相結合，如藥學上可接受的載體或稀釋液以及生理學上無害的穩定劑和賦形劑。這些混合物可經無菌過濾，並通過冷凍乾燥置於試劑瓶中或保存於穩定的水製劑中以劑量形式放置。本發明還涉及抗體及其結合片段、或包括非補體結合形式在內的單鏈抗體的用途。
有效治療所必需試劑的份量取決於許多不同的因素，包括施藥方法、靶位點、病人的生理學狀態及施用的其它藥物。因此，應確定治療劑量以使安全性和有效性達到最佳。一般說來，這些試劑的體外使用劑量能為其體內施用的有效量提供有用的指導。治療特殊失調的有效劑量的動物試驗將為人所用劑量提供進一步預兆性指示。施藥方式包括口服、靜脈內、腹膜內、肌肉、經皮用藥或通過噴霧器或霧化器以噴霧形式施用入肺或氣管。藥學上可接受載體將包括水、鹽水、一些緩衝液等。通常預期的劑量範圍是1-1000μg／Kg體重／天。然而，劑量可以更高或更低，這可由本領域常規技術的內科醫生確定。藥物配方和劑量範圍的完整討論可參閱Remington′s PharmaceuticalScience，第18版(Mack Publishing Co．，Easton，Penn．，1996)，及Goodman和Gilman的治療的藥物學基礎，第9版(Pergamon Press1996)。
基於核酸的治療如果哺乳動物的Zcyto 10基因突變或缺失，可將Zcyto 10基因引入該哺乳動物的細胞。在一實施方案中，將編碼Zcyto 10多肽的基因在一病毒載體上引入體內。這樣的載體包括減毒或缺陷型DNA病毒，諸如(但不局限於)單純瘡疹病毒(HSV)、乳頭瘤病毒、非洲淋巴瘤病毒(EBV)、腺病毒、腺伴隨病毒(AAV)等等。優選完全或幾乎完全缺失病毒基因的缺陷型病毒。缺陷型病毒在引入細胞後無感染性。使用缺陷型病毒載體能夠在特定的局部區域給與細胞，而不用擔心此載體會感染其它細胞。特殊的載體例子包括，但不局限於，缺陷型皰疹病毒1(HSV1)載體[Kaplitt等，Molec．Cell．Neurosci．，2320-330(1991)]、減毒的腺病毒載體，如由Stratford-Perricaudet等，臨床研究雜誌(J．Clin．Invest．)，90626-630(1992)所述的載體，及缺陷型腺伴隨病毒載體[Samulski等，病毒學雜誌，613096-3101(1987)；Samulski等，病毒學雜誌，633822-3828(1989)]。
在另一實施方案中，基因可在逆轉錄病毒載體中引入，如以下文獻所述Anderson等的美國專利第5，399，346號；Mann等，細胞，33153(1983)；Temin等的美國專利第4，650，764號；Temin等的美國專利第4，980，289號；Markowitz等，病毒學雜誌，621120(1988)；Temin等的美國專利第5，124，263號；國際專利公開號WO95／07358，由Dougherty等人於1995年3月16日公開；血液學，82845(1993)。或者，載體可利用脂質體通過體內脂轉染法而引入。合成的陽離子脂質可用來製備脂質體以用於標記編碼基因的體內轉染[Felgner等，美國國家科學院院報，847413-7417(1987)；參閱Mackey等，美國國家科學院院報，858027-8031(1988)]。使用脂轉染法將外源基因引入體內特殊器官具有某些實用的好處。脂質體對特定細胞的分子靶向性代表了優點的一方面。很顯然，指導向特殊細胞的轉染代表了優點的又一方面。也很清楚的是，在細胞異質性組織，如胰、肝、腎和腦中，向特殊細胞類型的定向轉染尤其有利。為了靶向的目的可將脂類化學偶聯上其它分子。靶向肽，如激素或神經遞質，及如抗體之類的蛋白質，或非肽分子均可與脂質體化學偶聯。這些脂質體也可以用噴霧器或霧化器的方法以噴霧形式施用於肺或氣管。
將細胞從體內取出，然後將作為裸露DNA質粒的載體引入該細胞中，並隨後將此轉化細胞再植入體內，這樣的操作是可能的。可按本領域已知技術將用於基因治療的裸DNA載體引入目的宿主細胞中，如轉染、電穿孔、顯微注射、轉導、細胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸鈣沉澱、基因槍的使用或DNA載體轉運蛋白的使用[參閱，如Wu等，生物化學雜誌267963-967(1992)；Wu等，生物化學雜誌，26314621-14624(1988)]。
Zcyto 10多肽也可用於製備可特異結合Zcyto 10多肽的抗體。這些抗體隨後可用於製備抗獨特型抗體。本文所用的「抗體」一詞包括多克隆抗體、單克隆抗體、及其諸如F(ab)2和Fab片段之類的抗原結合片段，等等，其中包括基因工程抗體。若抗體與Zcyto 10多肽結合的Ka≥107／M，則此抗體被定義為可特異結合。本領域常規技術人員可輕易測定單克隆抗體的親和力(參閱，例如，Scatchard，同上)。
製備多克隆和單克隆抗體的方法在本領域是眾所周知的(參閱例如，Sambrook等，分子克隆實驗室手冊(第二版)(冷泉港，紐約，1989)；和Hurrell，J．G．R．，編輯，單克隆雜交瘤抗體技術及應用(CRC Press，Inc．，Boca Raton，FL，1982)，均在此引入作為參考)。本領域常規技術人員可明顯看到，多克隆抗體可自各種溫血動物，如馬、牛、山羊、綿羊、狗、小雞、兔子、小鼠和大鼠中製備。通過使用諸如弗氏完全或不完全佐劑之類的佐劑可提高Zcyto 10多肽的免疫原性。本領域技術熟練人員已知的各種試驗均可用於檢測能與Zcyto 10多肽特異結合的抗體。實例性試驗詳述於《抗體實驗室手冊》，Harlow和Lane(編)(冷泉港實驗室出版社，1988)。這些試驗的代表性例子包括合併免疫電泳、放射免疫分析、放射免疫沉澱法、酶聯免疫吸附測定(ELISA)、斑點印跡試驗、抑制或競爭試驗及三明治試驗。
抗Zcyto 10抗體可用於標記表達此蛋白質的細胞，用於親和純化，在診斷分析中用於測定可溶性蛋白質多肽的循環水平，並可作為拮抗劑以阻斷體外和體內的配體結合和信號轉導。
本發明的另一方面提供了含純化Zcyto 10多肽與藥用可接受載體結合的藥物組合物。如本文將進一步論述的，這些組合物可用於在預防和治療其特徵為非正常細胞增殖、細胞分化或細胞因子產生的疾病中調節細胞增殖、細胞分化或細胞因子產生。此外，本發明的Zcyto 10多肽可用於氣管特異或氣管支氣管特異的應用中，如氣管支氣管上皮或其基底細胞的維持或傷口修復、調節粘液產生或殘渣的粘液性清除或治療哮喘、支氣管炎或氣管支氣管道的其它疾病。預計Zcyto 10多肽的施用劑量範圍在與Zcyto 10-FC構建體所用相同的劑量至比其高100倍劑量之間，這取決於Zcyto 10多肽的穩定性。Zcyto 10的治療劑量為5-5000μg／Kg／天。
本發明的Zcyto 10多肽高表達於唾液腺和氣管中，通過Western印跡分析發現存在於唾液中。唾液腺合成和分泌具有不同生物學功能的許多蛋白質。這樣的蛋白質有助於口腔的潤滑(如粘蛋白和富脯氨酸蛋白質)、補充礦質(如statherin和離子性的富脯氨酸蛋白質)和消化(如澱粉酶、脂酶和蛋白酶)及指供抗微生物(如富脯氨酸蛋白質、溶菌酶、histatin和乳過氧化物酶)和黏膜成分維持(如粘蛋白)能力。此外，唾液是唾液腺所合成之生長因子的豐富來源。例如，已知唾液含表皮生長因子(EGF)、神經生長因子(NGF)、轉化生長因子-α(TGF-α)、轉化生長因子-β(TGF-β)、胰島素、胰島素類生長因子Ⅰ和Ⅱ(IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ)和成纖維細胞生長因子(FGF)。參閱，例如，Zelles等，J．Dental．Res．74(12)1826-32，1995。唾液腺合成生長因子的過程被認為是雄激素依賴型的，對於口腔及胃腸道的健康是必需的。
因而，Zcyto 10多肽、其興奮劑或拮抗物在胃腸道或口腔再生中可能有治療效用。為了證實本發明Zcyto多肽、興奮劑或拮抗物有這樣的能力，按本領域已知方法評估這些Zcyto 10多肽、興奮劑或拮抗物降解澱粉的能力。通過幹預Th1和Th2淋巴細胞的交叉調節及對諸如嗜酸性細胞、肥大細胞、嗜鹼性細胞、嗜中性粒細胞和巨噬細胞之類其它炎性細胞介質的生長、分化和細胞因子產生的調節，Zcyto 10多肽、其興奮劑或拮抗物可用於治療哮喘及其它氣管支氣管道疾病。Zcyto 10多肽及其興奮劑或拮抗物還可調節氣管支氣管道中肌肉的緊張性。
當摻入油膏或霜中時，Zcyto 10多肽還可用於治療許多系統性或局部的皮膚病，例如通常為溼疹、牛皮癬或幹皮病，或用於相關的皮膚保養。此外Zcyto 10多肽還可直接注射入肌肉以治療老人、病人或長期臥床者的肌萎縮。
放射雜交繪圖是用於構建哺乳動物染色體的高解析度連續圖譜的體細胞遺傳技術[Cox等，科學250245-250(1990)]。部分或完全清楚基因序列就可設計適於染色體放射雜交繪圖板使用的PCR引物。覆蓋整個人基因組的放射雜交繪圖板，如Stanford G3 RH Panel和GeneBridge 4 RH Panel(Research Genetics，Inc．，Huntsville，AL)可購買得到。這些板可基於PCR而快速地進行染色體定位及基因、序列標記位點(STS)和其它非多態性或多態性標誌在目的區域內的排列。這包括直接建立新發現目的基因與原先圖標標誌間的成比例物理距離。確知基因位置在許多方面都是有用的，包括1)確定一段序列是否為一已有毗連序列群的一部分，並得到諸如YAC-、BAC-或cDNA克隆之類多種形式的其它周圍遺傳序列，2)為顯示與相同染色體區域連鎖的遺傳疾病提供可能的候選基因，及3)交叉參照模型生物，諸如小鼠，以協助確定特殊基因所具有的功能。
結果顯示Zcyto 10基因繪圖在WICGR放射雜交圖譜上自人染色體1連鎖群頂部的889．26cR-3000。近側或遠側構架標記分別是DIS504和WI-9641(DIS2427)。利用周圍標記將Zcyto 10基因定位於完整LDB染色體1圖譜上的lq32．2區域(遺傳定位資料庫，南安普敦大學，WWW伺服器http／／cedar．genetics．soton．ac．uk／public-html／)。許多基因已繪圖於染色體1的lq32．2區域。尤其是，該區域內的突變已發現導致van der Woude綜合症，和有時與顎裂相關的下唇畸形有關。因而，表達於唾液腺中的Zcyto 10基因可用於該綜合症的基因治療。若哺乳動物Zcyto 10基因突變或缺失，可將Zcyto10基因引入該哺乳動物的細胞中。
本發明的另一方面涉及與SEQ ID NO1，3，18和33所列多核苷酸的區段互補的反義多核苷酸組合物。可設計這樣的合成反義寡核苷酸以結合編碼Zcyto 10多肽的mRNA並抑制該mRNA的翻譯。這樣的反義寡核苷酸可用於抑制細胞培養物或被試者中Zcyto 10多肽編碼基因的表達。
本發明還提供了在診斷應用中有用的試劑。例如，Zcyto 10基因、含Zcyto 10 DNA或RNA或其亞序列的探針可用於檢測Zcyto 10基因是否存在於染色體1上或是否發生了突變。在Zcyto 10基因位置上的可檢測染色體畸變包括但不局限於非整倍體、基因拷貝數改變、插入、刪除、限制酶切位點改變和重排。通過分子遺傳學技術，諸如限制性片段長度多態性(RFLP)分析、應用PCR技術的短串聯重複序列(STR)分析及本領域已知的其它遺傳連鎖分析技術[Sambrook等，同上；Ausubel等，同上；Marian，A．J．，Chest，108255-265，(1995)]，用本發明的多核苷酸可檢測這樣的畸變。
本領域的那些技術熟練人員將認識到公開於SEQ ID NO2、4、12、13、19、20、25、26、34和35中的序列代表了人和小鼠Zcyto 10基因和多肽的單個等位基因，並認識到會存在等位變異和其它剪接方式。按標準步驟通過對來自不同個體的cDNA或基因組文庫進行探測可克隆等位變體。SEQ ID NO1、3、18和33中所示DNA序列的等位變體，包括含沉默突變的變體和突變導致胺基酸序列改變的變體，均在本發明範圍內。
Zcyto 10序列在SEQ ID NO1之3』非翻譯區內位置706、813、855和906處具有7個信使不穩定性基元。用放線菌酮處理表達Zcyto10的細胞可削弱這種信使不穩定性。參閱Shaw，G．等，細胞46659-667(1986)。此外，可在基因上改變或除去富AT的3』非翻譯區以進一步提高信使穩定性。
使用Zcyto 10促進傷口癒合實施例4的數據顯示Zcyto 10在傷口癒合中起作用。因此，Zcyto10可應用於傷口或燒傷中促進傷口癒合。Zcyto 10可以1-100μg／Kg體重的劑量系統性地施用。Zcyto 10還可通過含1ng-1mg Zcyto 10／g藥膏或軟膏的藥膏或軟膏方式應用於傷口上。參閱Remington’sPharmaceutical Sciences，第18版(Mark Publishing Co．，Easton，Penn．，1996)。應每天將Zcyto 10用於清潔傷口上直到傷口癒合。
利用Zcyto 10增加血小板數正如在以下實施例7中可見的，我們已發現Zcyto 10可用於增加血小板數。這對於由於化療或放療而血小板減少的癌症病人尤其重要。Zcyto 10可與藥用可接受載體一起在治療上施用。
本發明進一步由以下非限制實施例進行描述。
實施例1Zcyto 10的克隆Zcyto10x1(較長形式)和Zcyto10x2(較短形式)的全長序列通過以下步驟闡明進行3』RACE，並將產生的兩片段測序(SEQ ID NO10和SEQ ID NO11)，然後用計算機將SEQ ID NO5中所示的est序列與來自兩個3』race的片段的重疊序列人工拼接在一起。
將寡核苷酸zc15907(SEQ ID NO6)設計成恰位於Zcyto 10推定甲硫氨酸上遊區域(5』)。將另一寡核苷酸zc15906(SEQ IN NO7)設計在更遠的下遊，恰位於信號序列切割位點的上遊區域。將這些寡核苷酸用於人氣管marathon cDNA的3』RACE反應中。ZC15907用於第一3』race反應中，zc15906用於嵌套式3』race反應中。以購自Clontech的人氣管mRNA開始，用Marathon cDNA擴增試劑盒(Clontech，Palo Alto，CA)按製造商說明書製備MARATHON cDNA。
按Marathon cDNA擴增試劑盒中製造商的說明書進行PCR反應，在熱循環參數上有一些修改。用於第一PCR反應中的循環參數是94℃1分鐘30秒，1次94℃15秒、68℃1分鐘，30次72℃7分鐘，1次用於嵌套式PCR反應中的循環參數是94℃1分鐘30秒1次，94℃15秒68℃1分鐘20秒，30次，72℃7分鐘1次。
將產生的產物進行1．2％瓊脂糖凝膠(Gibco瓊脂糖)電泳，可見兩主帶，大約相距80bp。將這些帶切出並按製造商說明書用QIAEXTM樹脂(Qiagen)進行凝膠純化。然後將這些片段測序，可識別Zcyto 10的全長序列。
實施例2RNA印跡分析對人的多組織印跡Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和RNA主點印跡(Master DotBlot)(Clontech)進行探測，以確定Zcyto 10的組織分布。用est序列(SEQ ID NO5 bp 100-145)設計45-mer反義寡核苷酸(SEQ IDNO9)並用於探測。
用T4多核苷酸激酶(Gibco-BRL)將15pm的SEQ ID NO9進行32P末端標記。標記反應液含2μl5X激酶反應緩衝液(Gibco-BRL)、1μl T4激酶、15pm SEQ ID NO9、1μL 6000Ci／mmol32P γ-ATP(Amersham)和水至10μl。反應液37℃溫育30分鐘。用NucTrapProbe Purification Column(Stratagene)除去未摻入的放射性。多組織RNA印跡和人RNA主印跡(Clontech)在10ml ExpressHyb中50℃預雜交3小時，其中含1mg鮭精DNA和0．3mg人cotl DNA(Gibco-BRL)，二者均煮沸3分鐘，冰置2分鐘然後加入ExpressHyb中。在50℃雜交過夜。起始洗滌條件如下2XSSC、0．1％SDS室溫40分鐘，其中多次換洗滌液，然後1XSSC、0．1％SDS在64℃(Tm-10)30分鐘。印跡隨後對膠片曝光兩天。
RNA印跡中Zcyto 10的表達顯示在氣管中約有1．2kb的帶，在胃中有弱的1．5kb帶，在胰中有這兩種大小的較弱帶。斑點印跡顯示在氣管、唾液腺、胎盤、睪丸、皮膚、前列腺、腎上腺和甲狀腺中存在Zcyto 10。
在小鼠中，Zcyto 10發現存在於腎、骨骼肌、唾液腺、肝和皮膚內。
實施例3
Zcyto 10的染色體分布和定位用可購買到的「Stanford G3放射雜交繪圖板」(Reseach Genetics，Inc．，Hantsville，AL)將Zcyto 10繪圖於第1號染色體上。該「Stanford G3 RH板」包含來自整個人基因組之83個放射雜交克隆中每一個的可PCR DNA，加上兩個對照DNA(RM供體和A3受體)。一個公眾可使用的WWW伺服器(http／／shgc-www．stanford．edu)可用於標記的染色體定位。
為了用「Stanford G3 RH板」給Zcyto10繪圖，在可PCR的96孔微滴定板(Stratagene，La Jolla，CA)上建立20μl的反應體系，將其用於「RoboCycler Gradient96」熱循環儀(Stratagene)上。85個PCR反應中的每一個組成如下2μl 10x KlenTaq PCR反應緩衝液(CLONTECH Laboratories，Inc．，Palo Alto，CA)、1．6μl dNTP混合液(每種2．5mM，PERKIN-ELMER，Foster City，CA)、1μl有義引物(SEO ID NO6，5』ATT CCT AGC TCC TGT GGT CTC CAG 3』)、1μl反義引物(SEQ ID No8，5』TCC CAA ATT GAG TGT CTT CAG T3』)、2μl「Redi Load」(Research Genetics，Inc．，-Huntsville，AL)、0．4μ1 50x Advantage KlenTaq Polymerase Mix(ClontechLaborabories，Inc．)、來自單個雜交克隆或對照的25ng DNA，用ddH2O補充至總體積20μl。用等量礦物油覆蓋和密封反應液。PCR循環條件如下開始的第一個循環為95℃變性5分鐘，然後35個循環是95℃變性1分鐘、66℃退火1分鐘再72℃延伸1分鐘，最後一個循環是72℃延伸7分鐘。在2％瓊脂糖凝膠(Life Technologies，Gaithersburg，MD)上電泳分離反應產物。
結果顯示，Zcyto 10與構架標記SHGC-36215連鎖，具大於10的LOD值，且距離標記為14．67CR-10000。藉助於周圍標記，將Zcyto10定位於完整LDB 1號染色體圖譜的lq32．2區域(The GeneticLocation Database，南安普敦大學，WWW伺服器http／／cedar．genetics．soton．ac．uk／public_html／)。
實施例4
利用Zcyto 10促進傷口癒合本研究中使用了正常成熟雌性Balb／C小鼠。將它們以12小時光亮-黑暗的循環置於動物護理室中，在研究期間給水並以實驗室嚙齒類隨意食水方式餵養。它們從外科手術的那天起被分別關入籠中。
在外科手術當日，用在無菌(0．2 μ-過濾)磷酸緩衝鹽溶液(PBS)中的104mg／kg氯胺酮(Vetalar，Aveco Inc．，Ft．Dodge，IA)加7mg／kg甲苯噻嗪(Rompun，Mobey Corp．，Shawnee，KS)通過腹膜內注射麻醉動物。剪掉背部毛髮並用NAIR(Carter-Wallace，NewYork，NY)使皮膚脫毛，然後以水清洗。將100％aloe vera凝膠用於對抗由於NAIR處理所致的鹼性灼傷，然後將動物置於循環水加熱臺上直到皮膚及周圍毛皮乾燥。
然後用metofane(Pittman Moore，Mundelein，NJ)麻醉動物並用70％酒精擦拭脫毛的背部。在胸腰椎水平穿過脊柱旁區域上方的皮膚和肉膜作4個切口，每個0．5平方釐米。用粘性的半透性封閉敷料BIOCLUSIVE(Johnson＆Johnson，Arlington，TX)覆蓋傷口和周圍脫毛皮膚。為了稍後評估閉合參數，通過BIOCLUSIVE將切口邊緣描到醋酸透明紙上。
用Qiagen RNeasy Midi Kit在不同時間點(7小時、15小時和24小時)處理對照皮膚和受傷皮膚。簡短地說，將皮膚(對照和受傷區域)稱重並於恰當體積裂解緩衝液(RLT)中勻漿。旋轉裂解物以去除組織殘渣並將等體積70％乙醇加入；混勻後上柱。樣品旋轉5分鐘並用3．8mlRW1緩衝液洗1次，然後用RPE洗兩次(各2．5ml)。用無RNase水洗脫總RNA。用實時PCR(Perkin Elmer ABI Prisn 7700 SequenceDetector)檢測皮膚樣品的表達水平。
實驗設計為一無模板對照、一套標準和皮膚樣品。用小鼠腎總RNA作標準曲線。三套皮膚總RNA(25ng)用於此實驗中7小時(對照和受傷的)；15小時(對照和受傷的)、24小時(對照和受傷的)。每一樣品在7700序列檢測儀上通過一步逆轉錄PCR重複三次進行。該實驗中使用了內置式(in-house)正向引物SEQ ID NO36、反向引物SEQ IDNO37和Perkin Elmer’s Taq Man probe(ZG-7-FAM)。一步逆轉錄PCR的條件如下(逆轉錄步驟)48℃30分鐘，(40個循環的PCR步驟)95℃10分鐘，95℃15秒，60℃1分鐘。
對照皮膚樣品中在7小時和15小時時Zcyto10的表達水平類似，分別為2．46ng／ml和2．61ng／ml。24小時的對照皮膚樣品中Zcyto10的表達水平是0。7小時時受傷皮膚的Zcyto10表達水平是5．17ng／ml(與對照樣品的相比提高了2倍以上)。15小時時受傷皮膚的Zcyto 10表達水平是14．45ng／ml(與對照樣品相比增加了5．5倍)。24小時時受傷皮膚的Zcyto 10表達水平是5．89ng／ml。重複實驗還包括陰性對照(酵母tRNA)，顯示有相似傾向，酵母tRNA的結果接近0。結果顯示擴增確實存在且為小鼠特異性。
這些數據表明Zcyto10在傷口修復中起作用，因為受傷組織的Zcyto10表達水平較對照樣品的高且其隨時間增加和減少。因此，Zcyto10可應用於受傷處以促進傷口癒合。
實施例5轉基因小鼠生產在清蛋白或金屬硫蛋白啟動子控制下表達Zcyto10的轉基因小鼠。出生時，數隻小鼠具有發亮的外觀，運動有限。這些小鼠的皮膚緊繃並有皺紋，其中數個還在下唇上有細絲類毛髮。鼻孔和嘴區域、四肢和尾部有些腫。
使用清蛋白啟動子的一隻轉基因小鼠存活3天，它嚴重地生長延遲。無耳朵發育，而足趾的發育延緩。當其在第1、2或3天瀕死時處死所有動物。收集尾和肝樣品並將其原位固定於10％中性福馬林中並包埋在石蠟中，切成3μm的切片並用HE染色。具此表型的所有小鼠均為轉基因小鼠且有從低到高的Zcyto10表達。
在除皮膚外的大部分組織中觀察不到顯著的改變。表達Zcyto10的幼鼠，尤其是具高Zcyto10表達水平的那些小鼠的皮膚傾向於較無表達幼鼠的皮膚厚。這些幼鼠的顆粒層與無表達幼鼠相比厚度減少，棘層由於細胞層增加和／或細胞直徑增加而較厚。
除了表皮中的改變外，具中等Zcyto10表達的一隻小鼠的真皮被粘性物質病灶性地適度擴張。
實施例6從細胞培養基純化Zcyto10用陽離子交換層析和大小排阻層析兩步方法自細胞培養基中分離CHO細胞產生的Zcyto10。A．陽離子交換層析步驟所用材料用具共價鍵合磺丙基(SP)的一種TOYOPEARL離子交換樹脂，SP-650M陽離子交換樹脂填充的2．2cm直徑(D)x6cm高(H)柱(AMICON)。
收集來自已被含Zcyto質粒轉染之幼倉鼠腎(BHK)細胞的15升培養基。用2N HCl將培養基pH調至pH5。用50mM乙酸鈉(NaAc，pH5．0)平衡上述填充柱。以約8ml／分鐘20個柱體積(CV)／小時的速率將培養基裝入柱子。上柱完成後用10個柱體積的50mM NaAc，pH5．0洗柱。然後用50mM NaAc，pH5．0中的20柱體積NaCl梯度洗脫柱中的物質。NaCl梯度為0→0．5M NaCl。這將培養基中的物質從15升濃縮至170ml。
用截流5000的旋轉離心濃縮器(Millipore，Inc．Bedford，MA)將產生的170ml收穫物進一步濃縮至約5ml。B．大小排阻(S-100)凝膠過濾步驟所用材料1．6cm(直徑)X93cm(高)柱S-100凝膠(Pharmacia，Piscataway，NJ)隨後將5ml收穫液加到上述含S-100凝膠的柱子上。該柱子已用5X磷酸緩衝鹽溶液平衡至柱pH約為7．0。用1XPBS以1．5ml／分鐘的流速將Zcyto10與汙染物分離。以2ml量收集各組分。通過以考馬斯蘭染色的十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯醯胺凝膠電泳確定，在洗脫開始約90分鐘時Zcyto10多肽洗下到組分52-64中。凝膠顯示在約14KDa的預期分子量處有一條帶。
實施例7小鼠Zcyto10的克隆5』MARATHON RACETM(Clontech，Palo Alto，CA)的PCR引物為附著於MARATHONTMAP1銜接物的SEQ ID NO38，它與附著於AP2MARATHONTM銜接物的SEQ ID NO39嵌套，3』MARATHON RACETM的引物為附著於MARATHON RACETMAP1銜接物的SEQ ID NO40，它與附著於MARATHON RACETMAP2銜接物的SEQ ID NO41嵌套，對小鼠皮膚MARATHON RACETMcDNA進行5』和3』PCR。將來自這些反應的數個片段進行凝膠純化和測序，可闡明小鼠Zcyto10的全長編碼序列及一些5』和3』UTR序列。發現兩小鼠Zcyto10變體，稱為SEQ ID NO18以及19和SEQ ID NO33和34。物引物SEQ ID NO42和43 PCR擴增這些克隆。
實施例8通過腺病毒將Zcyto10施用於正常小鼠通過含Zcyto10基因的腺病毒施用Zcyto10。如下所述有三組小鼠。將腺病毒從靜脈內注射入C57B1／6雄性和雌性小鼠。在處死前3天所有小鼠接受含有溴脫氧尿苷(Brdu)的飲用水。這樣可通過組織學方法檢測細胞增殖。檢測參數包括體重改變、全血細胞計數、血清化學、組織學、器官重量及通過BrdU檢測的細胞增殖。實驗設計第一組 Zcyto 10x1(SEQ ID NO18)／pAC-CMV／AdV1X1011顆粒／劑(在第21天處死9隻雌性、9隻雄性小鼠)(在第11天處死2隻雌性、2隻雄性小鼠)總數=22隻小鼠第二組 空CMV／AdV對照1X1011粒／劑(在第21天處死10隻雌性、10隻雄性小鼠)
(在第11天處死2隻雌性、2隻雄性小鼠)總數=24隻小鼠第三組 不經處理(5隻雌性、5隻雄性小鼠)總數=10結果最引人注目的結果是，與空腺病毒對照相比，在用Zcyto10-腺病毒處理的雄性和雌性小鼠中觀察到血小板計數顯著增加。在雄性小鼠中這伴隨著血細胞比容降低及脾和肝重增加。在雄性中胸腺重量也減少。與此形成對照的是，與空病毒對照相比，Zcyto10腺病毒處理的雌性小鼠顯示白細胞計數顯著增加，主要是淋巴細胞和中性粒細胞計數增加。
這些結果表明Zcyto10處理影響血細胞生成，但除了血小板計數增加這一效果在兩性都有之外，其它影響是性別特異性的。
其它影響包括以下結果在被處理組中雌性的葡萄糖水平降低，而雄性葡萄糖水平顯示無顯著變化。
在被處理組的雄性和雌性中血尿氮(BUN)均提高。
在被處理組中雌性的鹼性磷酸酶較高，而雄性顯示無顯著變化。
被處理組的雄性和雌性中血小板計數均較高。
在被處理組中雌性的總白細胞計數(WBC)較高而雄性顯示無顯著變化。序列表#60110#62ZymoGenetics，Inc．#60120#62哺乳動物細胞因子樣多肽10#60130#6297-72PC#60160#6243#60170#62FastSEQ for Window Version 3．0#60210#621#60211#62926#60212#62DNA#60213#62人#60220#62#60221#62CDS#60222#62(45)…(572)#60400#621ctttgaattc ctagctcctg tggtctccag atttcaggcc taag atg aaa gcc tct 56Met Lys Ala Ser1agt ctt gcc ttc agc ctt ctc tct gct gcg ttt tat ctc cta tgg act 104Ser Leu Ala Phe Ser Leu Leu Ser Ala Ala Phe Tyr Leu Leu Trp Thr5 10 15 20cct tcc act gga ctg aag aca ctc aat ttg gga agc tgt gtg atc gcc 152Pro Ser Thr Gly Leu Lys Thr Leu Asn Leu Gly Ser Cys Val Ile Ala25 30 35aca aac ctt cag gaa ata cga aat gga ttt tct gac ata cgg ggc agt 200Thr Asn Leu Gln Glu Ile Arg Asn Gly Phe Ser Asp Ile Arg Gly Ser40 45 50gtg caa gcc aaa gat gga aac att gac atc aga atc tta agg agg act 248Val Gln Ala Lys Asp Gly Asn Ile Asp Ile Arg Ile Leu Arg Arg Thr55 60 65gag tct ttg caa gac aca aag cct gcg aat cga tgc tgc ctc ctg cgc 296Glu Ser Leu Gln Asp Thr Lys Pro Ala Asn Arg Cys Cys Leu Leu Arg70 75 80cat ttg cta aga ctc tat ctg gac agg gta ttt aaa aac tac cag acc 344His Leu Leu Arg Leu Tyr Leu Asp Arg Val Phe Lys Ash Tyr Gln Thr85 90 95 100cct gac cat tat act ctc cgg aag atc agc agc ctc gcc aat tcc ttt 392Pro Asp His Tyr Thr Leu Arg Lys Ile Ser Ser Leu Ala Asn Ser Phe105 110 115ctt acc atc aag aag gac ctc cgg ctc tgt cat gcc cac atg aca tgc 440Leu Thr Ile Lys Lys Asp Leu Arg Leu Cys His Ala His Met Thr Cys120 125 130cat tgt ggg gag gaa gca atg aag aaa tac agc cag att ctg agt cac 488His Cys Gly Glu Glu Ala Met Lys Lys Tyr Ser Gln Ile Leu Ser His135 140 145ttt gaa aag ctg gaa cct cag gca gca gtt gtg aag gct ttg ggg gaa 536Phe Glu Lys Leu Glu Pro Gln Ala Ala Val Val Lys Ala Leu Gly Glu150 155 160cta gac att ctt ctg caa tgg atg gag gag aca gaa taggaggaaa 582Leu Asp Ile Leu Leu Gln Trp Met Glu Glu Thr Glu165 170 175gtgatgctgc tgctaagaat attcgaggtc aagagctcca gtcttcaata cctgcagagg 642aggcatgacc ccaaaccacc atctctttac tgtactagtc ttgtgctggt cacagtgtat 702cttatttatg cattacttgc ttccttgcat gattgtcttt atgcatcccc aatcttaatt 762gagaccatac ttgtataaga tttttgtaat atctttctgc tattggatat atttattagt 822taatatattt atttattttt tgctattaat gtatttaatt ttttacttgg gcatgaaact 882ttaaaaaaaa ttcacaagat tatatttata acctgactag agca926#60210#62 2#60211#62 176#60212#62 PRT#60213#62 人#60400#62 2Met Lys Ala Ser Ser Leu Ala Phe Ser Leu Leu Ser Ala Ala Phe Tyr1 5 10 15Leu Leu Trp Thr Pro Ser Thr Gly Leu Lys Thr Leu Asn Leu Gly Ser20 25 30Cys Val Ile Ala Thr Asn Leu Gln Glu Ile Arg Asn Gly Phe Ser Asp35 40 45Ile Arg Gly Ser Val Gln Ala Lys Asp Gly Asn Ile Asp Ile Arg Ile
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#60213#62 人#60400#62 17Val Val Lys Ala Leu Gly Glu Leu Asp Ile Leu Leu Gln Trp Met1 5 10 15#60210#62 18#60211#62 824#60212#62 DNA#60213#62 Mus musculus#60220#62#60221#62 CDS#60222#62 (71)...(598)#60400#62 18tgggagacat cgatagccct gattgatctc tttgaatttt cgcttctggt ctccaggatc60taggtgtaag atg aaa ggc ttt ggt ctt gcc ttt gga ctg ttc tcc gct 109Met Lys Gly Phe Gly Leu Ala Phe Gly Leu Phe Ser Ala1 5 10gtg ggt ttt ctt ctc tgg act cct tta act ggg ctc aag acc ctc cat 157Val Gly Phe Leu Leu Trp Thr Pro Leu Thr Gly Leu Lys Thr Leu His15 20 25ttg gga agc tgt gtg att act gca aac cta cag gca ata caa aag gaa 205Leu Gly Ser Cys Val Ile Thr Ala Asn Leu Gln Ala Ile Gln Lys Glu30 35 40 45ttt tct gag att cgg gat agt gtg caa gct gaa gat aca aat att gac 253Phe Ser Glu Ile Arg Asp Ser Val Gln Ala Glu Asp Thr Asn Ile Asp50 55 60atc aga att tta agg acg act gag tct ttg aaa gac ata aag tct ttg 301Ile Arg Ile Leu Arg Thr Thr Glu Ser Leu Lys Asp Ile Lys Ser Leu65 70 75gat agg tgc tgc ttc ctt cgt cat cta gtg aga ttc tat ctg gac agg 349Asp Arg Cys Cys Phe Leu Arg His Leu Val Arg Phe Tyr Leu Asp Arg80 85 90gta ttc aaa gtc tac cag acc cct gac cac cat acc ctg aga aag atc 397Val Phe Lys Val Tyr Gln Thr Pro Asp His His Thr Leu Arg Lys Ile95 100 105agc agc ctc gcc aac tcc ttt ctt arc atc aag aag gac ctc tca gtc 445Ser Ser Leu Ala Asn Ser Phe Leu Ile Ile Lys Lys Asp Leu Ser Val110115 120 125tgt cat tct cac atg gca tgt cat tgt ggg gaa gaa gca atg gag aaa 493Cys His Ser His Met Ala Cys His Cys Gly Glu Glu Ala Met Glu Lys130 135 140tac aac caa att ctg agt cac ttc ata gag ttg gaa ctt cag gca gcg 541Tyr Asn Gln Ile Leu Ser His Phe Ile Glu Leu Glu Leu Gln Ala Ala145 150 155gtg gta aag gct ttg gga gaa cta ggc att ctt ctg aga tgg atg gag 589Val Val Lys Ala Leu Gly Glu Leu Gly Ile Leu Leu Arg Trp Met Glu160 165 170gag atg cta tagatgaaag tggagaggct gctgagaaca ctcctgtcca638Glu Met Leu175agaatctcag acctcagcac catgaagaca tggccccagg tgctggcatt tctactcaag 698agttccagtc ctcagcacca cgaagatggc ctcaaaccac cacccctttg tgatataact 758tagtgctagc tatgtgtata ttatttctac attattggct cccttatgtg aatgccttca 818tgtgtc 824#60210#62 19#60211#62 176#60212#62 PRT#60213#6062 Mus musculus#60400#62 19Met Lys Gly Phe Gly Leu Ala Phe Gly Leu Phe Ser Ala Val Gly Phe1 5 10 15Leu Leu Trp Thr Pro Leu Thr Gly Leu Lys Thr Leu His Leu Gly Ser20 25 30Cys Val Ile Thr Ala Asn Leu Gln Ala Ile Gln Lys Glu Phe Ser Glu35 40 45Ile Arg Asp Ser Val Gln Ala Glu ASp Thr Asn Ile Asp Ile Arg Ile50 55 60Leu Arg Thr Thr Glu Ser Leu Lys Asp Ile Lys Ser Leu Asp Arg Cys65 70 75 80Cys Phe Leu Arg His Leu Val Arg Phe Tyr Leu Asp Arg Val Phe Lys85 90 95Val Tyr Gln Thr Pro Asp His His Thr Leu Arg Lys Ile Ser Ser Leu100 105 110Ala Asn Ser Phe Leu Ile Ile Lys Lys Asp Leu Ser Val Cys His Ser115 120 125His Met Ala Cys His Cys Gly Glu Glu Ala Met Glu Lys Tyr Asn Gln130 135 140Ile Leu Ser His Phe Ile Glu Leu Glu Leu Gln Ala Ala Val Val Lys145 150 155 160Ala Leu Gly Glu Leu Gly Ile Leu Leu Arg Trp Met Glu Glu Met Leu165 170 175#60210#62 20#60211#62 152#60212#62 PRT#60213#62 Mus musculus#60400#62 20Leu Lys Thr Leu His Leu Gly Ser Cys Val Ile Thr Ala Asn Leu Gln1 5 10 15Ala Ile Gln Lys Glu Phe Ser Glu Ile Arg Asp Ser Val Gln Ala Glu20 25 30Asp Thr Asn Ile Asp Ile Arg Ile Leu Arg Thr Thr Glu Ser Leu Lys35 40 45Asp Ile Lys Ser Leu Asp Arg Cys Cys Phe Leu Arg His Leu Val Arg50 55 60Phe Tyr Leu Asp Arg Val Phe Lys Val Tyr Gln Thr Pro Asp His His65 70 75 80Thr Leu Arg Lys Ile Ser Ser Leu Ala Asn Ser Phe Leu Ile Ile Lys85 90 95Lys Asp Leu Ser Val Cys His Ser His Met Ala Cys His Cys Gly Glu100 105 110Glu Ala Met Glu Lys Tyr Asn Gln Ile Leu Ser His Phe Ile Glu Leu115 120 125Glu Leu Gln Ala Ala Val Val Lys Ala Leu Gly Glu Leu Gly Ile Leu130 135 140Leu Arg Trp Met Glu Glu Met Leu145150#60210#62 21#60211#62 16#60212#62 PRT#60213#62 Mus musculus#60400#62 21Ile Thr Ala Asn Leu Gln Ala Ile Gln Lys Glu Phe Ser Glu Ile Arg1 5 10 15
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#60210#62 28#60211#62 71#60212#62 PRT#60213#62 人#60400#62 28Ile Ala Thr Ash Leu Gln Glu Ile Arg Asn Gly Phe Ser Asp Ile Arg1 5 10 15Gly Ser Val Gln Ala Lys Asp Gly Ash Ile Asp Ile Arg Ile Leu Arg20 25 30Arg Thr Glu Ser Leu Gln Asp Thr Lys Pro Ala Ash Arg Cys Cys Leu35 40 45Leu Arg His Leu Leu Arg Leu Tyr Leu Asp Arg Val Phe Lys Asn Tyr50 55 60Gln Thr Pro Asp His Tyr Thr65 70#60210#62 29#60211#62 92#60212#62 PRT#60213#62 人#60400#62 29Ile Ala Thr Asn Leu Gln Glu Ile Arg Asn Gly Phe Ser Asp Ile Arg1 5 10 15Gly Ser Val Gln Ala Lys Asp Gly Asn Ile Asp Ile Arg Ile Leu Arg20 25 30Arg Thr Glu Ser Leu Gln Asp Thr Lys Pro Ala Asn Arg Cys Cys Leu35 40 45Leu Arg His Leu Leu Arg Leu Tyr Leu Asp Arg Val Phe Lys Asn Tyr50 55 60Gln Thr Pro Asp His Tyr Thr Leu Arg Lys Ile Ser Ser Leu Ala Asn65 70 75 80Ser Phe Leu Thr Ile Lys Lys Asp Leu Arg Leu Cys85 90#60210#62 30#60211#62 82#60212#62 PRT#60213#62 人#60400#62 30Leu Asp Arg Val Phe Lys Asn Tyr Gln Thr Pro Asp His Tyr Thr Leu1 5 10 15Arg Lys Ile Ser Ser Leu Ala Asn Ser Phe Leu Thr Ile Lys Lys Asp20 25 30Leu Arg Leu Cys His Ala His Met Thr Cys His Cys Gly Glu Glu Ala35 40 45Met Lys Lys Tyr Ser Gln Ile Leu Ser His Phe Glu Lys Leu Glu Pro50 55 60Gln Ala Ala Val Val Lys Ala Leu Gly Glu Leu Asp Ile Leu Leu Gln65 70 75 80Trp Met#60210#62 31#60211#62 36#60212#62 PRT#60213#62 人#60400#62 31Leu Asp Arg Val Phe Lys Asn Tyr Gln Thr Pro Asp His Tyr Thr Leu1 5 10 15Arg Lys Ile Ser Ser Leu Ala Asn Ser Phe Leu Thr Ile Lys Lys Asp20 25 30Leu Arg Leu Cys35#60210#62 32#60211#62 61#60212#62 PRT#60213#62 人#60400#62 32Leu Ala Asn Ser Phe Leu Thr Ile Lys Lys Asp Leu Arg Leu Cys His1 5 10 15Ala His Met Thr Cys His Cys Gly Glu Glu Ala Met Lys Lys Tyr Ser20 25 30Gln Ile Leu Ser His Phe Glu Lys Leu Glu Pro Gln Ala Ala Val Val35 40 45Lys Ala Leu Gly Glu Leu Asp Ile Leu Leu Gln Trp Met50 55 60#60210#62 33#60211#62 756#60212#62 DNA#60213#62 Mus musculus#60220#62
#60221#62 CDS#60222#62 (71)...(532)#60400#62 33tgggagacat cgatagccct gattgatctc tttgaatttt cgcttctggt ctccaggatc60taggtgtaag atg aaa ggc ttt ggt ctt gcc ttt gga ctg ttc tcc gct 109Met Lys Gly Phe Gly Leu Ala Phe Gly Leu Phe Ser Ala1 5 10gtg ggt ttt ctt ctc tgg act cct tta act ggg ctc aag acc ctc cat 157Val Gly Phe Leu Leu Trp Thr Pro Leu Thr Gly Leu Lys Thr Leu His15 20 25ttg gga agc tgt gtg att act gca aac cta cag gca ata caa aag gaa 205Leu Gly Ser Cys Val Ile Thr Ala Asn Leu Gln Ala Ile Gln Lys Glu30 25 40 45ttt tct gag att cgg gat agt gtg tct ttg gat agg tgc tgc ttc ctt 253Phe Ser Glu Ile Arg Asp Ser Val Ser Leu Asp Arg Cys Cys Phe Leu50 55 60cgt cat cta gtg aga ttc tat ctg gac agg gta ttc aaa gtc tac cag 301Arg His Leu Val Arg Phe Tyr Leu Asp Arg Val Phe Lys Val Tyr Gln65 70 75acc cct gac cac cat acc ctg aga aag atc agc agc ctc gcc aac tcc 349Thr Pro Asp His His Thr Leu Arg Lys Ile Ser Ser Leu Ala Asn Ser80 85 90ttt ctt atc atc aagaag gac ctc tca gtc tgt cat tct cac atg gca 397Phe Leu Ile Ile Lys Lys Asp Leu Ser Val Cys His Ser His Met Ala95 100 105tgt cat tgt ggg gaa gaa gca atg gag aaa tac aac caa att ctg agt 445Cys His Cys Gly Glu Glu Ala Met Glu Lys Tyr Asn Gln Ile Leu Ser110 115 120 125cac ttc ata gag ttg gaa ctt cag gca gcg gtg gta aag gct ttg gga 493His Phe Ile Glu Leu Glu Leu Gln Ala Ala Val Val Lys Ala Leu Gly130 135 140gaa cta ggc att ctt ctg aga tgg atg gag gag atg cta tagatgaaag 542Glu Leu Gly Ile Leu Leu Arg Trp Met Glu Glu Met Leu145 150tggataggct gctgagaaca ctcctgtcca agaatctcag acctcagcac catgaagaca 602tggccccagg tgctggcatt tctactcaag agttccagtc ctcagcacca cgaagatggc 662ctcaaaccac cacccctttg tgatataact tagtgctagc tatgtgtata ttatttctac 722attattggct cccttatgtg aatgccttca tgtg 756#60210#62 34#60211#62 154#60212#62 PRT#60213#62 Mus musculus#60400#62 34Met Lys Gly Phe Gly Leu Ala Phe Gly Leu Phe Ser Ala Val Gly Phe1 5 10 15Leu Leu Trp Thr Pro Leu Thr Gly Leu Lys Thr Leu His Leu Gly Ser20 25 30Cys Val Ile Thr Ala Asn Leu Gln Ala Ile Gln Lys Glu Phe Ser Glu35 40 45Ile Arg Asp Ser Val Ser Leu Asp Arg Cys Cys Phe Leu Arg His Leu50 55 60Val Arg Phe Tyr Leu Asp Arg Val Phe Lys Val Tyr Gln Thr Pro Asp65 70 75 80His His Thr Leu Arg Lys Ile Ser Ser Leu Ala Asn Ser Phe Leu Ile85 90 95Ile Lys Lys Asp Leu Ser Val Cys His Ser His Met Ala Cys His Cys100 105 110Gly Glu Glu Ala Met Glu Lys Tyr Asn Gln Ile Leu Ser His Phe Ile115 120 125Glu Leu Glu Leu Gln Ala Ala Val Val Lys Ala Leu Gly Glu Leu Gly130 135 140Ile Leu Leu Arg Trp Met Glu Glu Met Leu145 150#60210#62 35#60211#62 120#60212#62 PRT#60213#62 Mus musculus#60400#62 35Leu Lys Thr Leu His Leu Gly Ser Cys Val Ile Thr Ala Asn Leu Gln1 5 10 15Ala Ile Gln Lys Glu Phe Ser Glu Ile Arg Asp Ser Val Ser Leu Asp20 25 30Arg Cys Cys Phe Leu Arg His Leu Val Arg Phe Tyr Leu Asp Arg Val35 40 45Phe Lys Val Tyr Gln Thr Pro Asp His His Thr Leu Arg Lys Ile Ser50 55 60Ser Leu Ala Asn Ser Phe Leu Ile Ile Lys Lys Asp Leu Ser Val Cys65 70 75 80His Ser His Met Ala Cys His Cys Gly Glu Glu Ala Met Glu Lys Tyr85 90 95Asn Gln Ile Leu Ser His Phe Ile Glu Leu Glu Leu Gln Ala Ala Val100 105 110Val Lys Ala Leu Gly Glu Leu Gly Ile Leu Leu Arg Trp Met Glu Glu115 120 125Met Leu130#60210#62 36#60211#62 27#60212#62 DNA#60213#62 人#60400#62 36agattctatc tggacagggt attcaaa 27#60210#62 37#60211#62 17#60212#62 DNA#60213#62 人#60400 #62 37gcgaggctga tctttct 17#60210#62 38#60211#62 25#60212#62 DNA#60213#62 Mus musculis#60400#62 38tggcgaggct gctgatcttt ctcag 25#60210#62 39#60211#62 25#60212#62 DNA#60213#62 Mus musculis#60400#62 39ctttatgtct ttcaaagact cagtc 25
#60210#62 40#60211#62 26#60212#62 DNA#60213#62 Mus musculis#60400#62 40catcagaatt ttaaggacga ctgagt 26#60210#62 41#60211#62 25#60212#62 DNA#60213#62 Mus musculis#60400#62 41ggtggtcagg ggtctggtag acttt 25#60210#62 42#60211#62 23#60212#62 DNA#60213#62 Mus musculis#60400#62 42ggtgcatatt cctggtggct aga23#60210#62 43#60211#62 25#60212#62 DNA#60213#62 Mus musculis#60400#62 43attgcagtgt aagggaatac agaga 2權利要求
1．編碼多肽的分離多核苷酸，所說的多肽與選自SEQ ID No2、SEQ ID No4、SEQ ID No12、SEQ ID No13、SEQ ID No19、SEQ IDNo20、SEQ ID No25、SEQ ID No26、SEQ ID No34和SEQ ID No35的一種或多種多肽有至少90％相同。
2．權利要求1的分離多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼含有選自SEQ ID No2、SEQ ID No4、SEQ ID No12、SEQ ID No13、SEQ IDNo19、SEQ ID No20、SEQ ID No25、SEQ ID No26、SEQ ID No34和SEQ ID No35之胺基酸序列的多肽。
3．權利要求1的分離多核苷酸，其中所說的多核苷酸選自SEQ IDNo1、SEQ ID No3、SEQ ID No18和SEQ ID No33。
4．編碼多肽的多核苷酸，所述多肽具有其胺基酸序列選自SEQ IDNo2、SEQ ID No4、SEQ ID No12、SEQ ID No13、SEQ ID No19、SEQ ID No20、SEQ ID No25、SEQ ID No26、SEQ ID No34和SEQID No35之多肽的帶表位部分的胺基酸序列。
5．權利要求4的分離多核苷酸，其中所說的多核苷酸編碼選自SEQ ID No14、SEQ ID No15、SEQ ID No16、SEQ ID No17、SEQ IDNo21、SEQ ID No22、SEQ ID No23、SEQ ID No24、SEQ ID No27、SEQ ID No28、SEQ ID NO28、SEQ ID No29、SEQ ID No30、SEQ IDNo31和SEQ ID No32的多肽。
6．權利要求4的分離多核苷酸，其中所說的多核苷酸編碼與選自SEQ ID No2、SEQ ID No4、SEQ ID No12、SEQ ID No13、SEQ IDNo19、SEQ ID No20、SEQ ID No25、SEQ ID No26、SEQ ID No34和SEQ ID No35的一種或多種多肽至少80％同的多肽。
7．與選自SEQ ID No2、SEQ ID No4、SEQ ID No12、SEQ ID No13、SEQ ID No19、SEQ ID No20、SEQ ID No25、SEQ ID No26、SEQ IDNo34和SEQ ID No35的一種或多種多肽至少90％相同的分離多肽。
8．權利要求7的分離多肽，其中所說的多肽選自SEQ ID No2、SEQ ID No4、SEQ ID No12、SEQ ID No13、SEQ ID No19、SEQ IDNo20、SEQ ID No25、SEQ ID No26、SEQ ID No34和SEQ ID No35。
9．含有具選自SEQ ID No2、SEQ ID No4、SEQ ID No12、SEQID No13、SEQ ID No19、SEQ ID No20、SEQ ID No25、SEQ ID No26、SEQ ID No34和SEQ ID No35之胺基酸序列的多肽中攜表位部分的胺基酸序列的多肽。
10．權利要求9的多肽，其中所說多肽選自SEQ ID No14、SEQ IDNo15、SEQ ID No16、SEQ ID No17、SEQ ID No21、SEQ ID No22、SEQ ID No23、SEQ ID No24、SEQ ID No27、SEQ ID No28、SEQ IDNO28、SEQ ID No29、SEQ ID No30、SEQ ID No31和SEQ ID No32。
11．權利要求9的多肽，其中所述的多肽與選自SEQ ID No2、SEQ ID No4、SEQ ID No12、SEQ ID No13、SEQ ID No19、SEQ IDNo20、SEQ ID No25、SEQ ID No26、SEQ ID No34和SEQ ID No35的多肽至少80％相同。
12．可選擇性地結合選自下組的多肽的抗體SEQ ID No2、SEQ IDNo4、SEQ ID No12、SEQ ID No13、SEQ ID No19、SEQ ID No20、SEQ ID No25、SEQ ID No26、SEQ ID No34、SEQ ID No35、SEQ IDNo14、SEQ ID No15、SEQ ID No16、SEQ ID No17、SEQ ID No21、SEQ ID No22、SEQ ID No23、SEQ ID No24、SEQ ID No27、SEQ IDNo28、SEQ ID NO28、SEQ ID No29、SEQ ID No30、SEQ ID No31和SEQ ID No32。
13．可與權利要求12之抗體結合的抗獨特型抗體。
全文摘要
稱為Zcyto10的哺乳動物細胞因子樣多肽,編碼它的多核苷酸,可特異結合該多肽的抗體,及可結合該抗體的抗獨特型抗體。Zcyto10有助於促進傷口的癒合並利於刺激血小板的增殖。
文檔編號A61K38/19GK1282372SQ98812428
公開日2001年1月31日 申請日期1998年11月25日 優先權日1997年11月26日
發明者D·C·肯克林, B·A·哈爾德曼, A·格羅斯曼 申請人:津莫吉尼蒂克斯公司