一種體外檢測日本血吸蟲蟲卵對吡喹酮抗藥性的方法

2023-05-21 12:03:21 1

專利名稱：一種體外檢測日本血吸蟲蟲卵對吡喹酮抗藥性的方法
技術領域：
一種體外檢測日本血吸蟲蟲卵對吡喹酮抗藥性的方法，屬於抗寄生蟲藥物技術領域。
背景技術：
日本血吸蟲病是一種危害人類健康，影響社會經濟發展的重大傳染病。吡喹酮是當前用於治療日本血吸蟲病的唯一商品化藥物。長期大規模反覆應用同一種抗蟲藥物往往會導致藥物抗藥性的產生，因此有必要建立現場監測和檢測吡喹酮抗藥性的方法。當前檢測吡喹酮抗藥性的主要方法是在疫區現場治療病人，評估化療結果，該方法時間長、病人依次性低，且存在漏查漏治現象。我們在實驗室內建立了一種體外檢測日本血吸蟲蟲卵對吡喹酮抗藥性的技術，可方便、快速、敏感檢測日本血吸蟲蟲卵對吡喹酮的抗藥性，解決了吡喹酮抗藥性難以檢測的技術難題，有利於現場監測和檢測日本血吸蟲吡喹酮抗藥性的產生。

發明內容
本發明的目的是提供一種體外檢測日本血吸蟲蟲卵對吡喹酮抗藥性的方法,解決現場監測和檢測日本血吸蟲吡喹酮抗藥性的技術問題，快速、簡便、敏感、可靠。本發明的技術方案取兩隻50 mL燒瓶，分別移入含5X 10_6 mol/L吡喹酮的生理鹽水和單一對照生理鹽水，將從日本血吸蟲感染宿主糞便中收集的100(Γ2000個蟲卵加入到含5 X 10_6 mol/L吡喹酮的生理鹽水和單一對照生理鹽水的燒瓶中，置28°C黑暗環境中24 h，後將蟲卵移入新鮮脫氯自來水中，28°C白熾燈照射下孵化毛蝴，孵化開始後每30 min用 50 mL離心管收集I次含毛蝴的自來水，加入數滴盧戈氏碘液後離心，收集毛蝴在顯微鏡下觀察並計數，計算蟲卵孵化率，實驗重複3次，通過觀察蟲卵孵化率，檢測日本血吸蟲蟲卵對吡喹酮的抗藥性。蟲卵孵化率經吡喹酮處理的日本血吸蟲蟲卵孵化出的毛蝴數與經生理鹽水浸泡的日本血吸蟲蟲卵孵化出的毛蝴數之比。吡喹酮藥液為吡喹酮溶於I % 二甲基亞碸(DMSO)中配製成濃度為1Χ1(Γ3 mol/L 與水稀釋備用。生理鹽水為9 g氯化鈉溶於1000 mL蒸餾水中配製而成。盧戈氏碘液為5%碘、10%碘化鉀和脫氯水配製而成。一種體外檢測日本血吸蟲蟲卵對吡喹酮抗藥性的方法，先在50 mL燒瓶中加入含 5X10_6 mol/L吡喹酮的生理鹽水溶液，將從日本血吸蟲感染宿主糞便中收集的100(Γ2000 個蟲卵加入溶液中，置28°C黑暗環境中放置24 h，後將蟲卵移入新鮮脫氯自來水中，28°C白熾燈照射下孵化毛蝴，孵化開始後每30 min用50 mL離心管收集I次含毛蝴的自來水，加入數滴盧戈氏碘液後離心，收集毛蝴在顯微鏡下觀察並計數，計算蟲卵孵化率，實驗設生理鹽水對照，重複6次，在5X10_6 mol/L吡喹酮藥液作用24 h後，日本血吸蟲蟲卵孵化率〉
3O,即認為該日本血吸蟲蟲卵對吡喹酮具有抗藥性。本發明的有益效果一種體外檢測日本血吸蟲蟲卵對吡喹酮抗藥性的方法,快速、 簡便、敏感、可靠，適合現場快速檢測和監測日本血吸蟲吡喹酮抗藥性的產生，可解決日本血吸蟲吡喹酮抗藥性現場檢測和監測的技術問題。
具體實施例方式實施例I :日本血吸蟲吡喹酮敏感株蟲卵對吡喹酮的敏感性測定
取兩隻50 mL燒瓶，分別移入含5X 10_6 mol/L吡喹酮的生理鹽水和單一參照生理鹽水,將從日本血吸蟲四川敏感株感染宿主糞便中收集的100(Γ2000個蟲卵加入到燒瓶中， 置28°C黑暗環境中24 h，後將蟲卵移入新鮮脫氯自來水中，28 °C白熾燈照射下孵化毛蝴。 孵化開始後每30 min用50 mL離心管收集I次含毛蝴的自來水，加入數滴盧戈氏碘液後離心，收集毛蝴在顯微鏡下觀察並計數，計算蟲卵孵化率。實驗重複3次。結果顯示，在經 5X10_6 mol/L吡喹酮作用24 h後，四川敏感株蟲卵的孵化率為O。實施例2 :日本血吸蟲吡喹酮敏感株蟲卵對吡喹酮的敏感性測定
取兩隻50 mL燒瓶，分別移入含5X 10_6 mol/L吡喹酮的生理鹽水和單一參照生理鹽水，將從日本血吸蟲安徽敏感株感染宿主糞便中收集的100(Γ2000個蟲卵加入到燒瓶中， 置28°C黑暗環境中24 h，後將蟲卵移入新鮮脫氯自來水中，28°C白熾燈照射下孵化毛蝴。 孵化開始後每30 min用50 mL離心管收集I次含毛蝴的自來水，加入數滴盧戈氏碘液後離心，收集毛蝴在顯微鏡下觀察並計數，計算蟲卵孵化率。實驗重複3次。結果顯示，在經 5X10_6 mol/L吡喹酮作用24 h後，安徽敏感株蟲卵的孵化率為O。實施例3 :日本血吸蟲吡喹酮敏感株蟲卵對吡喹酮的敏感性測定
取兩隻50 mL燒瓶，分別移入含5X 10_6 mol/L批喹酮的生理鹽水和單一參照生理鹽水， 將從日本血吸蟲湖南敏感株感染宿主糞便中收集的100(Γ2000個蟲卵加入到燒瓶中，置28 °C黑暗環境中24 h，後將蟲卵移入新鮮脫氯自來水中，28°C白熾燈照射下孵化毛蝴。孵化開始後每30 min用50 mL離心管收集I次含毛蝴的自來水，加入數滴盧戈氏碘液後離心，收集毛蝴在顯微鏡下觀察並計數，計算蟲卵孵化率。實驗重複3次。結果顯示，在經5X10_6 mol/L吡喹酮作用24 h後，湖南敏感株蟲卵的孵化率為O。實施例4 :日本血吸蟲吡喹酮敏感株蟲卵對吡喹酮的敏感性測定
取兩隻50 mL燒瓶，分別移入含5X 10_6 mol/L吡喹酮的生理鹽水和單一參照生理鹽水,將從日本血吸蟲江蘇敏感株感染宿主糞便中收集的100(Γ2000個蟲卵加入到燒瓶中， 置28°C黑暗環境中24 h，後將蟲卵移入新鮮脫氯自來水中，28 °C白熾燈照射下孵化毛蝴。 孵化開始後每30 min用50 mL離心管收集I次含毛蝴的自來水，加入數滴盧戈氏碘液後離心，收集毛蝴在顯微鏡下觀察並計數，計算蟲卵孵化率。實驗重複3次。結果顯示，在經 5X10_6 mol/L吡喹酮作用24 h後，江蘇敏感株蟲卵的孵化率為O。實施例5 :日本血吸蟲吡喹酮抗性株蟲卵對吡喹酮的敏感性測定
取兩隻50 mL燒瓶，分別移入含5X 10_6 mol/L吡喹酮的生理鹽水和單一參照生理鹽水,將從日本血吸蟲江蘇抗性株感染宿主糞便中收集的100(Γ2000個蟲卵加入到燒瓶中， 置28°C黑暗環境中24 h，後將蟲卵移入新鮮脫氯自來水中，28 °C白熾燈照射下孵化毛蝴。 孵化開始後每30 min用50 mL離心管收集I次含毛蝴的自來水，加入數滴盧戈氏碘液後離心，收集毛蝴在顯微鏡下觀察並計數，計算蟲卵孵化率。實驗重複3次。結果顯示，在經 5X10_6 mol/L吡喹酮作用24 h後，江蘇抗性株蟲卵的孵化率為(11. 2±3. 5) %。實施例6 :日本血吸蟲吡喹酮抗性株蟲卵對吡喹酮的敏感性測定
取兩隻50 mL燒瓶，分別移入含5X 10_6 mol/L吡喹酮的生理鹽水和單一參照生理鹽水,將從日本血吸蟲湖南抗性株感染宿主糞便中收集的100(Γ2000個蟲卵加入到燒瓶中， 置28°C黑暗環境中24 h，後將蟲卵移入新鮮脫氯自來水中，28 °C白熾燈照射下孵化毛蝴。 孵化開始後每30 min用50 mL離心管收集I次含毛蝴的自來水，加入數滴盧戈氏碘液後離心，收集毛蝴在顯微鏡下觀察並計數，計算蟲卵孵化率。實驗重複3次。結果顯示，在經 5X10_6 mol/L吡喹酮作用24 h後，湖南抗性株蟲卵的孵化率為(17. 5±6. 7) %。
權利要求
1.一種體外檢測日本血吸蟲蟲卵對吡喹酮抗藥性的方法，其特徵在於取兩隻50 mL燒瓶，分別移入含5X 10_6 mol/L吡喹酮的生理鹽水和單一對照生理鹽水，將從日本血吸蟲感染宿主糞便中收集的100(Γ2000個蟲卵分別移入含5Χ 10_6 mol/L吡喹酮的生理鹽水和單一對照生理鹽水的燒瓶中，置28°C黑暗環境中24 h，後將蟲卵移入新鮮脫氯自來水中，280C 白熾燈照射下孵化毛蝴，孵化開始後每30 min用50 mL離心管收集I次含毛蝴的自來水， 加入數滴盧戈氏碘液後離心，收集毛蝴在顯微鏡下觀察並計數，計算蟲卵孵化率；設生理鹽水對照，重複3次，通過觀察蟲卵孵化率，檢測日本血吸蟲蟲卵對吡喹酮的抗藥性。
2.根據權利權求I所述的體外檢測日本血吸蟲蟲卵對吡喹酮抗藥性的方法,其特徵在於蟲卵孵化率，經吡喹酮處理的日本血吸蟲蟲卵孵化出的毛蝴數與經生理鹽水浸泡的日本血吸蟲蟲卵孵化出的毛蝴數之比。
3.根據權利權求I所述的體外檢測日本血吸蟲蟲卵對吡喹酮抗藥性的方法,其特徵在於吡喹酮藥液為吡喹酮溶於I %二甲基亞碸DMSO中配製成濃度為1X10_3 mol/L與水稀釋備用。
4.根據權利權求I所述的體外檢測日本血吸蟲蟲卵對吡喹酮抗藥性的方法,其特徵在於生理鹽水為9 g氯化鈉溶於1000 mL蒸餾水中配製而成。
5.根據權利權求I所述的體外檢測日本血吸蟲蟲卵對吡喹酮抗藥性的方法,其特徵在於盧戈氏碘液為5%碘、10%碘化鉀和脫氯水配製而成。
6.如權利要求1、2、3或4所述的體外檢測日本血吸蟲蟲卵對吡喹酮抗藥性的方法，其特徵在於先在50 mL燒瓶中加入含5 X 10_6 mol/L吡喹酮的生理鹽水溶液，將從日本血吸蟲感染宿主糞便中收集的100(Γ2000個蟲卵加入溶液中，置28°C黑暗環境中放置24 h，後將蟲卵移入新鮮脫氯自來水中，28°C白熾燈照射下孵化毛蝴，孵化開始後每30 min用50 mL 離心管收集I次含毛蝴的自來水，加入數滴盧戈氏碘液後離心，收集毛蝴在顯微鏡下觀察並計數，計算蟲卵孵化率，實驗設生理鹽水對照，重複6次，在5X 10_6 mol/L吡喹酮藥液作用24 h後，日本血吸蟲蟲卵孵化率〉0，即認為該日本血吸蟲蟲卵對吡喹酮具有抗藥性。
全文摘要
一種體外檢測日本血吸蟲蟲卵對吡喹酮抗藥性的方法，屬於抗寄生蟲藥物技術領域。本發明方法將從日本血吸蟲感染宿主糞便中收集的1000~2000個蟲卵分別移入含5×10-6mol/L吡喹酮的生理鹽水和單一對照生理鹽水的50mL燒瓶中，置28℃黑暗環境中24h，後將蟲卵移入新鮮脫氯自來水中，28℃白熾燈照射下孵化毛蚴，孵化開始後每30min用50mL離心管收集1次含毛蚴的自來水，加入數滴盧戈氏碘液後離心，收集毛蚴在顯微鏡下觀察並計數，計算蟲卵孵化率；設生理鹽水對照，重複3次，通過觀察蟲卵孵化率，檢測日本血吸蟲蟲卵對吡喹酮的抗藥性。本發明方法快速、簡便、敏感、可靠，適合現場快速檢測和監測日本血吸蟲吡喹酮抗藥性的技術問題。
文檔編號G01N33/50GK102608306SQ20111042738
公開日2012年7月25日 申請日期2011年12月20日 優先權日2011年12月20日
發明者戴建榮, 曲國立, 李洪軍, 梁幼生, 汪偉, 邢雲天 申請人:江蘇省血吸蟲病防治研究所