用於促進肉型家禽生長的方法和組合物的製作方法

2023-06-09 15:47:41 5

專利名稱：用於促進肉型家禽生長的方法和組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及促進未成熟和正發育動物的生長特性的方法，該動物為獲得同樣的效果正接受動物飼料和飼料添加劑。
背景技術：
肉雞(broiler chick)開食料(starter diets)含有相當數量的粗蛋白。大部分粗蛋白從傳統的飼料組分如大豆粗粉中獲得。大豆粗粉(48%粗蛋白含量)中約90%的粗蛋白對於家禽是高度可消化的(國家研究理事會(1994).家禽的營養需求.9th修訂版.國家研究院出版社.華盛頓區)。雖然傳統的穀類-大豆粗粉開食料被認為是高度可消化的，但他們常含有多種複雜蛋白，由於雛雞在生命早期缺乏必要的固有酶而不容易被消化(Uni等，(1999)家禽科學.78 =215-222)。已建議在肉雞食料中加入蛋白酶，但將蛋白酶加入穀物類基礎的食料中的許多早期工作在禽類生長特性中沒有帶來任何改進(Jensen等，家禽科學· 36 :919-921)。最近，用酶混合物，包括蛋白酶和澱粉酶添加到家禽食料中已在生長特性中產生了一些改進(Greenwood 等(2002)，家禽科學.81 (增刊.I) 25 ;Burrows 等(2002)，家禽科學.81(增刊· I) 29 ；Short ^ (2002)，家禽科學.81 (增刊· I) :136)。用含有木聚糖酶、蛋白酶和澱粉酶混合物的酶製劑添加穀類-大豆肉雞開食料導致在14天和42天體重的促進，而對飼料轉化率沒有顯著影響(Greenwood等，(2002)見前)。用同樣的酶混合物添加穀物-大豆為基礎的鴨食料，酶的添加導致促進體重增加以及飼料轉化率(Buirows等，(2002)見前)。家禽飼料進一步包含一些複雜的抗營養的和/或抗消化的化合物。一些化合物，如非澱粉多糖，吸收水到食糜的黏性物質中，其中營養物不會輕易被吸收(Odetallah，2000 ；0detallah等.(2002)見前)。由於食糜粘度增加，消化酶和養分的擴散率降低，因此通過腸細胞阻礙養分的吸收。由於食糜粘度增加，脂分子形成和吸收也降低，因此減少了許多脂溶性化合物的吸收，包括脂溶性維生素，色素和脂類(Ferket和Veldkamp (1999)在1998世界家禽科學協會論文集，P43-52)。因此，通過內溶酶活性達到的粘度降低在餵食高粘度穀類的雛雞中起著可見的促進作用，並且多種酶的相對效力顯示與其降低粘度的能力相關(Rotter 等，(1990) J Sci. Food Agric. 50 :19-27)。
PffD-I角蛋白酶是一種最初從地衣芽孢桿菌PWD-I的生長培養基中純化得到的酶(Williams 等，(1990) Appl. Environ. Microbiol. 56 :1509-1515 ；Lin 等，(1992) Appl.Environ. Microbiol. 58 :3271-3275)。PffD-I角蛋白酶水解寬範圍的蛋白底物，包括酪蛋白、膠原蛋白、彈性蛋白和角蛋白(Shih (2001)在農業科學與技術國際會議論文集，北京，中國，P244-247)。PWD-I角蛋白酶已用於通過將商業化的羽毛(feather)粉和無細胞的角蛋白酶孵育過夜生產水解的羽毛粉(Carter(1998)細菌角蛋白酶測定法的發展和養分的應用.博士論文，美國北卡羅來納州大學，Raleigh，NC)。也可參見美國專利No. 4，908，220 ；No. 5，186，961 ；以及 Shih 的 No. 5，063，161Shih 等。儘管如前所述，仍然需要另外的提高肉雞生長特性的方法和達到同樣目的的動物飼料添加劑。發明概述本發明提供提高接受動物飼料的未成熟和正發育動物生長特性的方法和組合物。

本發明一方面涉及一種養殖肉型家禽的方法，包括將穀類-大豆粗粉作為家禽食料餵養肉型家禽，其中飼料進一步包括對提高肉型家禽體重有效的一定數量的角蛋白酶。本發明的另一方面涉及一種養殖肉型家禽的方法，包括將穀類-大豆粗粉作為家禽開食料餵養肉型家禽，其中飼料進一步包括對提高肉型家禽體重有效的一定數量的角蛋白酶。本發明更進一步的方面涉及促進肉型家禽中動物飼料飼料利用率的方法，包括將穀類-大豆粗粉作為家禽食料餵養肉型家禽，其中飼料進一步包括對促進肉型家禽中動物飼料飼料利用率有效的一定數量的角蛋白酶。本發明另外的方面涉及提高肉型家禽中動物飼料消化率的方法，包括將穀類-大豆粗粉作為家禽食料餵養肉型家禽，其中飼料進一步包括對提高肉型家禽中動物飼料消化率有效的一定數量的角蛋白酶。本發明的另一方面涉及減少肉型家禽中死亡率的方法，包括將穀類-大豆粗粉作為家禽開食料餵養肉型家禽，其中飼料進一步包括對減少肉型家禽中死亡率有效的一定數量的角蛋白酶。本發明更進一步的方面涉及一種基本上由角蛋白酶、蛋白和碳水化合物組成的動物飼料。 本發明另外的方面涉及生產粗角蛋白酶酶提取物的方法。本發明進一步涉及促進人工孵化禽類的營養狀況，且因而增強未成熟禽類疾病抵抗力和生存力以獲得更高水平生長特性內型家禽。發明詳述本發明上面所述以及其他方面將由此處描述的其他實施方案進行更詳細的描述。可以理解的是，本發明可以不同方式實施，不得解釋為受此處所述實施方案的限制。提供這些實施方案是為了使說明書全面而透徹，且向本領域技術人員全面傳達本發明的範圍。此處本發明說明書中使用的術語僅是為了描述特定的實施方案而不是試圖限制本發明。如本發明說明書和所附權利要求書中使用的，單數形式「一」，「一個」和「這個」試圖同樣包括複數形式，除非上下文另外清楚地指出。除非另外定義，此處使用的所有技術和科學術語具有作為本發明所屬技術領域中普通技術人員通常理解的同樣的含義。所有出版物，美國專利申請、美國專利和此處引用的其他參考物整體引用作為參考。如此處使用的，術語「肉型家禽」指本領域技術人員所理解的被生產或用於肉類消耗的任何禽類。該禽類的實施例包括，但不限於，雞、火雞、鴨、鵝、鵪鶉、雉、平胸類鳥等。如此處使用的，術語「未成熟禽類」指缺乏完全的生長、分化或發育的一些禽類。該類別具有達到確定的成熟形態或狀態的潛能。未成熟禽類可以是從約I天至50天大小的，優選約I天至21天大小的,更優選約I天至5天大小的,或具有與這些範圍內禽類可比體重的。如此處使用的，術語「正發育的禽類」指比未成熟禽類年齡更大或體重更重的一些 禽類。如此處使用的，術語「成熟禽類」指比正發育的禽類年齡更大或體重更重的一些禽類。如此處使用的，術語「肉雞」指生產或最終用於肉類消耗的未成熟雞。如此處使用的，術語「家禽食料」指能給予一些禽類以促進和維持家禽生長的食料。家禽食料可包含蛋白、維生素、礦物質、能量物質如脂肪、碳水化合物源，和添加的蛋白、抗生素，以及其他已知包括在動物飼料，尤其是，家禽食料中的物質和複合物。家禽食料包括，但不限於，開食料、生長型(grower-type)食料和育肥型(finisher_type)食料。「開食料」指可從出生或孵化出開始給予動物直到達到期望的年齡和/或體重的食料。「生長型食料」指可在完成起始生長階段後給予動物的食料。「育肥型食料」指可在發育期間直到屠宰時給予動物的食料。如此處使用的，術語「生長」或「生長特性」指在體重和/或體型(如，高度、寬度，直徑、胸圍，等等)上的增加超過在沒有實施本方法和/或給予本發明的組合物時。生長可以指在整個動物或具體組織(如，通常為肌肉組織或特定肌肉)的質量(如，體重或體型)上的增加。備選地，生長可以指示一種組織對於另一組織質量的相對增加，尤其是，肌肉組織相對於其他組織的增加(如，脂肪組織)。生長進一步涉及營養狀況和疾病抵抗力，其中營養狀況的改進和/或疾病抵抗力的增強也表明生長特性的改進。通過上面所述，按照本發明的實施方案涉及養殖肉型家禽的方法，包括餵養肉型家禽動物飼料家禽食料，其中飼料進一步包括角蛋白酶且以對提高肉型家禽體重的有效量加入到家禽食料中。家禽食料可以是動物飼料，其包括蛋白質源，例如，大豆粉。魚粉、血粉、家禽副產品(磨碎的家禽內臟)、肉粉、麥粉、油菜籽、芸苔和其組合。動物飼料進一步包括碳水化合物，例如，穀物、燕麥、大麥、高梁或其組合，可被磨成粉用於動物飼料。另外，動物飼料可包括維生素、礦物質、脂肪、抗生素和其他必要的或期望的物質或化合物。動物飼料家禽食料的非限制性實施例包括以穀類為基礎的飼料，包括穀類，如大麥、穀物、大豆、小麥、麥屬和黑麥。穀物-大豆、小麥-大豆和小麥-穀物-大豆、高梁-大豆和穀物-高梁-大豆代表按照本發明合適動物飼料的其他非限制性實施例。當家禽食料為穀物-大豆粉飼料時,穀物-大豆粉飼料包括約60%至約70%重量的穀物和約20%至約30%重量的大豆。家禽食料可進一步分為開食料、生長型食料或育肥型食料。動物飼料，及家禽食料的精確組分和物理特性，將依賴於飼料所給予的動物種類、動物年齡和/或體重，以及飼養的延續時間,且可由本領域技術人員很容易地確定。按照本發明的實施方案，養殖肉型家禽的方法不需要和角蛋白酶一起同時提供特異的含有角蛋白的底物。例如，在本發明的實施方案中，與Carter，1998中所述生產水解的羽毛粉不同，角蛋白酶可作為飼料添加劑直接添加入家禽食料中。因此，動物飼料可基本上不含角蛋白(如，不超過1%或2%重量的角蛋白)。適於實現本發明的角蛋白酶可從地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)菌株PWD-I中獲得，其在美國專利No. 4，908，220和4，959，311中描述(在此引用的所有專利文獻的說明書整體引入作為參考)。按照布達佩斯條約，該菌於1988年3月23日保藏於美國RockviIIe，MD的美國典型培養物保藏中心(ATCC)，獲得ATCC登記號No. 53757。其他用於實現本發明的角蛋白酶可從多種細菌來源獲得，如鏈黴菌。一般參見Nickerson的美國專利No. 2，988，487 ;也可參見Goktan，D，「經特定微生物利用的角質材料的分解率」(No. 207369b摘要)，Microbial Biochem. 101, 333 (1984) ；Daniels, G, 「人毛髮角蛋白經犬小孢 子菌的消化」，J. Gen. Microbiol. 8，289 (1953) ;Koh，W等，「黃麴黴和黑麴黴來源的角蛋白水解酶」，Bacillus. Aust. J. Biol. Sci. 274 (1959) ；Molyneaux, G. S, 「羊毛經角蛋白水解桿菌的消化」,Aust. J. Biol. Sci. 274(1959) ；) ；Noval, J 和 Nickerson, W, 「天然角蛋白經鏈黴菌的分解」，J. Bacteriol. 77，251 (1959) ；Kapica, L和Blank, F，「角蛋白作為唯一氮源的近平滑假絲酵母的生長」，Dermatologica 117,433 (1958) ；Kapica, L 和 Blank, F,「角蛋白作為唯一氮源的白色酵母的生長」，Dermatologica 115,81 (1957)。用於實現本發明的角蛋白酶可通過如下方式獲得在允許編碼的角蛋白酶表達的條件下，培育細胞，過濾培養基以去除細胞及通過超濾法收集和濃縮所留上清而獲得角蛋白酶。雖然此處以地衣芽孢桿菌菌株作為例證，可以想到的是其他含有編碼角蛋白酶核酸序列的真核和原核微生物對於生產本發明的動物飼料添加劑也是有用的。含有編碼角蛋白酶核酸序列的真核和原核微生物可包括天然產生該酶的菌株與經遺傳修飾表達角蛋白酶的菌株。一般而言，蛋白重組產物的生產需要編碼所述蛋白的核酸序列以適合蛋白在宿主細胞中表達的形式插入重組表達載體中。適合表達的形式指重組表達載體含有一個或多個以允許核酸轉錄為mRNA且mRNA翻譯為蛋白的方式可操作地連接到編碼角蛋白酶蛋白的核酸的調節序列。調節序列可包括啟動子、增強子和其他表達控制元件(如，多腺苷酸化信號)。該調節序列為本領域技術人員所知，且在Goeddel D.D,ed.基因表達技術，聖地牙哥學校出版社，加拿大(1991)中描述。應當理解表達載體的構建將依賴於一些因素如所要轉染的宿主細胞的選擇和/或所需的表達水平。核酸序列或含有編碼角蛋白酶蛋白核酸序列的表達載體通過轉化細胞的標準技術導入宿主細胞，其可能是真核或原核來源的。轉化宿主細胞的合適方法可在SambiOOk等(分子克隆實驗手冊，第3版，冷泉港實驗室出版社(2000))以及其他實驗室手冊中找到。用編碼角蛋白酶蛋白核酸序列轉化的宿主細胞的數目將至少部分依賴於所用重組表達載體和轉化技術的類型。核酸可導入宿主細胞進行角蛋白酶蛋白的瞬時表達，或更常見地，進行角蛋白酶蛋白的長期表達，其中核酸序列穩定整合到宿主細胞基因組中或在宿主細胞中以穩定附加體存在。一旦表達，角蛋白酶蛋白可作為分泌肽從培養基中回收，當直接表達沒有分泌信號時，也可從宿主細胞裂解物中回收。真核微生物如酵母培養物可用攜帶編碼角蛋白酶的核酸序列的載體轉化。參見，如，美國專利No. 4，745，057。雖然許多其他菌株通常是可用的，釀酒酵母是低等真核宿主微生物中最常用的。酵母載體含有2μ酵母質粒複製起點或自主複製序列(ARS)、啟動子、如美國專利No. 5，712，147提供的編碼角蛋白酶的DNA、聚腺苷酸化序列以及轉錄終止子和所選擇的基因。不例性的質粒為 YRp7 (Stinchcomb 等,(1979)Nature 282 :39 ;Kingsman 等,(1979)Gene 7 :141 ;Tschemper 等，(1980)Gene 10:157)。酵母載體中合適的啟動序列包括金屬硫蛋白、3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman等，(1980) JBiol. Chem. 255 :2073)或其他糖分解酶(Hess 等,(1968) J. Adv. Enzyme Reg. 7 :149 ;Holland 等,(1978)Biochemistry 17 4900)的啟動子。用於酵母表達的合適載體和啟動子在EPO公開專利No. 73，657中進一步描述。更進一步，真菌菌株如木黴屬(如，T. Longibrachiatum、裡氏木黴或綠色木黴)在表達分泌酶中尤其有用。用於生產角蛋白酶的原核宿主細胞包括革蘭氏陰性或革蘭氏陽性菌，例如，大腸 桿菌(E.coli)或芽孢桿菌屬。典型的宿主細胞有E. coliW3110(ATCC 27，325)、Ε· coli B，E. coliX1776(ATCC 31，537)、E. coli294(ATCC 31,446)。合適的真核和微生物載體的大量變體也是可利用的。E.coli—般用pBR322轉化。重組微生物表達載體中最常用的啟動子包括內醯胺酶(青黴素酶)和半乳糖啟動子系統(Chang等，(1978)Nature 275 615 ；GoeddeI 等(1979)Nature 281 :544)、色氨酸(trp)啟動子系統(Goeddel 等，(1980)Nucleic Acids Res. 8 :4057 ;ΕΡ0 公開專利 No. 36，776)和 t ac 啟動子(De Boer 等，(1983)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21)。啟動子和SD序列(用於原核宿主表達)可操作地連接在編碼角蛋白酶的DNA上，即，它們定位於能啟動角蛋白酶信使RNA從DNA的轉錄。芽胞桿菌屬優選用於角蛋白酶的產生。用於芽孢桿菌屬的重組表達載體是本領域技術人員熟知的。芽孢桿菌菌株可以是嗜鹼芽孢桿菌、解澱粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、堅強芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽胞桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和蘇雲金芽孢桿菌。在一優選的實施方案中，利用地衣芽胞桿菌。在某些實施方案中，利用地衣芽胞桿菌菌株T399D或PWD-I。如此處提供的，角蛋白酶可通過在上述條件下培養宿主細胞而生產，其允許編碼的角蛋白酶的表達和收集表達的角蛋白酶。宿主細胞在細胞生長的條件下培養，然後在引起編碼的角蛋白酶表達的條件下培養，或細胞同時生長和表達編碼的角蛋白酶。所述條件對於本領域技術人員是熟知的且可隨著宿主細胞和期望的酶表達水平的量而改變。在某些實施方案中，培養轉化宿主細胞的培養基可以是任何適於角蛋白酶生產的培養基。角蛋白酶通過常規技術從培養基中回收，包括細胞通過離心或過濾從培養基中的分離，和上清或濾液中蛋白通過超濾法或蒸發作用的濃縮，隨後通過冷凍乾燥或噴霧乾燥凍幹。備選地，培養物上清可在未經濃縮的分離後噴霧乾燥或冷凍乾燥。角蛋白酶至少應以達到預期效果的量呈現，但角蛋白酶量的上限可基於達到的預期效果來確定。在某些實施方案中，動物飼料包括約O. 01%至約20%重量的地衣芽胞桿菌PWD-I角蛋白酶。另外，用於實現本發明的角蛋白酶可以是粗製形式或純化形式。選擇性地，細胞可在液體生長培養基中裂解(以化學方法或物理方法)以生產粗製的，無細胞提取物。製備該提取物的其他方法對於本領域技術人員是顯而易見的。粗製角蛋白酶可以任何合適的形式加入到飼料中，如以含水形式或凍幹形式。在某些實施方案中，粗製角蛋白酶為凍幹形式。純化的(或基本純化的)角蛋白酶可通過按照已知技術將上述粗製角蛋白酶分離為其單一組分而獲得。通常參見W. Jakoby，Ed，酶純化和相關技術，酶學方法，第22卷(1971)和第104卷，pt.C(1984)，學院出版社，紐約。許多合適的分離方法，如柱層析，都是本領域技術人員所知的。單一組分的蛋白可由其降解角質材料的能力而得到篩選，且最能降解角質材料的組分則包含角蛋白酶。如粗製角蛋白酶一樣，純化的角蛋白酶可以任何形式應用，包括含水形式和凍幹形式。本發明的實施方案進一步涉及在肉型家禽中促進動物飼料利用率的方法，包括餵養肉型家禽動物飼料家禽食料，其中飼料進一步包括有效量的角蛋白酶，其能促進提供給肉型家禽的動物飼料的飼料利用率。動物飼料可包括上述動物飼料和，在特定實施方案 PWD-I角蛋白酶。如上所述，角蛋白酶可以是粗製提取物或純化形式的酶。促進飼料利用率指相對於在沒有實施該方法和/或給予本發明組合物時所呈現的飼料轉化率(FCR)的降低。FCR是飼料消耗總量相對於動物體重增加的比率。在本發明的一個實施方案中，改進的飼料利用率可通過在不伴隨腸能量消耗時提高胃腸養分吸收而實現。在本發明另外的實施方案中，改進的飼料利用率可通過提高動物飼料的可消化性而實現。在本發明另外的實施方案中，改進的飼料利用率可通過降低動物飼料粘度而實現。在特定的實施方案中，本發明涉及在肉型家禽中提高動物飼料可消化性的方法，包括餵養肉型家禽動物飼料家禽食料，其中飼料進一步包括有效量的地衣芽胞桿菌PWD-I角蛋白酶，其能提高肉型家禽中動物飼料的可消化性。動物飼料可包括上述的動物飼料和，在特定的實施方案中，可以是穀物-大豆粉。角蛋白酶可包括上述角蛋白酶，其包括，但不限於，地衣芽胞桿菌PWD-I角蛋白酶。如上所述，角蛋白酶可以是粗製提取物或純化形式的酶。提高動物飼料的可消化性指在不提高飼料攝取和養分攝入時提高動物腸中養分吸收的有效性。在本發明某些實施方案中，動物腸中物質的粘度或助消化劑的粘度降低。在另外的實施方案中，讓養分不可利用的養分的包埋被減少。在其他實施方案中，本發明涉及在肉型家禽中降低死亡率的方法，包括餵養肉型家禽動物飼料家禽食料，其中飼料進一步包括有效量的角蛋白酶，其能降低肉型家禽的死亡率，例如，未成熟禽類，更具體地，肉雞。動物飼料可包括上述動物飼料和，在特定實施方案中，可以是穀物-大豆粉。角蛋白酶可包括上述角蛋白酶，其包括，但不限於，地衣芽胞桿菌PWD-I角蛋白酶。如上所述，角蛋白酶可以是粗製提取物或純化形式的酶。降低死亡率指在動物中出生和孵育後相對於沒有實施該方法和/或給予本發明組合物時所呈現的存活率增加或死亡率減少。死亡率可由任何因素引起，尤其是，壓力、發育不良、「飢餓(starveouts)」和疾病。在某些實施方案中，本發明在未成熟禽類中降低死亡率。在其他的實施方案中，禽類為約 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、31、32、33、34或35天大小，優選約I至21天大小，更優選約I至5天大小。在某些實施方案中，本發明涉及動物飼料，包括蛋白、碳水化合物和角蛋白酶作為主要組分。角蛋白酶為添加到動物飼料的主要成分。動物飼料可包括上述動物飼料和，在特定的實施方案中，可以是穀物-大豆粉。角蛋白酶可包括上述角蛋白酶，其包括，但不限於，地衣芽胞桿菌PWD-I角蛋白酶。如上所述，角蛋白酶可以是粗提取物或純化形式的酶。由本發明提供的動物飼料添加劑可與動物飼料直接混合，如包含大麥的飼料，以製備終飼料。可選擇性地，動物飼料添加劑可與一種或多種其他的動物飼料添加劑如維生素動物飼料添加劑、礦物質動物飼料添加劑和胺基酸動物飼料添加劑混合。所得到的包含多種不同類型成分的動物飼料添加劑可隨後以合適的量與動物飼料混合。本發明的動物飼料包括至少足夠達到預期效果量的角蛋白酶，其中角蛋白酶量的上限可基於達到的預期效果來確定。預期效果包括，但不限於，增強動物生長特性，如體重增力卩、促進飼料利用率、提高飼料可消化性和降低死亡率。加入到動物飼料的動物飼料添加劑可包含直至100%重量的角蛋白酶。包含添加劑的動物飼料包括從約O. 01%至約5%重量的角蛋白酶。在某些實施方案中，角蛋白酶為地衣芽胞桿菌PWD-I角蛋白酶。任何動物都是本發明的合適受試者，包括牛、羊、豬、貓、狗、貂和禽類，然而本發明 優選使用單胃動物。合適的受試者可以是任何年齡範圍的包括新生期動物、發育期動物和成熟動物。在某些實施方案中，合適的受試者可以是禽類，優選雞，以及更優選肉雞。在其他的實施方案中，合適的受試者為雞。在仍是其他的實施方案中，合適的受試者可以是未成熟的、正發育的或成熟的禽類。在其他的實施方案中，合適的受試者可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64或65天大小的雞，或該數值任何範圍內的雞。因此，本發明提供了許多種不同的飼料，包括寵物飼料、家禽飼料和豬飼料。本發明的動物飼料添加劑還能通過減少其能量，和/或蛋白，和/或胺基酸含量而同時維持對於動物可利用的能量、蛋白和胺基酸相同營養水平來改變傳統動物飼料。因此，相對於傳統飼料，一般包含在動物飼料中的昂貴的能量和蛋白添加劑可得到減少。下列實施例用於例證本發明，而不應解釋為對其的限制。實施例I從重組地衣芽胞桿菌PWD-I菌株中牛產角蛋白酶使用野生型地衣芽胞桿菌菌株PWD-1，設計發酵規模擴大方法用於角蛋白酶的生產。用LB培養基的燒瓶培養.燒瓶培養在Luria-Bertani (LB)培養基中進行，其按照操作說明書製備，含有1. OL蒸餾水，15g BACTO 瓊脂，IOgNaCl，IOg BACT0 胰蛋白腖，和5g酵母提取物。地衣芽胞桿菌菌株PWD-I從甘油菌種挑出在LB平板上劃線且在50°C生長8-12小時。隨後，地衣芽胞桿菌菌株PWD-I單克隆從LB平板轉入燒瓶，其含有500mlLB培養基，且在50°C生長6小時。菌種培養.地衣芽胞桿菌菌株PWD-I的菌種培養在培養基中進行，其含有0. 7g/L KH2PO4,1. 4g/L K2HPO4,0. lg/L MgSO4 · 7H20, lOg/L 脫脂大豆粉，和 O. lg/L 除泡劑。菌種培養的起始PH通過加入IM HCl或NaOH調節至7. O。500ml燒瓶培養物轉入約IOL至20L的第一階段菌種發酵罐，其含有菌種培養基，且在其中50°C生長8-12小時以達到2. 5%至5%接種物的容量。第一階段菌種培養物隨後轉入100L、250L或800L的第二階段發酵罐中，且在其中50°C生長8小時，隨後調至37°C。對於菌種培養，細胞密度在培養過程約8或10小時的時候達到至少3X IO8CFU/
Π Τ, η生產培養基.用於地衣芽胞桿菌菌株PWD-I的生產培養基含有O. 7g/L KH2PO4,I. 4g/L K2HPO4,0. lg/L MgSO4 · 7H20, lOg/L脫脂大豆粉，和O. lg/L除泡劑。生產培養的起始pH通過加入IM HCl或NaOH調節至7. O。第二階段菌種培養物轉入生產發酵罐，其含有用於最終階段培養的生產培養基。最終階段的培養在50°C進行8小時，在收穫前達到約24至30小時的總培養時間。在上述培養步驟中，培養基的起始pH調節至7. 0，但在培養過程中不提供pH控制。對於地衣芽胞桿菌菌株PWD-I最佳的溶解氧水平為約20%。接種物體積為約2. 5%至5%， 且接種物種齡為約8-12小時。對於生產培養，最高細胞密度在培養過程約20或24小時的時候達到
I.2X 109CFU/mL。最高酶活性，通過偶氮酪蛋白測定法確定，在培養過程約24至30小時的時候達到35-40A45(l/mL。生產培養基的pH值從7. O變為8. 3，但酶活性和產率維持高水平，其表明PH控制不是必要的。回收和下遊處理.在生產培養基中的酶活性在收穫前檢驗。培養上清通過離心從細胞團塊分離，隨後通過超濾法或蒸發濃縮。濃縮的液態酶隨後噴霧乾燥。可選擇地，培養上清在從細胞團塊分離後直接噴霧乾燥，不經濃縮。酶產量和酶活性.對於100L生產培養物，收穫前通過偶氮酪蛋白確定的酶活性為3，000至3，50(^/11^，細胞數目為I. 3X 109CFU/mL。100L生產培養物的總乾重為9. 12g/L，包括2. 15g/L不溶性乾重和6. 88g/L可溶性乾重。粗製酶產量約I. 75-2. Og/L。粗製酶由通過用5kDa分子量截留的膜過濾濃縮發酵上清液而製備，隨後凍幹。粗製幹酶的酶活性為約1，000, 000至約1，400，000U/g,正如通過偶氮酪蛋白測定法所確定的。粗製幹酶的總蛋白含量為約30-36%，其中約14-20%由純化的角蛋白酶組成。實施例2從重組地衣芽胞桿菌T399D中牛產角蛋白酶使用重組地衣芽胞桿菌T399D菌株(下文中為「地衣芽胞桿菌菌株Tl」)，設計發酵規模擴大方法用於角蛋白酶的生產。用LB培養基的燒瓶培養.燒瓶培養在LB培養基中進行，培養基按照操作說明書製備，含有1.0L蒸餾水，15g BACT0 瓊脂，IOgNaCl，IOg BACT0 胰蛋白腖，和5g酵母提取物。地衣芽胞桿菌菌株Tl從甘油菌種挑出在LB平板上劃線且在37°C生長18小時。隨後，地衣芽胞桿菌菌株Tl單克隆從LB平板轉入燒瓶，其含有500mlLB培養基，且在37°C生長6小時。細胞生長通過測量在660nm處(Beckman DU系列660分光光度計，Fullerton,CA)的光密度而監控。生長6小時後，測定的OD66tl超過I. O。菌種培養.地衣芽胞桿菌菌株Tl的菌種培養在培養基中進行，培養基含有0. 7g/L KH2PO4,1. 4g/L K2HPO4,0. lg/L MgSO4 · 7H20, lOg/L 脫脂大豆粉，和 0. lg/L 除泡劑。菌種培養的起始PH通過加入IM HCl或NaOH調節至7. O。500ml燒瓶培養物轉入約10L至20L的第一階段菌種發酵罐，其含有菌種培養基，且在其中37°C生長8小時以達到2. 5%至5%接種物體積。第一階段菌種培養物隨後轉入100L、250L或800L的第二階段發酵罐中，且在其中37°C生長8小時。生產培養基.用於地衣芽胞桿菌菌株Tl的生產培養基含有O. 7g/LKH2P04,1. 4g/LK2HPO4,0. lg/L MgSO4 · 7H20,13g/L 脫脂大豆粉，40g/L 澱粉、13g/L 羽毛粉，和 O. lg/L 除泡齊[J。生產培養的起始PH通過加入IM HCl或NaOH調節至7. O。第二階段菌種培養物轉入生產發酵罐，其含有用於最終階段培養的生產培養基。收穫前，最終階段的培養在37°C進行48小時。在上述培養步驟中，培養基的起始pH調節至7. 0，但在培養過程中不提供pH控制。對於地衣芽胞桿菌菌株Tl的最佳溶解氧水平為約30%。接種物體積為約2. 5%至5%，且接種物種齡為約12小時。回收和下遊處理.在生產培養基中的酶活性在收穫前檢驗。培養上清通過離心從細胞團塊分離，隨後通過超濾法或蒸發濃縮。濃縮的液態酶隨後噴霧乾燥。 可選擇地，培養上清在從細胞團塊分離後直接噴霧乾燥，不經濃縮。酶產量和酶活性.對於100L生產培養物，收穫前通過偶氮酪蛋白確定的酶活性為30，000至35，000U/mL,細胞數目為6 X 109CFU/mL。100L生產培養物的總乾重為40g/L，包括15g/L不溶性乾重和25g/L可溶性乾重。從直接乾燥的培養物上清的粗製酶產量為20g/L，通過用IOkDa分子量截留的膜過濾而得到培養濃縮物獲得的粗製酶產量為16g/L。粗製幹酶的酶活性超過1，000，000U/g，正如通過偶氮酪蛋白測定法所確定的。實施例3家禽飼料用角蛋白酶添加的材料和方法禽類和飼養.進行三個實驗。每個實驗中，192隻數天大小的肉雞稱重且隨機分在24個籠欄中，完全隨機化地設計為兩個替代設計組(Alternate Design batteries)(ffilveco,Billerica,MA) 禽類稱重,給翅膀帶上環且在5天大小(實驗I和2)或I天大小(實驗3)進行實驗處理。除了對照組每欄用8隻重複4次外，每個處理都用8隻重複5次。禽類被置於溫控的、通風、有光照(24小時/天)的房間中。在實驗期間，禽類通過飼料槽餵食器隨急餵養而水由噴嘴喝水器供給。PffD-I角蛋白酶.酶，PffD-I角蛋白酶使用標準方法(Wang和Shih (1998) RIndust. Microb. Biotech. 22 :608-616)用150-L發酵罐生產。簡單的說，地衣芽胞桿菌PWD-I (Williams等，(1990)如前)在發酵罐中50°C生長48小時。無細胞培養基通過膜超濾法濃縮且通過冷凍乾燥機乾燥。一般來說，粗製酶的產量為2. 0g/L。粗製角蛋白酶具有300，000U/g的活性，正如通過偶氮角蛋白的水解作用測定的(Lin等，(1992)如前)。飲食處理.所有食物使用最小成本的線性規劃軟體來明確表述且呈現在表I中。表I
權利要求
1.養埴肉型家禽的方法，包括 穀物-大豆粉飼料作為家禽食料餵養所述肉型家禽，所述飼料進ー步包括對提高所述肉型家禽體重有效量的地衣芽胞桿菌PWD-I角蛋白酶； 優選地，其中肉型家禽是未成熟禽類； 更優選地，其中肉型家禽是雞或豬； 更優選地，其中雞是從約I天至65天大小的； 更優選地，其中雞是從約I天至21天大小的； 更優選地，其中雞是從約I天至7天大小的； 更優選地，其中雞是肉雞。
2.權利要求I的方法，其中家禽食料是開食料，或生長型食料，或育肥型食料。
3.權利要求I的方法,其中穀物-大豆粉飼料包括從約60至70%重量的穀物， 優選地，其中穀物-大豆粉飼料包括從約20至30%重量的大豆， 更優選地,其中穀物-大豆粉飼料進ー步包括從約O. 01至約O. 20%重量的地衣芽胞桿菌PWD-I角蛋白酶， 更優選地，其中地衣芽胞桿菌PWD-I角蛋白酶是粗提取物或純化的酶。
4.養殖肉型家禽的方法,包括 穀物-大豆粉飼料作為開食料餵養所述肉型家禽， 所述飼料進ー步包括對提高所述肉型家禽體重有效量的地衣芽胞桿菌PWD-I角蛋白酶。
5.一種促進肉型家禽中動物飼料的飼料利用率的方法，包括 穀物-大豆粉飼料作為家禽食料餵養所述肉型家禽， 所述飼料進ー步包括對促進所述肉型家禽中動物飼料的飼料利用率有效量的地衣芽胞桿菌PWD-I角蛋白酶。
6.一種提高肉型家禽中動物飼料可消化性的方法，包括 穀物-大豆粉飼料作為家禽食料餵養所述肉型家禽， 所述飼料進ー步包括對提高所述肉型家禽中動物飼料的可消化性有效量的地衣芽胞桿菌PWD-I角蛋白酶。
7.一種降低肉型家禽中死亡率的方法，包括 穀物-大豆粉飼料作為開食料餵養所述肉型家禽， 所述飼料進ー步包括對降低所述肉型家禽中死亡率有效量的地衣芽胞桿菌PWD-I角蛋白酶， 優選地，其中肉型家禽是未成熟禽類， 更優選地，其中肉型家禽是肉雞或豬。
8.—種基本上由大豆粉、穀物粉，以及角蛋白酶組成的動物飼料， 優選地,其中動物飼料基本上由至少約O. 01%重量的角蛋白酶組成， 更優選地，其中角蛋白酶是粗提取物或純化的酶， 更優選地，其中角蛋白酶是地衣芽孢桿菌PWD-I角蛋白酶。
9.權利要求8的動物飼料，其中動物飼料加入到開食料中， 其中開食料是穀物-大豆粉開食料。
10.權利要求8的動物飼料，其中動物飼料是生長型食料或是育肥型食料。
全文摘要
本發明提供了促進生長特性、促進飼料利用率、提高飼料可消化性，和降低接受動物飼料的未成熟和正發育動物死亡率的方法。還提供了生產粗製角蛋白酶提取物和動物飼料添加劑以達到同樣目的的方法。
文檔編號A23K1/165GK102669443SQ20111030105
公開日2012年9月19日 申請日期2003年8月8日 優先權日2002年8月9日
發明者J·C·H·施 申請人:北卡羅萊納州立大學, 生物資源國際公司