從紅豆杉枝葉中初分離10－去乙醯基巴卡亭Ⅲ的方法
2023-06-28 02:09:11 1
專利名稱：從紅豆杉枝葉中初分離10－去乙醯基巴卡亭Ⅲ的方法
技術領域：
本發明涉及一種紅豆杉植物成分的提取方法，特別是一種從紅豆杉枝葉中用大孔吸附樹脂初分離10-去乙醯基巴卡亭III的方法。
背景技術：
10-去乙醯基巴卡亭III(10-DABIII)是抗癌藥紫杉醇(Taxol)的同系物，也是植物體內合成紫杉醇的前體成分。現已作為人工半合成紫杉醇或多烯紫杉醇的前體原料。紫杉醇或多烯紫杉醇在臨床上已應用於乳腺癌、卵巢癌、肺癌等治療，其療效好，毒副作用小，是當今抗癌藥的新秀。我國和世界上多個國家都已批准生產和臨床使用，需求量日增。以往紫杉醇的主要來源於天然紅豆杉的樹皮，而紅豆杉植物是屬國家珍稀保護植物，天然紅豆杉資源極為有限，國家嚴禁把它用作製取紫杉醇的原料，因此，紫杉醇的生產和供應由於原料缺乏遠遠不能滿足臨床治療的需要。目前，利用大規模人工栽培紅豆杉，剪取其枝葉作為原料，是解決藥源緊缺的途徑之一。紫杉醇和10-DABIII共存於紅豆杉植物中，早期研究認為歐洲短葉紅豆杉枝葉中10-DABIII含量較高，是紫杉醇含量的4倍，達到0.08％左右。申請人發現我國栽培的某些紅豆杉的枝葉含有豐富的10-DABIII，因此把10-DABIII分離出來，作為半合成紫杉醇或多烯紫杉醇的原料具有重要的意義。
目前，國外文獻及專利報導的從紅豆杉枝葉中提取10-DABIII的方法，大多是先利用乙醇或甲醇進行提取，再用其他有機溶劑萃取，萃取液濃縮後，進行多次矽膠柱層析並重結晶。中國專利申請號02136678公開了從乙醇提取過紫杉醇的紅豆杉枝葉殘渣中提取10-DABIII的方法，先用乙醇提取紅豆杉枝葉中的紫杉醇，其殘渣中除盡乙醇，再用水提取殘渣中的10-DABIII，水提取液濃縮、噴霧乾燥，高壓正相製備色譜分離，得到純品10-DABIII。此外，中國專利公開號CN1473821A公開了一種提取10-DABIII的方法，紅豆杉枝葉超細粉φ≤10μm用乙醇提取，濃縮後，浸膏用有機溶劑萃取，兩次矽膠柱層析，水解轉化，進行矽膠柱層析，重結晶等得到10-DABIII。前者雖然省去了有機溶劑萃取，但是對大量水提取液使用噴霧乾燥方法進行濃縮乾燥，能耗大，成本高；後者在初分離中都要用大量有機溶劑進行萃取，成本高，安全性差。
發明內容
本發明的目的就是提供一種利用可再生大孔吸附樹脂，吸附分離紅豆杉枝葉的含水乙醇提取液的濃縮液中的10-去乙醯基巴卡亭III，從而實現初分離10-去乙醯基巴卡亭III的方法。
本發明的目的可通過以下技術方案來實現將大孔吸附樹脂放入含10-去乙醯基巴卡亭III的紅豆杉枝葉的70～80％乙醇提取液的濃縮液的濾液中，搖動吸附3～5小時，或將大孔吸附樹脂裝填於層析柱中，讓含10-去乙醯基巴卡亭III的紅豆杉枝葉的70～80％乙醇提取液的濃縮液的濾液流經大孔吸附樹脂，進行吸附，濾液PH值5～6，吸附後，用無水乙醇洗脫被大孔吸附樹脂吸附的10-去乙醯基巴卡亭III，乙醇洗脫液濃縮後，得到含10-去乙醯基巴卡亭III的流浸膏。大孔吸附樹脂是S-8、AB-8、X-5、D4020、NKA-9或D3520。紅豆杉枝葉是南方紅豆杉、雲南紅豆杉、中國紅豆杉、東北紅豆杉、西藏紅豆杉或曼地亞紅豆杉的枝葉。
本發明充分利用了紅豆杉枝葉資源，既提取紫杉醇，又提取10-DABIII，提高了資源利用率，省去了液-液萃取步驟，減少了有機溶劑的使用量，降低了成本，安全性高，10-DABIII的回收率高。
具體實施例方式
下面結合實施例，對本發明作進一步描述。
試驗用材料南方紅豆杉、雲南紅豆杉、中國紅豆杉、東北紅豆杉、西藏紅豆杉或曼地亞紅豆杉的枝葉風乾後，粉碎成40～200目的粉末。
試驗用試劑95％食用級乙醇，由廣東豐順光明化工廠生產，分析純無水乙醇，由廣州化學試劑二廠生產，色譜純試劑甲醇、乙腈由進口分裝。
試驗用儀器900瓦超聲提取器由深圳超晉超聲工程有限公司生產，HPLC檢測使用Waters高壓液相色譜儀，色譜儀由美國Waters公司生產，高壓液相色譜條件Nova-PAK C18反相柱，3.9mm×150mm粒度4μm，流動相為甲醇∶水＝43∶57，流速1ml/min，柱溫35℃，檢測波長227nm。大孔吸附樹脂是S-8、AB-8、X-5、D4020、NKA-9或D3520，由南開大學化工廠生產。
大孔吸附樹脂用下述試劑依次處理1)蒸餾水浸泡洗滌24小時，去雜至水洗液透明；2)1mol的NaoH浸泡24小時去雜；3)蒸餾水洗至中性；4)1mol的HCL浸泡24小時去雜；5)蒸餾水洗至中性；6)無水乙醇洗到洗脫液加水不產生白色混濁為止；7)蒸餾水洗至無乙醇味為止。
試驗用紅豆杉枝葉提取液的製備採集紅豆杉枝葉風乾後，粉碎成40～200目的乾粉，稱取42g，放入500ml標準磨口玻璃三角瓶中，加入200ml的70％乙醇，裝上球形冷凝管，通入冷卻水，將三角瓶裝置放在900瓦的超聲提取器中，在28.5℃下，超聲提取30分鐘，過濾，濾渣再重複提取3次，合併4次的乙醇提取液，在旋轉蒸發器中，55℃水浴，-0.08Mpa的真空下，減壓回收乙醇至濃縮液無醇味，水性濃縮液靜置過夜，有沉澱析出，用布氏漏鬥抽濾，沉澱物作為分離紫杉醇、三尖杉寧等之用。含10-DABIII的濾液計215ml供大孔吸附樹脂富集分離10-DABIII之用。用HPLC檢測上述濾液中的10-DABIII，其含量為0.313mg/ml，總含量為67.37mg，佔紅豆杉枝葉乾粉重的0.16％。
實施例一在四個250ml玻璃三角瓶中，分別加入13.13ml紅豆杉枝葉的70％乙醇提取液的濃縮液的濾液，濾液中含4.11mg10-DABIII，分別用蒸餾水16.87ml稀釋為30ml，PH值5；再分別加入已處理好的溼基大孔吸附樹脂S-8、D4020、X-5、D3520各5g，乾重分別為1.25g、1.1g、1.35g、1.1g。
將上述四個試驗樣品瓶在20℃下放在搖床上搖動吸附4小時，搖床轉速為103轉/分，用普通定性濾紙在玻璃漏鬥中過濾，得到已吸附了10-DABIII的大孔吸附樹脂和濾液。用HPLC測定濾液中殘留的10-DABIII的含量，計算出每種大孔吸附樹脂的吸附量；吸附了10-DABIII的大孔吸附樹脂分別裝入三角瓶中，再各加入60ml無水乙醇，在室溫下置於搖床上搖動洗脫1小時，用普通定性濾紙在玻璃漏鬥中過濾，重複洗脫4次，合併4次洗脫液，定容為250ml，用HPLC檢測其中10-DABIII的含量，計算10-DABIII的洗脫量、洗脫率和回收率，見表一。含10-DABIII的乙醇洗脫液在旋轉蒸發器中，於55℃水浴，-0.08Mpa的真空減壓濃縮成流浸膏，待進一步純化之用。
吸附量＝試液中原含量-試液中殘留量洗脫率＝洗脫量/吸附量×100％回收率＝洗脫量/試液中原含量×100％表一
從表一數據看出，以上4種大孔吸附樹脂對紅豆杉枝葉含水乙醇提取液的濃縮液的過濾液中的10-DABIII均有良好的吸附和解吸附性能。1g幹樹脂吸附量除X-5為2.76mg外，其餘3種均在3mg以上。洗脫率均在90～97.7％之間。以上試驗結果表明，用大孔吸附樹脂吸附法初分離紅豆杉枝葉中的10-DABIII是可行的。
實施例二取二份各6.1ml的製備好的紅豆杉枝葉80％乙醇提取液的濃縮液的濾液，濾液中含10-DABIII 1.91mg，分別加入50ml玻璃三角瓶中，加蒸餾水8.9ml稀釋為15ml，測PH值為5.2。分別稱取已處理好的溼基大孔樹脂AB-8、NKA-9各5g，乾重分別為1.38g、1.58g；分別裝入2根35cm×0.7cm的玻璃層析柱中，用蒸餾水平衡後，把已備好的二份含10-DABIII的濾液分別倒入二根層析柱中，開啟柱下部活塞，使濾液緩慢流過柱中的大孔吸附樹脂，重複3次，使濾液中的10-DABIII被完全吸附。用HPLC檢測層析柱流出液不含10-DABIII後，流出液棄去。用無水乙醇洗脫被大孔吸附樹脂吸附的10-DABIII，共接受洗脫液6份計240ml，用HPLC檢測最後1份中10-DABIII，結果顯示不含10-DABIII。合併乙醇洗脫液，定容至250ml，取樣，進行HPLC分析。由分析結果計算大孔吸附樹脂對10-DABIII的吸附量、洗脫量、洗脫率、回收率。計算方法與實施例一相同，試驗結果見表二。含10-DABIII乙醇洗脫液在旋轉蒸發器中，於55℃水浴，-0.08Mpa的真空減壓濃縮成流浸膏。
表二
表二顯示，大孔吸附樹脂AB-8、NKA-9在層析柱中對紅豆杉枝葉的80％乙醇提取液的濃縮液的濾液中10-DABIII的吸附和洗脫結果都比較理想。在樹脂用量稍稍過量時，能夠將試液中的10-DABIII完全吸附。洗脫率、回收率都在98％以上上以上兩種大孔吸附樹脂用於紅豆杉枝葉的80％乙醇提取液的濃縮液的過濾液10-DABIII的初分離是可行的。上述試驗結果也表明，搖動吸附與在層析柱中吸附二種吸附方式均能達到較好效果。
權利要求
1.一種從紅豆杉枝葉中初分離10-去乙醯基巴卡亭III的方法，其特徵在於將大孔吸附樹脂放入含10-去乙醯基巴卡亭III的紅豆杉枝葉的70～80％乙醇提取液的濃縮液的濾液中，吸附3～5小時，或將大孔吸附樹脂裝填於層析柱中，讓含10-去乙醯基巴卡亭III的紅豆杉枝葉的70～80％乙醇提取液的濃縮液的濾液流經大孔吸附樹脂，進行吸附，濾液PH值5～6，吸附後，用無水乙醇洗脫被大孔吸附樹脂吸附的10-去乙醯基巴卡亭III，乙醇洗脫液濃縮後，得到含10-去乙醯基巴卡亭III的流浸膏。
2.依權利要求1所述的方法，其特徵在於大孔吸附樹脂是S-8、AB-8、X-5、D4020、NKA-9或D3520。
3.依權利要求1所述的方法，其特徵在於紅豆杉枝葉是南方紅豆杉、雲南紅豆杉、中國紅豆杉、東北紅豆杉、西藏紅豆杉或曼地亞紅豆杉的枝葉。
全文摘要
本發明公開了一種從紅豆杉枝葉初分離10－去乙醯基巴卡亭III的方法，用70～80％乙醇提取紅豆杉枝葉，得到水溶性濃縮液，靜置後，不溶於水的紫杉醇及低極性雜質沉澱析出，10－去乙醯基巴卡亭III等較大極性的紫杉醇同系物留在水溶液中，過濾，得到固形物和水性濾液，濾液pH值5～6，用大孔吸附樹脂吸附濾液中的10－去乙醯基巴卡亭III，吸附後，用無水乙醇洗脫被大孔吸附樹脂吸附的10－去乙醯基巴卡亭III，乙醇洗脫液濃縮後，得到富集10－去乙醯基巴卡亭III的產物。本發明充分利用了紅豆杉枝葉資源，既提取了紫杉醇，又提取了10－DABIII，提高了資源利用率，省去了液－液萃取步驟，減少了有機溶劑使用量，降低了成本，安全性高。
文檔編號C07D305/14GK1660827SQ20041007755
公開日2005年8月31日 申請日期2004年12月27日 優先權日2004年12月27日
發明者王國亮, 張依健, 駱雪蘭, 黃巧明, 謝維權, 夏惠青, 王彬力, 曾秋玲, 葉瑞英, 侯嵩生, 李志良 申請人:梅縣梅雁生物工程研究所