製備鏈黴親和素標記的藻紅藍蛋白alpha亞基類螢光蛋白質的方法

2023-06-27 22:29:31

專利名稱：製備鏈黴親和素標記的藻紅藍蛋白alpha亞基類螢光蛋白質的方法
技術領域：
本發明屬於生物技術中色素蛋白質材料領域，具體涉及新型鏈黴親和素標記的藻紅藍 蛋白alpha亞基類螢光蛋白質的製備方法。 技術背景藻膽蛋白(phycobiliprotein)是藍藻和紅藻光合作用捕光複合物的功能組分。根據 其吸收光譜和螢光光譜特徵，藻膽蛋白可以分為藻紅蛋白(phycoerythrin，簡稱CPE)、 藻紅藍蛋白(phycoerythrocyanin，簡稱PEC)、藻藍蛋白(phycocyanin，簡稱CPC)和 變藻藍蛋白(allophycocyanin，簡稱APC)。 CPE、 PEC、 CPC和APC含alpha和beta亞基， 每個亞基中藻膽色素(phycobilin )通過硫醚鍵與藻膽蛋白脫輔基蛋白 (apo-phycobiliprotein)半胱氨酸殘基的巰基共價結合，其種類及其與脫輔基蛋白的相 互作用決定藻膽蛋白的光譜性質。藻膽色素與脫輔基蛋白共價結合形成特定的構象，使得 CPE主要吸收約560nm的可見光，發射約580nm的螢光；PEC吸收約570nm的可見光，發 射約630nm的螢光；CPC吸收約620nm的可見光，發射約640nm的螢光；APC吸收約650 660mn的可見光，發射約660 670nm的螢光。CPE結合的輔基色素為藻紅膽素 (phycoerythrobilin，簡稱PEB); PEC的alpha亞基結合的輔基色素為藻紫膽素 (phycoviolobilin，簡稱PVB); PEC的beta亞基結合的輔基色素為藻藍膽素 (phycocyanobilin，簡稱PCB); CPC和APC結合的輔基色素都為藻藍膽素PCB。鏈黴親和素可以跟生物素特異結合，通過鏈黴親和素-生物素系統，可以實現信號放 大作用，提高檢測靈敏度。目前鏈黴親和素-生物素系統已經廣泛應用於生物學檢測和醫 療檢測等領域。目前主要是通過化學交聯實現鏈黴親和素對目標的標記。藻紅藍蛋白PEC的alpha亞基可以通過大腸桿菌基因工程菌來生產(Tooley A丄 Glazer AN. Biosynthesis of the cyanobacterial light-harvesting polypeptide phycoerythrocyanin holo-alpha subunit in a heterologous host. J Bacteriol. 2002; 184(17): 4666 4671)。 PCB生物合成基因由力W和pc州組成，可以通過大腸桿菌基因 工程菌來生產PCB (F. T. Undgmf, C. Forreiter， et al. Recombinant holophytochrome in Echerichia coli[J]. FEBS Letters, 2001， 508:459-462)。我們通過基因工程技術，把鏈 黴親和素基因和藻紅藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白基因拼接後克隆於表達載體，可以在大 腸桿菌內表達得到鏈黴親和素和藻紅藍蛋白alpha亞基類脫輔基蛋白的融合蛋白，直接實現鏈黴親和素和藻紅藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白的連接，而不需要通過化學交聯等方法
來實現鏈黴親和素標記；把藻紅藍蛋白alpha亞基裂合酶基因、PCB生物合成基因克隆於 表達載體。利用以上表達載體，通過基因工程菌，可以直接生成鏈黴親和素標記的藻紅藍 蛋白alpha亞基類螢光蛋白質。藻膽蛋白類螢光蛋白質可以應用於食品、化妝品、醫藥和生物工程領域。藻紅藍蛋白 類螢光蛋白質具有優良的螢光性質，通過直接實現鏈鏈黴親和素和藻紅藍蛋白alpha亞基 脫輔基蛋白的連接，可用於生物學檢測以及醫療檢測領域。本發明為藻紅藍蛋白類色素蛋 白質功能材料應用於醫藥和生物工程領域，特別是檢測領域奠定了基礎。發明內容本發明的目的在於提供一種製備鏈黴親和素標記的藻紅藍蛋白alpha亞基類螢光蛋白 質的方法。它是應用藻紅藍蛋白alpha亞基裂合催化藻藍膽素(PCB)與鏈黴親和素標記的藻 紅藍蛋白alpha亞基類脫輔基蛋白共價結合，同時藻藍膽素(PCB)異構成為藻紫膽素(PVB)， 從而製備鏈黴親和素標記的藻紅藍蛋白alpha亞基類螢光蛋白質。將含有藻紅藍蛋白alpha 亞基裂合酶基因、鏈黴親和素基因和藻紅藍蛋白alpha亞基類脫輔基蛋白基因拼接的基因、 藻藍膽素生物合成酶基因的表達質粒依次轉入宿主菌，得到相應的工程菌，通過這種方法 得到的基因工程菌生產鏈黴親和素標記的藻紅藍蛋白alpha亞基類螢光蛋白質。本發明的目的是這樣實現的 一種製備鏈黴親和素標記的藻紅藍蛋白alpha亞基類熒 光蛋白質的方法，包括以下步驟(1) 釆用基因工程方法，將alpha亞基裂合酶基因或其同源基因克隆於表達載體中， 得到alpha亞基裂合酶表達質粒；(2) 用基因工程方法將鏈黴親和素基因和藻紅藍蛋白alpha亞基類脫輔基蛋白基因 或其同源基因克隆於第二個表達載體中，得到鏈黴親和素標記的脫輔基蛋白表達質粒；(3) 用基因工程方法將PCB生物合成酶基因力o7和pcj^或其同源基因同時克隆於第 三個表達載體中或分別克隆於第三、第四個表達載體，得到PCB合成質粒。(4) 將beta裂合酶表達質粒、鏈黴親和素標記的脫輔基蛋白表達質粒、PCB生物合 成酶質粒依次轉入配套的宿主菌，當這些表達質粒都轉入宿主菌後，得到相應的工程菌， 將該工程菌發酵後，按常規蛋白質提純技術，提純得到相應的鏈黴親和素標記的藻紅藍蛋 白alpha亞基類螢光蛋白質。上述的製備鏈黴親和素標記的藻紅藍蛋白alpha亞基類螢光蛋白質的方法中所述的 宿主菌為大腸桿菌。所述的alpha亞基裂合酶基因是指與力/7s63e/7a sp. PCC7120中pecf 和pec屍基因或M 7a肌'/70s〃s sp. PCC7603中； ecf禾[l pec屍基因同源的基因。所述的藻紅 藍蛋白alpha亞基類脫輔基蛋白基因是指與」朋力朋朋sp. PCC7120或必7a/w'/7as"s spPCC7603中pecj同源的基因。本發明與現有技術相比，具有以下優點1、 不使用藻類為原料而是利用大腸桿菌生產藻紅藍蛋白alpha亞基類螢光蛋白質， 大腸桿菌繁殖快，可以大大縮短周期；2、 與藻類相比，大腸桿菌細胞壁容易破碎，純化過程中可節省能源；3、 通過大腸桿菌生產，目標蛋白含量高，有His-tag標記，且體系中幾乎沒有性質 類似的蛋白，提取方便；4、 產物中鏈黴親和素與螢光藻紅藍蛋白alpha亞基類色素蛋白質直接結合，不需額 外進行處理，有利於發展螢光藻膽蛋白類色素蛋白質在檢測領域的應用。


圖1為本發明中PecE/PecF催化下生成的鏈黴親和素標記的藻紅藍蛋白alpha亞基類 螢光蛋白質的吸收光譜；實線為500nm光照射後的吸收光譜,虛線為570nm光照射後的吸 收光譜；圖2為本發明中PecE/PecF催化下生成的鏈黴親和素標記的藻紅藍蛋白alpha亞基類 螢光蛋白質的螢光光譜。
具體實施方式
下面以實例對本發明作進一步詳細的說明。 實施例1(1) 從GeneBank中可以査到，藻種^朋6ae朋sp. PCC7120的全序列己經測定完成， 必Zs啦'/706Y/5" sp. PCC7603部分序列已經測定。A a/ 朋朋sp. PCC7120在GeneBank中編號 為BA000019，必Jayzu'/7os"ssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254, 可從所査到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將鏈黴親和素基因(簡稱幼)和 力朋力朋朋sp. PCC7120中的藻紅藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白基因拼接後克隆於Novagen 公司購買的pET30中，所得質粒叫PET30-sa"PecA在大腸桿菌中能表達鏈黴親和素和藻 紅藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈黴親和素標記的藻紅藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白的表達質粒。根據GeneBank中査到的基因序列，設計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模 板，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下遊引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相應質粒中同樣的酶切位點上。鏈黴親和素基因可以從GeneBank中査到，編號為AF283893,通過全基因合成得到。(2) 將如Anabaena sp. PCC7120中的藻紅藍蛋白alpha亞基裂合酶基因pecE和oecF
克隆於Novagen公司購買的pETDuet-1中，所得質粒叫pETDuet-/ ecv -; ec屍，在大腸桿菌 中能表達藻紅藍蛋白alpha亞基裂合酶PecE/pecF，得到藻紅藍蛋白alpha亞基裂合酶表 達質粒。(3) 將藻藍膽素生物合成酶基因(力o7和pc^)克隆於Novagen公司購買的 pACYCDuet-1中，所得質粒叫pACYCDuet-/ o卜; c;^，在大腸桿菌中能同時表達H01和PcyA。即脫輔基蛋白基因在pET30中是在fcoRV和Z力o I兩個酶切位點之間，鏈黴親 和素基因m在v^"I和^^1I兩個酶切位點之間；裂合酶基因pecf在pETDuet中，處於 第一個多克隆位點，酶切位點是Abo I和At I之間，裂合酶基因pec屍在pETDuet中，處 於第二個多克隆位點，酶切位點是AcoRV和J力o I之間；PCB合成酶基因是2個(力o7和 pc州)，它們在同一個載體pACYCDuet-1中，力W處於第一個多克隆位點，在I和屍W I之間，/ cj^在第二個多克隆位點，在AWeI和J力ol之間。基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下遊， 一對；上遊下遊引物分 別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段， 把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。(4) 將pETDuet-pecf-pec尺pET30-stpec力和pACYCDuet-力o7-pcy力轉入大腸桿菌， 當這些質粒都轉入大腸桿菌後得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種於pH 7. 0的LB培養 基中，37。C振蕩培養至0a。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-p-D-galactoside,簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20。C至37"振蕩表達約12小 時，生產鏈黴親和素標記的藻紅藍蛋白alpha亞基類螢光蛋白質藻藍膽素-藻紅藍蛋白A; 離心收集菌體細胞，加入緩衝液、破碎細胞後，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可 提純得到相應的鏈黴親和素標記的藻紅藍蛋白類螢光蛋白質藻藍膽素-藻紅藍蛋白A。其 吸收光譜見圖1所示，其螢光光譜見圖2所示。將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式如下從新鮮塗布的平板上挑取大腸桿菌菌株BL21(DE3)單菌落，接種於5mL LB培養基， 37。C振蕩培養過夜；取100pL飽和培養物，無菌轉接至5mL LB培養基，37。C振蕩培養至 0D6。。=0.3 0.4時，將菌液轉移至5mL無菌離心管中，冰上放置10分鐘；離心1分鐘 (10000g， 4'C)棄去上清，收集沉澱菌體；用lmL預冷的0. lmol/L CaCl2無菌溶液重懸菌 體，離心30s(10000g， 4。C)去上清，菌體沉澱用100nL預冷的0. lmol/L CaCl2重懸，放置
於冰上，加入一定量的構建好的質粒，混勻後冰浴放置30分鐘，42。C熱休克90s，冰浴5 分鐘後加入300)aLLB培養基，37。C低速振蕩培養45分鐘，無菌塗布在含有相應抗生素的 LB培養基平板上，倒置於37。C培養箱至形成可見的單克隆菌斑。提取3個左右菌落，分別接種到5ml含相應抗生素的LB培養基中，振蕩培養至飽和； 分別從中取10(^L轉接至5ml含相應抗生素的LB培養基中；37'C振蕩培養至OD6。。二0. 5-0.7 時，冰浴約30分鐘，加入IPTG誘導表達；避光、20°C、 150轉/分，表達約12小時。離 心收集細胞，細胞加入緩衝液重懸；通過光譜儀測其產物螢光量，選取螢光產量高的菌株 進行大量表達。實施例2(1) 從GeneBank中可以査到，藻種sp. PCC7120的全序列己經測定完成， 必7柳i/ os"s sp. PCC7603部分序列已經測定。j/7a力ae/7a sp. PCC7120在GeneBank中編號 為BA000019，尨^/z i/70犯ssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254， 可從所査到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將鏈黴親和素基因(簡稱幼)和 ^7a6ae朋sp.PCC7120中的藻紅藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白基因拼接後克隆於Novagen 公司購買的pET30中，所得質粒叫pET30-s『; ecA在大腸桿菌中能表達鏈黴親和素和藻 紅藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈黴親和素標記的藻紅藍蛋白alpha亞 基脫輔基蛋白的表達質粒。根據GeneBank中查到的基因序列，設計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模 板，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下遊引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相 應質粒中同樣的酶切位點上。鏈黴親和素基因可以從GeneBank中查到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。(2) 將Ua/77i/7osi/s sp. PCC7603中的藻紅藍蛋白alpha亞基裂合酶基因pecf和 pecF克隆於Novagen公司購買的pETDuet-1中，所得質粒叫pETDuet-pec￡-pec屍，在大腸 桿菌中能表達藻紅藍蛋白alpha亞基裂合酶PecE/pecF，得到藻紅藍蛋白alpha亞基裂合 酶表達質粒。(3) 將藻藍膽素生物合成酶基因(力o7和克隆於Novagen公司購買的 pACYCDuet-1中，所得質粒叫pACYCDuet-力o7-; ci^,在大腸桿菌中能同時表達HOI和PcyA。即脫輔基蛋白基因在pET30中是在fcoRV和i7 o I兩個酶切位點之間，鏈黴親 和素基因在1和^71I兩個酶切位點之間；裂合酶基因pecf在pETDuet中，處於 第一個多克隆位點，酶切位點是Afco I和At I之間，裂合酶基因pec屍在pETDuet中，處 於第二個多克隆位點，酶切位點是fcoRV和J力o I之間；PCB合成酶基因是2個(力o7和pcy力)，它們在同一個載體pACYCDuet-l中，力o/處於第一個多克隆位點，在yVco I和屍" I之間，； cj^在第二個多克隆位點，在M/el和之間。基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下遊， 一對；上遊下遊引物分 別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段， 把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌，利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。(4)將pETDuet-; ecf-; ec屍、pET30-^"/ ec力和pACYCDuet-力o7-; c/J轉入大腸桿菌， 當這些質粒都轉入大腸桿菌後得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種於pH 7. 0的LB培養 基中，37'C振蕩培養至0D,為0.5至0.8，加入異丙基硫代-卩-D-半乳糖苷(is叩rophyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為l腿ol/L， 20。C至37。C振蕩表達約12小 時，生產鏈黴親和素標記的藻紅藍蛋白alpha亞基類螢光蛋白質藻藍膽素-藻紅藍蛋白A; 離心收集菌體細胞，加入緩衝液、破碎細胞後，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可 提純得到相應的鏈黴親和素標記的藻紅藍蛋白類螢光蛋白質藻藍膽素-藻紅藍蛋白A。將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。實施例3(1) 從GeneBank中可以査到，藻種力朋6ae朋sp. PCC7120的全序列已經測定完成， 〗a/zu'/7asiAS sp. PCC7603部分序列已經測定。力朋6ae/7a sp. PCC7120在GeneBank中編號為BA000019，必Ja肌'/70OTSsp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254, 可從所査到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將鏈黴親和素基因(簡稱幼)和 Mh/w';70幼s sp. PCC7603中的藻紅藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白基因拼接後克隆於 Novagen公司購買的pET30中，所得質粒叫pET30-s^; ecA在大腸桿菌中能表達鏈黴親 和素和藻紅藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈黴親和素標記的藻紅藍蛋白 alpha亞基脫輔基蛋白的表達質粒。根據GeneBank中查到的基因序列，設計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模 板，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下遊引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相 應質粒中同樣的酶切位點上。鏈黴親和素基因可以從GeneBank中查到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。(2) 將^朋6ae朋sp. PCC7120中的藻紅藍蛋白alpha亞基裂合酶基因； ec^和pec, 克隆於Novagen公司購買的pETDuet-1中，所得質粒叫pETDuet_pec￡-pecF，在大腸桿菌
中能表達藻紅藍蛋白alpha亞基裂合酶PecE/pecF，得到藻紅藍蛋白alpha亞基裂合酶表 達質粒。(3) 將藻藍膽素生物合成酶基因(力W和/ C7力)克隆於Novagen公司購買的 pACYCDuet-l中，所得質粒叫pACYCDuet-力o7了c/A在大腸桿菌中能同時表達H01和PcyA。即脫輔基蛋白基因/ ec力在pET30中是在fcoRV和Z力o I兩個酶切位點之間，鏈黴親 和素基因sa在I和《g7II兩個酶切位點之間；裂合酶基因vDeM在pETDuet中，處於 第一個多克隆位點，酶切位點是Afco I和屍"I之間，裂合酶基因； ec,在pETDuet中，處 於第二個多克隆位點，酶切位點是feoRV和i7wl之間；PCB合成酶基因是2個(力o/和 pc/J)，它們在同一個載體pACYCDuet-1中，加7處於第一個多克隆位點，在Afco I和," I之間，pc/力在第二個多克隆位點，在yWel和X力oI之間。基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下遊， 一對；上遊下遊引物分 別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段， 把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。(4) 將pETDuet-pecf-/7ec/^、 pET30_5a~/ ec」和pACYCDuet-/ o7-pcj^轉入大腸桿菌， 當這些質粒都轉入大腸桿菌後得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種於pH 7. 0的LB培養 基中，37。C振蕩培養至0De。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20。C至37。C振蕩表達約12小 時，生產鏈黴親和素標記的藻紅藍蛋白alpha亞基類螢光蛋白質藻藍膽素-藻紅藍蛋白A; 離心收集菌體細胞，加入緩衝液、破碎細胞後，離心收集上清液，通過附2+親和層析，可 提純得到相應的鏈黴親和素標記的藻紅藍蛋白類螢光蛋白質藻藍膽素-藻紅藍蛋白A。將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。 實施例4(1)從GeneBank中可以査到，藻種^朋6ae朋sp. PCC7120的全序列已經測定完成， 必7a/w'/705"s sp. PCC7603部分序列已經測定。如atee朋sp. PCC7120在GeneBank中編號 為BA000019，M h肌'/70SiASsp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254， 可從所查到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將鏈黴親和素基因(簡稱和 必7a/wV^s"s sp. PCC7603中的藻紅藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白基因拼接後克隆於 Novagen公司購買的pET30中，所得質粒叫pET30-s『pecA在大腸桿菌中能表達鏈黴親 和素和藻紅藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈黴親和素標記的藻紅藍蛋白 alpha亞基脫輔基蛋白的表達質粒。根據GeneBank中査到的基因序列，設計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模 板，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下遊引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相 應質粒中同樣的酶切位點上。鏈黴親和素基因可以從GeneBank中查到，編號為AF283893,通過全基因合成得到。(2) 將尨Ja啦'"os"s sp. PCC7603中的藻紅藍蛋白alpha亞基裂合酶基因pecf和 pec屍克隆於Novagen公司購買的pETDuet-l中，所得質粒叫pETDuet-/ ecf-pec屍，在大腸 桿菌中能表達藻紅藍蛋白alpha亞基裂合酶PecE/pecF，得到藻紅藍蛋白alpha亞基裂合 酶表達質粒。(3) 將藻藍膽素生物合成酶基因(力W和pc州)克隆於Novagen公司購買的 pACYCDuet-1中，所得質粒叫pACYCDuet-在大腸桿菌中能同時表達HOI和PcyA。即脫輔基蛋白基因在pET30中是在化oRV和J力o I兩個酶切位點之間，鏈黴親 和素基因幼在f/w I和^ill兩個酶切位點之間；裂合酶基因pecf在pETDuet中，處於 第一個多克隆位點，酶切位點是Afco I和屍"I之間，裂合酶基因pec,在pETDuet中，處 於第二個多克隆位點，酶切位點是fcoRV和i7 o I之間；PCB合成酶基因是2個(力W和 / c;^)，它們在同一個載體pACYCDuet-1中，力W處於第一個多克隆位點，在yVco I和屍W I之間，pc州在第二個多克隆位點，在AfeteI和之間。基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下遊， 一對；上遊下遊引物分 別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段， 把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。(4) 將pETDuet-/ ec￡-pec尺pET30-sapped和pACYCDuet-力o7-pcj^轉入大腸桿菌， 當這些質粒都轉入大腸桿菌後得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種於pH 7. 0的LB培養 基中，37。C振蕩培養至0D,為0.5至0.8，加入異丙基硫代-P-D-半乳糖苷(isopr叩hyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為l鵬ol/L， 20。C至37。C振蕩表達約12小 時，生產鏈黴親和素標記的藻紅藍蛋白alpha亞基類螢光蛋白質藻藍膽素-藻紅藍蛋白A; 離心收集菌體細胞，加入緩衝液、破碎細胞後，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到相應的鏈黴親和素標記的藻紅藍蛋白類螢光蛋白質藻藍膽素-藻紅藍蛋白A。
將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。 實施例5(1) 從GeneBank中可以查到，藻種如a6ae朋sp. PCC7120的全序列已經測定完成， J/. 7柳j'/ os"s sp. PCC7603部分序列已經測定。^/7aZ ae朋sp. PCC7120在GeneBank中編號 為BA000019,i/. Z3/Bj'"os^sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254， 可從所査到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將鏈黴親和素基因(簡稱和sp. PCC7120中的藻紅藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白基因拼接後克隆於Novagen 公司購買的pC0LADuet-1中，所得質粒叫pCOLADuet-sa~/7ecA在大腸桿菌中能表達鏈黴 親和素和藻紅藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈黴親和素標記的藻紅藍蛋 白alpha亞基脫輔基蛋白的表達質粒。根據GeneBank中査到的基因序列，設計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模 板，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下遊引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相 應質粒中同樣的酶切位點上。鏈黴親和素基因可以從GeneBank中查到，編號為AF283893,通過全基因合成得到。(2) 將力朋6ae朋sp.PCC7120中的藻紅藍蛋白alpha亞基裂合酶基因pecf禾tl pec屍 克隆於Novagen公司購買的pETDuet-1中，所得質粒叫pETDuet-pecf-pecA在大腸桿菌 中能表達藻紅藍蛋白alpha亞基裂合酶PecE/pecF，得到藻紅藍蛋白alpha亞基裂合酶表 達質粒。(3) 將藻藍膽素生物合成酶基因(力W和pc/力)克隆於Novagen公司購買的 pACYCDuet-1中，所得質粒叫pACYCDuet-力o卜; cj^，在大腸桿菌中能同時表達H01和PcyA。即鏈黴親和素基因sa和脫輔基蛋白基因ped拼接後的片段在pC0LADuet-l中是在第 一個多克隆位點的I和屍W I兩個酶切位點之間；裂合酶基因pecf在pETDuet中， 處於第一個多克隆位點，酶切位點是Afco I和屍"I之間，裂合酶基因pec屍在pETDuet中， 處於第二個多克隆位點，酶切位點是^boRV和J力ol之間；PCB合成酶基因是2個(力W 和pcy力)，它們在同一個載體pACYCDuet-1中，處於第一個多克隆位點，在Afco I和 At I之間，在第二個多克隆位點，在We I和J力o I之間。基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下遊， 一對；上遊下遊引物分 別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段， 把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌，
利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。(4)將pETDuet-/ ecf-pec,、 pC0LADuet_sa~/ eo4和pACYCDuet-/ o7-pcy力轉入大腸 桿菌，當這些質粒都轉入大腸桿菌後得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種於pH 7. 0的 LB培養基中，37'C振蕩培養至006。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-p-D-半乳糖苷 (isopr叩hyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20。C至37。C振蕩 表達約12小時，生產鏈黴親和素標記的藻紅藍蛋白alpha亞基類螢光蛋白質藻藍膽素-藻紅藍蛋白A;離心收集菌體細胞，加入緩衝液、破碎細胞後，離心收集上清液，通過Ni" 親和層析，可提純得到相應的鏈黴親和素標記的藻紅藍蛋白類螢光蛋白質藻藍膽素-藻紅 藍蛋白A。將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。 實施例6(1) 從GeneBank中可以查到，藻種^ a6ae"a sp. PCC7120的全序列已經測定完成， 必Jayw'/ ows sp. PCC7603部分序列己經測定。力朋&e朋sp. PCC7120在GeneBank中編號 為BA000019，尨Ja/M'/ o^^sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254， 可從所査到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將鏈黴親和素基因(簡稱和 j朋6ae朋sp.PCC7120中的藻紅藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白基因拼接後克隆於Novagen 公司購買的pCOLADuet-1中，所得質粒叫pC0LADuet-stpecA在大腸桿菌中能表達鏈黴 親和素和藻紅藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈黴親和素標記的藻紅藍蛋 白alpha亞基脫輔基蛋白的表達質粒。根據GeneBank中査到的基因序列，設計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模 板，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下遊引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相 應質粒中同樣的酶切位點上。鏈黴親和素基因可以從GeneBank中査到，編號為AF283893,通過全基因合成得到。(2) 將必』a/M'/70s"s sp. PCC7603中的藻紅藍蛋白alpha亞基裂合酶基因pe"和 pec屍克隆於Novagen公司購買的pETDuet-1中，所得質粒叫pETDuet-pecf-; ecF，在大腸 桿菌中能表達藻紅藍蛋白alpha亞基裂合酶PecE/pecF，得到藻紅藍蛋白alpha亞基裂合 酶表達質粒。(3) 將藻藍膽素生物合成酶基因(Zw7和pcy/l)克隆於Novagen公司購買的 pACYCDuet-1中，所得質粒叫pACYCDuet-在大腸桿菌中能同時表達HOI和PcyA。即鏈黴親和素基因sa和脫輔基蛋白基因pe"拼接後的片段在pCOLADuet-l中是在第 一個多克隆位點的I和I兩個酶切位點之間；裂合酶基因pecf在pETDuet中，
處於第一個多克隆位點，酶切位點是I和,"I之間，裂合酶基因pecf在pETDuet中， 處於第二個多克隆位點，酶切位點是AcoRV和之間；PCB合成酶基因是2個(/w/ 和pcj^)，它們在同一個載體pACYCDuet-1中，Zw7處於第一個多克隆位點，在Wco I和 屍"I之間，/7C/力在第二個多克隆位點，在yVofe I和i7 o I之間。基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下遊， 一對；上遊下遊引物分 別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段， 把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。(4)將pETDuet-pecf-pec屍、pCOLADuet-s『/ ecj和pACYCDuet-/ a^_/ c_^轉入大腸 桿菌，當這些質粒都轉入大腸桿菌後得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種於pH 7.0的 LB培養基中，37'C振蕩培養至0De。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-p-D-半乳糖苷 (isopr叩hyl thiof D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20。C至37。C振蕩 表達約12小時，生產鏈黴親和素標記的藻紅藍蛋白alpha亞基類螢光蛋白質藻藍膽素-藻紅藍蛋白A;離心收集菌體細胞，加入緩衝液、破碎細胞後，離心收集上清液，通過[^2+ 親和層析，可提純得到相應的鏈黴親和素標記的藻紅藍蛋白類螢光蛋白質藻藍膽素-藻紅 藍蛋白A。將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。 實施例7(1)從GeneBank中可以查到，藻種/l朋tee朋sp. PCC7120的全序列已經測定完成， M Ja肌V7o犯s sp. PCC7603部分序列已經測定。勘a/ ae朋sp. PCC7120在GeneBank中編號 為BA000019，必h/w'/ o^yssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254， 可從所查到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將鏈黴親和素基因(簡稱和 i/. 7a肌'/7ows sp. PCC7603中的藻紅藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白基因拼接後克隆於 Novagen公司購買的pCOLADuet-1中，所得質粒叫pCOLADuet-^~pec/!，在大腸桿菌中能 表達鏈黴親和素和藻紅藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈黴親和素標記的 藻紅藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白的表達質粒。根據GeneBank中查到的基因序列，設計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模 板，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下遊引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相 應質粒中同樣的酶切位點上。
鏈黴親和素基因可以從GeneBank中査到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。(2) 將力朋6ae/7a sp. PCC7120中的藻紅藍蛋白alpha亞基裂合酶基因pecf禾Q 克隆於Novagen公司購買的pETDuet-1中，所得質粒叫pETDuet-/ ecf-pec,，在大腸桿菌 中能表達藻紅藍蛋白alpha亞基裂合酶PecE/pecF，得到藻紅藍蛋白alpha亞基裂合酶表 達質粒。(3) 將藻藍膽素生物合成酶基因(力o7和pcW)克隆於Novagen公司購買的 pACYCDuet-1中，所得質粒叫pACYCDuet-力o7-; c;^，在大腸桿菌中能同時表達H01和PcyA。即鏈黴親和素基因sa和脫輔基蛋白基因pe^拼接後的片段在pCOLADuet-l中是在第 一個多克隆位點的^boR I和屍"I兩個酶切位點之間；裂合酶基因pecf在pETDuet中， 處於第一個多克隆位點，酶切位點是I和At I之間，裂合酶基因/ ec,在pETDuet中， 處於第二個多克隆位點，酶切位點是fcoRV和oI之間；PCB合成酶基因是2個(力o7 和pc/力)，它們在同一個載體pACYCDuet-1中，力o7處於第一個多克隆位點，在Afco I禾口 屍"I之間，/ c州在第二個多克隆位點，在7lWel和oI之間。基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下遊， 一對；上遊下遊引物分 別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段， 把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。(4) 將pETDuet-pecf—; ec屍、pCOLADuet-sa^pecJ禾n pACYCDuet-力o7—pcj^轉入大腸 桿菌，當這些質粒都轉入大腸桿菌後得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種於pH 7. 0的 LB培養基中，37。C振蕩培養至0De。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷 (is叩rophyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20。C至37。C振蕩 表達約12小時，生產鏈黴親和素標記的藻紅藍蛋白alpha亞基類螢光蛋白質藻藍膽素-藻紅藍蛋白A;離心收集菌體細胞，加入緩衝液、破碎細胞後，離心收集上清液，通過N;r 親和層析，可提純得到相應的鏈黴親和素標記的藻紅藍蛋白類螢光蛋白質藻藍膽素-藻紅 藍蛋白A。將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。 實施例8(1)從GeneBank中可以査到，藻種如a6ae朋sp.PCC7120的全序列已經測定完成， yK Ja77i/ os〃s sp. PCC7603部分序列已經測定。^朋6ae朋sp. PCC7120在GeneBank中編號 為BA000019，yK^M i/ asY^sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254， 可從所査到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將鏈黴親和素基因(簡稱sa)和 M h/w'/709"s印.PCC7603中的藻紅藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白基因拼接後克隆於 Novagen公司購買的pC0LADuet-l中，所得質粒叫pCOLADuet-s『pecA在大腸桿菌中能 表達鏈黴親和素和藻紅藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈黴親和素標記的 藻紅藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白的表達質粒。根據GeneBank中査到的基因序列，設計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模 板，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下遊引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相 應質粒中同樣的酶切位點上。鏈黴親和素基因可以從GeneBank中査到，編號為AF283893,通過全基因合成得到。(2) 將M 2a啦'/70^s sp. PCC7603中的藻紅藍蛋白alpha亞基裂合酶基因pecf禾口 pecF克隆於Novagen公司購買的pETDuet-1中，所得質粒叫pETDuet-pecf-; ec^，在大腸 桿菌中能表達藻紅藍蛋白alpha亞基裂合酶PecE/pecF，得到藻紅藍蛋白alpha亞基裂合 酶表達質粒。(3) 將藻藍膽素生物合成酶基因(力o7和/x^l)克隆於Novagen公司購買的 pACYCDuet-1中，所得質粒叫pACYCDuet-力o7-pc/A在大腸桿菌中能同時表達H01和PcyA。即鏈黴親和素基因sa和脫輔基蛋白基因ped拼接後的片段在pCOLADuet-1中是在第 一個多克隆位點的I和屍"I兩個酶切位點之間；裂合酶基因pecf在pETDuet中， 處於第一個多克隆位點，酶切位點是Afco I和Z7" I之間，裂合酶基因； ec屍在pETDuet中， 處於第二個多克隆位點，酶切位點是^boRV和X力oI之間；PCB合成酶基因是2個(力o7 和pc/力)，它們在同一個載體pACYCDuet-1中，力o7處於第一個多克隆位點，在Afco I和 屍WI之間，pc州在第二個多克隆位點，在AfafeI和J力ol之間。基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下遊， 一對；上遊下遊引物分 別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段， 把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。(4) 將pETDuet-/ e^"-pec屍、pCOLADuet-s^pec力和pACYCDuet-/ o7-pc州轉入大腸 桿菌，當這些質粒都轉入大腸桿菌後得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種於pH 7.0的 LB培養基中，37。C振蕩培養至0仄oo為0.5至0.8，加入異丙基硫代-p-D-半乳糖苷 (isoprophyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lramol/L, 20。C至37。C振蕩 表達約12小時，生產鏈黴親和素標記的藻紅藍蛋白alpha亞基類螢光蛋白質藻藍膽素-藻紅藍蛋白A;離心收集菌體細胞，加入緩衝液、破碎細胞後，離心收集上清液，通過1^2+ 親和層析，可提純得到相應的鏈黴親和素標記的藻紅藍蛋白類螢光蛋白質藻藍膽素-藻紅 藍蛋白A。將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。 實施例9(1) 從GeneBank中可以查到，藻種sp. PCC7120的全序列己經測定完成， vK ^3/w'/jos"s sp. PCC7603部分序列已經測定。^朋tee/ a sp. PCC7120在GeneBank中編號 為BA000019，M Ja肌'/7omssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254， 可從所査到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將鏈黴親和素基因(簡稱幼)和 力朋6朋朋sp. PCC7120中的藻紅藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白基因拼接後克隆於Novagen 公司購買的pET30中，所得質粒叫pET30-^rpecA在大腸桿菌中能表達鏈黴親和素和藻 紅藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈黴親和素標記的藻紅藍蛋白alpha亞 基脫輔基蛋白的表達質粒。根據GeneBank中査到的基因序列，設計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模 板，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下遊引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相 應質粒中同樣的酶切位點上。鏈黴親和素基因可以從GeneBank中査到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。(2) 將^朋6朋7 a sp.PCC7120中的藻紅藍蛋白alpha亞基裂合酶基因pecf禾n / ecF 克隆於Novagen公司購買的pETDuet-1中，所得質粒叫pETDuet-pecf-pecA在大腸桿菌 中能表達藻紅藍蛋白alpha亞基裂合酶PecE/pecF，得到藻紅藍蛋白alpha亞基裂合酶表 達質粒。(3) 將藻藍膽素生物合成酶基因之一 力o7克隆於Novagen公司的pACYCDuet-1中， 所得質粒叫pACYCDuet-力o7，在大腸桿菌中能表達H01。將藻藍膽素生物合成酶基因之一 pcyj克隆於Novagen公司的pETDuet-1中，所得質 粒叫pCDFDuet-/7cW，在大腸桿菌中能表達PcyA。即脫輔基蛋白基因在pET30中是在fcoRV和i7w I兩個酶切位點之間，鏈黴親 和素基因sa在和％711兩個酶切位點之間；裂合酶基因在pETDuet中，處於 第一個多克隆位點，酶切位點是AfcoI和/^tl之間，裂合酶基因pec,在pETDuet中，處 於第二個多克隆位點，酶切位點是&oRV和J力ol之間；PCB合成酶基因是2個(hol和pcyA)， hol在pACYCDuet-1中，處於第一個多克隆位點，在Nco I和Pst I之間，pcyA在 pETDuet-1中第二個多克隆位點，在Nde I和Xho I之間。基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下遊， 一對；上遊下遊引物分 別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段， 把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。(4)將pETDuet-pecf-pec尺pET30-&g~pec^l和pACYCDuet-hol、 pETDuet-pcyA轉入 大腸桿菌，當這些質粒都轉入大腸桿菌後得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種於pH 7. 0 的LB培養基中，37'C振蕩培養至OD,為0.5至0.8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷 (is叩r叩hyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為l誦ol/L， 20。C至37。C振蕩 表達約12小時，生產鏈黴親和素標記的藻紅藍蛋白alpha亞基類螢光蛋白質藻藍膽素-藻紅藍蛋白A;離心收集菌體細胞，加入緩衝液、破碎細胞後，離心收集上清液，通過附2+ 親和層析，可提純得到相應的鏈黴親和素標記的藻紅藍蛋白類螢光蛋白質藻藍膽素-藻紅 藍蛋白A。將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。 實施例10(1) 從GeneBank中可以查到，藻種細6ae朋sp.PCC7120的全序列已經測定完成， 脫7a/zwV70s^ sp. PCC7603部分序列已經測定。sp. PCC7120在GeneBank中編號 為BA000019，尨Ja啦V70幼ssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254， 可從所査到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將鏈黴親和素基因(簡稱幼)和 力朋6ae朋sp.PCC7120中的藻紅藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白基因拼接後克隆於Novagen 公司購買的pET30中，所得質粒叫pET30-sa^e"，在大腸桿菌中能表達鏈黴親和素和藻 紅藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈黴親和素標記的藻紅藍蛋白alpha亞 基脫輔基蛋白的表達質粒。根據GeneBank中查到的基因序列，設計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模 板，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下遊引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相 應質粒中同樣的酶切位點上。鏈黴親和素基因可以從GeneBank中査到，編號為AF283893,通過全基因合成得到。(2) 將Ja/M'/ oms sp. PCC7603中的藻紅藍蛋白alpha亞基裂合酶基因/ ecf和
pecF克隆於Novagen公司購買的pETDuet-1中，所得質粒叫pETDuet-pecf-pec屍，在大腸 桿菌中能表達藻紅藍蛋白alpha亞基裂合酶PecE/pecF，得到藻紅藍蛋白alpha亞基裂合 酶表達質粒。(3) 將藻藍膽素生物合成酶基因之一 力o7克隆於Novagen公司的pACYCDuet-1中， 所得質粒叫pACYCDuet-力o厶在大腸桿菌中能表達HOI。將藻藍膽素生物合成酶基因之一 ； c_^克隆於Novagen公司的pETDuet-1中，所得質 粒叫pCDFDuet-/5c州，在大腸桿菌中能表達PcyA。即脫輔基蛋白基因/ ea4在PET30中是在AcoRV和I力o I兩個酶切位點之間，鏈黴親 和素基因sa在A>/71和《^n兩個酶切位點之間；裂合酶基因； ec^在pETDuet中，處於 第一個多克隆位點，酶切位點是Afco I和屍W I之間，裂合酶基因pec屍在pETDuet中，處 於第二個多克隆位點，酶切位點是化oRV和之間；PCB合成酶基因是2個(hoi和 pcyA)， hoi在pACYCDuet-1中，處於第一個多克隆位點，在Nco I和Pst I之間，pcyA在 pETDuet-1中第二個多克隆位點，在Nde I和Xho I之間。基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下遊， 一對；上遊下遊引物分 別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段， 把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌，利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。(4) 將pETDuet-; ecf-pec尺pET30-stpec力和pACYCDuet-hoi、 pETDuet-pcyA轉入 大腸桿菌，當這些質粒都轉入大腸桿菌後得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種於pH 7. 0 的LB培養基中，37'C振蕩培養至0De。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-P-D-半乳糖苷 (isopr叩hyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20。C至37。C振蕩 表達約12小時，生產鏈黴親和素標記的藻紅藍蛋白alpha亞基類螢光蛋白質藻藍膽素-藻紅藍蛋白A;離心收集菌體細胞，加入緩衝液、破碎細胞後，離心收集上清液，通過Ni" 親和層析，可提純得到相應的鏈黴親和素標記的藻紅藍蛋白類螢光蛋白質藻藍膽素-藻紅 藍蛋白A。將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。 實施例11(1)從GeneBank中可以查到，藻種力朋6ae朋sp. PCC7120的全序列已經測定完成， ^孤'/70^;s sp. PCC7603部分序列已經測定。^a6ae朋sp. PCC7120在GeneBank中編號
為BA000019，;K 7a肌770幼ssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254， 可從所查到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將鏈黴親和素基因(簡稱幼)和 尨2av77i/7^"s sp. PCC7603中的藻紅藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白基因拼接後克隆於 Novagen公司購買的pET30中，所得質粒叫pET30-sa~/ ecA在大腸桿菌中能表達鏈黴親 和素和藻紅藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈黴親和素標記的藻紅藍蛋白 alpha亞基脫輔基蛋白的表達質粒。根據GeneBank中査到的基因序列，設計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模 板，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下遊引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相 應質粒中同樣的酶切位點上。鏈黴親和素基因可以從GeneBank中查到，編號為AF283893,通過全基因合成得到。(2) 將』朋6ae;7a sp.PCC7120中的藻紅藍蛋白alpha亞基裂合酶基因pecf和 克隆於Novagen公司購買的pETDuet-l中，所得質粒叫pETDuet-pecf-/7ecF，在大腸桿菌 中能表達藻紅藍蛋白alpha亞基裂合酶PecE/pecF，得到藻紅藍蛋白alpha亞基裂合酶表 達質粒。(3) 將藻藍膽素生物合成酶基因之一 力o7克隆於Novagen公司的pACYCDuet-1中， 所得質粒叫pACYCDuet-力W，在大腸桿菌中能表達HOI。將藻藍膽素生物合成酶基因之一 pc州克隆於Novagen公司的pETDuet-1中，所得質 粒叫pCDFDuet-pC//!，在大腸桿菌中能表達PcyA。即脫輔基蛋白基因pec力在pET30中是在fcoRV和I兩個酶切位點之間，鏈黴親 和素基因m在和^WII兩個酶切位點之間；裂合酶基因pe"在pETDuet中，處於 第一個多克隆位點，酶切位點是AfcoI和屍stI之間，裂合酶基因pec,在pETDuet中，處 於第二個多克隆位點，酶切位點是AcoRV和之間；PCB合成酶基因是2個(hoi和 pcyA)， hoi在pACYCDuet-1中，處於第一個多克隆位點，在Nco I和Pst I之間，pcyA在 pETDuet-l中第二個多克隆位點，在Nde I和Xho I之間。基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下遊， 一對；上遊下遊引物分 別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段， 把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。(4) 將pETDuet-/ ecf-pec尺pET30-5a"/ ecz/和pACYCDuet-hoi、 pETDuet-pcyA轉入 大腸桿菌，當這些質粒都轉入大腸桿菌後得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種於pH 7. 0的LB培養基中，37。C振蕩培養至0De。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷 (is叩rophyl thicrf-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20'C至37。C振蕩 表達約12小時，生產鏈黴親和素標記的藻紅藍蛋白alpha亞基類螢光蛋白質藻藍膽素-藻紅藍蛋白A;離心收集菌體細胞，加入緩衝液、破碎細胞後，離心收集上清液，通過Nr 親和層析，可提純得到相應的鏈黴親和素標記的藻紅藍蛋白類螢光蛋白質藻藍膽素-藻紅 藍蛋白A。將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。 實施例12(1) 從GeneBank中可以查到，藻種^朋Z ae77a sp. PCC7120的全序列已經測定完成， /a/w'/ os"s sp. PCC7603部分序列已經測定。J朋Z ae朋sp. PCC7120在GeneBank中編號為BA000019，必Ja肌'/ osi/ssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254， 可從所査到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將鏈黴親和素基因(簡稱幼)和 必h/w'/wsM sp. PCC7603中的藻紅藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白基因拼接後克隆於 Novagen公司購買的pET30中，所得質粒叫pET30-^^;7ecA在大腸桿菌中能表達鏈黴親 和素和藻紅藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈黴親和素標記的藻紅藍蛋白 alpha亞基脫輔基蛋白的表達質粒。根據GeneBank中査到的基因序列，設計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模 板，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下遊引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相 應質粒中同樣的酶切位點上。鏈黴親和素基因可以從GeneBank中査到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。(2) 將必7a肌7 os"s sp. PCC7603中的藻紅藍蛋白alpha亞基裂合酶基因pecf和 pec屍克隆於Novagen公司購買的pETDuet-1中，所得質粒叫pETDuet-pecf-pec屍，在大腸 桿菌中能表達藻紅藍蛋白alpha亞基裂合酶PecE/pecF，得到藻紅藍蛋白alpha亞基裂合 酶表達質粒。(3) 將藻藍膽素生物合成酶基因之一 力W克隆於Novagen公司的pACYCDuet-1中， 所得質粒叫pACYCDuet-力o厶在大腸桿菌中能表達H01。將藻藍膽素生物合成酶基因之一 克隆於Novagen公司的pETDuet-1中，所得質 粒叫pCDFDuet-pcyA在大腸桿菌中能表達PcyA。即脫輔基蛋白基因在pET30中是在fcoRV和i7 o I兩個酶切位點之間，鏈黴親 和素基因幼在A>/7l和《^n兩個酶切位點之間；裂合酶基因pecf在pETDuet中，處於
第一個多克隆位點，酶切位點是vVco I和屍st I之間，裂合酶基因pec屍在pETDuet中，處 於第二個多克隆位點，酶切位點是AcoRV和J力ol之間；PCB合成酶基因是2個(hoi和 pcyA)， hoi在pACYCDuet-1中，處於第一個多克隆位點，在Nco I和Pst I之間，pcyA在 pETDuet-1中第二個多克隆位點，在Nde I和Xho I之間。基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下遊， 一對；上遊下遊引物分 別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段， 把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小吋)；連接產物轉化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。(4)將pETDuet-/ ecf-pec/7、 pET30-sa~ped和pACYCDuet-hol、 pETDuet-pcyA轉入 大腸桿菌，當這些質粒都轉入大腸桿菌後得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種於pH 7. 0 的LB培養基中，37'C振蕩培養至0D,為0.5至0.8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷 (isoprophyl thiof D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lramol/L， 20'C至37'C振蕩 表達約12小時，生產鏈黴親和素標記的藻紅藍蛋白alpha亞基類螢光蛋白質藻藍膽素-藻紅藍蛋白A;離心收集菌體細胞，加入緩衝液、破碎細胞後，離心收集上清液，通過Ni" 親和層析，可提純得到相應的鏈黴親和素標記的藻紅藍蛋白類螢光蛋白質藻藍膽素-藻紅 藍蛋白A。將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。 實施例13(1)從GeneBank中可以查到，藻種力朋力細a sp. PCC7120的全序列己經測定完成， 必73/wV7os^ sp. PCC7603部分序列已經測定。J/ afee朋sp. PCC7120在GeneBank中編號 為BA000019，尨Jayw'/7asiAssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254， 可從所查到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將鏈黴親和素基因(簡稱和 ^7a力ae朋sp.PCC7120中的藻紅藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白基因拼接後克隆於Novagen 公司購買的pCOLADuet-1中，所得質粒叫pCOLADuet-stpecA在大腸桿菌中能表達鏈黴 親和素和藻紅藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈黴親和素標記的藻紅藍蛋 白alpha亞基脫輔基蛋白的表達質粒。根據GeneBank中查到的基因序列，設計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模 板，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下遊引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相 應質粒中同樣的酶切位點上。 鏈黴親和素基因可以從GeneBank中查到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。(2) 將^ 3力ae朋sp.PCC7120中的藻紅藍蛋白alpha亞基裂合酶基因/ ec^禾卩/ ec屍 克隆於Novagen公司購買的pETDuet-1中，所得質粒叫pETDuet-pec￡-peoP，在大腸桿菌 中能表達藻紅藍蛋白alpha亞基裂合酶PecE/pecF，得到藻紅藍蛋白alpha亞基裂合酶表 達質粒。(3) 將藻藍膽素生物合成酶基因之一 力W克隆於Novagen公司的pACYCDuet-1中， 所得質粒叫pACYCDuet-力o厶在大腸桿菌中能表達HOl。將藻藍膽素生物合成酶基因之一 /7cW克隆於Novagen公司的pETDuet-l中，所得質 粒叫pCDFDuet-/ c/A在大腸桿菌中能表達PcyA。即鏈黴親和素基因^和脫輔基蛋白基因/^M拼接後的片段在pC0LADuet-l中是在第 一個多克隆位點的化oR I和At I兩個酶切位點之間；裂合酶基因pecf在pETDuet中， 處於第一個多克隆位點，酶切位點是7fco I和屍"I之間，裂合酶基因； ec屍在pETDuet中， 處於第二個多克隆位點，酶切位點是feoRV和A7 o1之間；PCB合成酶基因是2個(hol 和pcyA)， hol在pACYCDuet-l中，處於第一個多克隆位點，在Nco I和Pst I之間，pcyA 在pETDuet-1中第二個多克隆位點，在Nde I和Xho I之間。基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下遊， 一對；上遊下遊引物分 別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段， 把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。(4) 將pETDuet-pecf-pec,、 pC0LADuet-stped和pACYCDuet-hol 、 pETDuet-pcyA 轉入大腸桿菌，當這些質粒都轉入大腸桿菌後得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種於 pH7.0的LB培養基中，37。C振蕩培養至OD6。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-p-D-半乳糖 苷(is叩rophyl thio-(3-D-galactoside,簡稱IPTG)至終濃度為l咖ol/L， 20。C至37。C振 蕩表達約12小時，生產鏈黴親和素標記的藻紅藍蛋白alpha亞基類螢光蛋白質藻藍膽素-藻紅藍蛋白A;離心收集菌體細胞，加入緩衝液、破碎細胞後，離心收集上清液，通過Ni" 親和層析，可提純得到相應的鏈黴親和素標記的藻紅藍蛋白類螢光蛋白質藻藍膽素-藻紅 藍蛋白A。將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。 實施例14 (1) 從GeneBank中可以查到，藻種力朋力ae朋sp. PCC7120的全序列已經測定完成， #. 7a/w'y o^^ sp. PCC7603部分序列已經測定。力朋6se/7s sp. PCC7120在GeneBank中編號 為BA000019，M 7a肌'/ws"ssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254， 可從所査到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將鏈黴親和素基因(簡稱sa)和 力朋&e朋sp. PCC7120中的藻紅藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白基因拼接後克隆於Novagen 公司購買的pC0LADuet-l中，所得質粒叫pCOLADuet-sa^ecA在大腸桿菌中能表達鏈黴 親和素和藻紅藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈黴親和素標記的藻紅藍蛋 白alpha亞基脫輔基蛋白的表達質粒。根據GeneBank中査到的基因序列，設計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模 板，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下遊引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相 應質粒中同樣的酶切位點上。鏈黴親和素基因可以從GeneBank中查到，編號為AF283893,通過全基因合成得到。(2) 將尨7a則770幼s sp. PCC7603中的藻紅藍蛋白alpha亞基裂合酶基因pecf和 pec屍克隆於Novagen公司購買的pETDuet-1中，所得質粒叫pETDuet-pecf-/ ecf，在大腸 桿菌中能表達藻紅藍蛋白alpha亞基裂合酶PecE/pecF，得到藻紅藍蛋白alpha亞基裂合 酶表達質粒。(3) 將藻藍膽素生物合成酶基因之一 力W克隆於Novagen公司的pACYCDuet-1中， 所得質粒叫pACYCDuet-/w7，在大腸桿菌中能表達H01。將藻藍膽素生物合成酶基因之一 /^r/I克隆於Novagen公司的pETDuet-1中，所得質 粒叫pCDFDuet-pc/A在大腸桿菌中能表達PcyA。即鏈黴親和素基因幼和脫輔基蛋白基因pe"拼接後的片段在pCOLADuet-l中是在第 一個多克隆位點的￡boR I和I兩個酶切位點之間；裂合酶基因pecf在pETDuet中， 處於第一個多克隆位點，酶切位點是Afco I和At I之間，裂合酶基因wW在pETDuet中， 處於第二個多克隆位點，酶切位點是&oRV和J力oI之間；PCB合成酶基因是2個(hoi 和pcyA)， hoi在pACYCDuet-1中，處於第一個多克隆位點，在Nco I和Pst I之間，pcyA 在pETDuet-1中第二個多克隆位點，在Nde I和Xho I之間。基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下遊， 一對；上遊下遊引物分 別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段， 把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌，
利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。(4)將pETDuet-pecf-pec八pC0LADuet-stpec力和pACYCDuet-hol、 pETDuet-pcyA 轉入大腸桿菌，當這些質粒都轉入大腸桿菌後得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種於 pH7.0的LB培養基中，37。C振蕩培養至0D6。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-p-D-半乳糖 苷(isoprophyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為l咖ol/L， 20。C至37。C振 蕩表達約12小時，生產鏈黴親和素標記的藻紅藍蛋白alpha亞基類螢光蛋白質藻藍膽素-藻紅藍蛋白A;離心收集菌體細胞，加入緩衝液、破碎細胞後，離心收集上清液，通過Ni" 親和層析，可提純得到相應的鏈黴親和素標記的藻紅藍蛋白類螢光蛋白質藻藍膽素-藻紅 藍蛋白A。將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。 實施例15(1) 從GeneBank中可以查到，藻種顛力ae朋sp.PCC7120的全序列已經測定完成， 必7a歷i/ osiAs sp. PCC7603部分序列已經測定。力/ Wae/7a sp. PCC7120在GeneBank中編號 為BA000019，必J湖u'/ MiAS sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254， 可從所査到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將鏈黴親和素基因(簡稱幼)和 #. 7a肌'/7os^ sp. PCC7603中的藻紅藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白基因拼接後克隆於 Novagen公司購買的pCOLADuet-1中，所得質粒叫pCOLADuet-sa~pecA在大腸桿菌中能 表達鏈黴親和素和藻紅藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈黴親和素標記的 藻紅藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白的表達質粒。根據GeneBank中査到的基因序列，設計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模 板，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下遊引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相 應質粒中同樣的酶切位點上。鏈黴親和素基因可以從GeneBank中查到，編號為AF283893,通過全基因合成得到。(2) 將^ a6ae朋sp. PCC7120中的藻紅藍蛋白alpha亞基裂合酶基因/ ecf和pec, 克隆於Novagen公司購買的pETDuet-1中，所得質粒叫pETDuet-pet^-; ec,，在大腸桿菌 中能表達藻紅藍蛋白alpha亞基裂合酶PecE/pecF，得到藻紅藍蛋白alpha亞基裂合酶表 達質粒。(3) 將藻藍膽素生物合成酶基因之一 力o7克隆於Novagen公司的pACYCDuet-1中， 所得質粒叫pACYCDuet-Z o7，在大腸桿菌中能表達H01。將藻藍膽素生物合成酶基因之一 pc/j克隆於Novagen公司的pETDuet-1中，所得質 粒叫pCDFDuet-/jc/A在大腸桿菌中能表達PcyA。
即鏈黴親和素基因ss和脫輔基蛋白基因pe^拼接後的片段在pCOLADuet-1中是在第 一個多克隆位點的^boR I和屍sf I兩個酶切位點之間；裂合酶基因； ecf在pETDuet中， 處於第一個多克隆位點，酶切位點是Afco J和屍5t I之間，裂合酶基因pec屍在pETDuet中， 處於第二個多克隆位點，酶切位點是fcoRV和/Aol之間；PCB合成酶基因是2個(hoi 和pcyA)， hoi在pACYCDuet-1中，處於第一個多克隆位點，在Nco I和Pst I之間，pcyA 在pETDuet-1中第二個多克隆位點，在Nde I和Xho I之間。基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下遊， 一對；上遊下遊引物分 別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段， 把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。(4)將pETDuet-/ eci -pec屍、pC0LADuet-sa~/ ecJ和pACYCDuet-hol、 pETDuet-pcyA 轉入大腸桿菌，當這些質粒都轉入大腸桿菌後得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種於 pH7.0的LB培養基中，37'C振蕩培養至0D6。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-p-D-半乳糖 苷(is叩rophyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20。C至37。C振 蕩表達約12小時，生產鏈黴親和素標記的藻紅藍蛋白alpha亞基類螢光蛋白質藻藍膽素-藻紅藍蛋白A;離心收集菌體細胞，加入緩衝液、破碎細胞後，離心收集上清液，通過附2+ 親和層析，可提純得到相應的鏈黴親和素標記的藻紅藍蛋白類螢光蛋白質藻藍膽素-藻紅 藍蛋白A。將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。 實施例16(1)從GeneBank中可以査到，藻種力朋6ae/ a sp.PCC7120的全序列已經測定完成， 必h/w'/7os"s sp. PCC7603部分序列已經測定。力朋6ae朋sp. PCC7120在GeneBank中編號 為BA000019，尨J柳i"os"ssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254, 可從所査到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將鏈黴親和素基因(簡稱幼)和 MZ3/w'/70s"s sp. PCC7603中的藻紅藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白基因拼接後克隆於 Novagen公司購買的pC0LADuet-l中，所得質粒叫pCOLADuet-s『pecA在大腸桿菌中能 表達鏈黴親和素和藻紅藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈黴親和素標記的 藻紅藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白的表達質粒。根據GeneBank中査到的基因序列，設計了引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模
板，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下遊引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相 應質粒中同樣的酶切位點上。鏈黴親和素基因可以從GeneBank中查到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。(2) 將必Ja肌V as"s sp. PCC7603中的藻紅藍蛋白alpha亞基裂合酶基因pecf和 pec,克隆於Novagen公司購買的pETDuet-l中，所得質粒叫pETDuet-pecf-; ec屍，在大腸 桿菌中能表達藻紅藍蛋白alpha亞基裂合酶PecE/pecF，得到藻紅藍蛋白alpha亞基裂合 酶表達質粒。(3) 將藻藍膽素生物合成酶基因之一力W克隆於Novagen公司的pACYCDuet-1中， 所得質粒叫pACYCDuet-力o/，在大腸桿菌中能表達HOl。將藻藍膽素生物合成酶基因之一 pc/力克隆於Novagen公司的pETDuet-l中，所得質 粒叫pCDFDuet-z5c州，在大腸桿菌中能表達PcyA。即鏈黴親和素基因^和脫輔基蛋白基因/^d拼接後的片段在pC0LADuet-1中是在第 一個多克隆位點的^boR I和I兩個酶切位點之間；裂合酶基因/ ecf在pETDuet中， 處於第一個多克隆位點，酶切位點是Afco I和屍st I之間，裂合酶基因； eC在pETDuet中， 處於第二個多克隆位點，酶切位點是^boRV和之間；PCB合成酶基因是2個(hol 和pcyA)， hol在pACYCDuet-l中，處於第一個多克隆位點，在Nco I和Pst I之間，pcyA 在pETDuet-1中第二個多克隆位點，在Nde I和Xho I之間。基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下遊， 一對；上遊下遊引物分 別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總副A作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段， 把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。(4) 將pETDuet-/5ecf-; ec,、 pCOLADueha^ec力禾口 pACYCDuet-hol、 pETDuet-pcyA 轉入大腸桿菌，當這些質粒都轉入大腸桿菌後得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種於 pH7.0的LB培養基中，37'C振蕩培養至0D6。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-P-D-半乳糖 苷(isopr叩hyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為l咖ol/L， 20。C至37。C振 蕩表達約12小時，生產鏈黴親和素標記的藻紅藍蛋白alpha亞基類螢光蛋白質藻藍膽素-藻紅藍蛋白A;離心收集菌體細胞，加入緩衝液、破碎細胞後，離心收集上清液，通過N:T 親和層析，可提純得到相應的鏈黴親和素標記的藻紅藍蛋白類螢光蛋白質藻藍膽素-藻紅 藍蛋白A。將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。 上述製備方法適用於採用各種藍藻中的alpha亞基裂合酶、藻紅藍蛋白alpha亞基類 脫輔基蛋白和PCB生物合成酶基因或其同源基因以及鏈黴親和素基因及其同源基因來制 備鏈黴親和素標記的藻紅藍蛋白alpha亞基類螢光蛋白質，但涉及到微生物菌種公開的問 題，本發明只選用了 GenBank中已公開全序列的藍藻^7a/ se朋sp. PCC7120和已公開部分 序列的藍藻必h/w'/70s^ sp. PCC7603為例對本發明方法加以說明，本領域的技術人員可 以根據上述公開的內容採用其它原料實施本發明。
權利要求
1. 一種製備鏈黴親和素標記的藻紅藍蛋白alpha亞基類螢光蛋白質的方法，其特徵在於包括下述步驟(1)採用基因工程方法，將alpha亞基裂合酶基因或其同源基因克隆於表達載體中，得到alpha亞基裂合酶表達質粒；(2)用基因工程方法將鏈黴親和素基因和藻紅藍蛋白alpha亞基類脫輔基蛋白基因或其同源基因克隆於第二個表達載體中，得到鏈黴親和素標記的脫輔基蛋白表達質粒；(3)用基因工程方法將PCB生物合成酶基因hol和pcyA或其同源基因同時克隆於第三個表達載體中或分別克隆於第三、第四個表達載體，得到PCB合成質粒；(4)將beta裂合酶表達質粒、鏈黴親和素標記的脫輔基蛋白表達質粒、PCB生物合成酶質粒依次轉入配套的宿主菌，當這些表達質粒都轉入宿主菌後，得到相應的工程菌，將該工程菌發酵後，按常規蛋白質提純技術，提純得到相應的鏈黴親和素標記的藻紅藍蛋白alpha亞基類螢光蛋白質。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述的宿主菌為大腸桿菌。
3. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述的alpha亞基裂合酶基因是指與 力/7aZ ae/7a sp. PCC7120中pecf禾B ; ecF基因或#. 7柳^as〃s sp. PCC7603中pecf禾Q 基因同源的基因。
4. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述的藻紅藍蛋白alpha亞基類脫輔 基蛋白基因是指與^ atee/7a sp. PCC7120或；K 7柳i/ os"s sp. PCC7603中； ed同源的基 因。
全文摘要
本發明公開了一種分子設計新型鏈黴親和素標記的藻紅藍蛋白alpha亞基類螢光蛋白質的方法，通過應用藻膽蛋白alpha亞基裂合酶催化藻藍膽素與鏈黴親和素標記的藻紅藍蛋白alpha亞基類脫輔基蛋白共價結合，製備鏈黴親和素標記的藻紅藍蛋白alpha亞基類螢光蛋白質。本發明的方法應用生物過程生產鏈黴親和素標記的藻紅藍蛋白類alpha亞基螢光蛋白質，是一種環境友好的生產方法。鏈黴親和素標記的藻紅藍蛋白alpha亞基類螢光蛋白質能應用於生物學和醫藥功能材料領域，特別是應用為生物學和醫學檢測領域的螢光探針。
文檔編號C12N15/31GK101397554SQ20071003055
公開日2009年4月1日 申請日期2007年9月27日 優先權日2007年9月27日
發明者佟順剛, 坤 夏 申請人:廣州天寶頌原生物科技開發有限公司