源於BCap37的乳腺癌耐藥細胞株及其應用的製作方法

2023-05-29 00:23:56 1

專利名稱：源於BCap37的乳腺癌耐藥細胞株及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及兩株源於同一親代細胞BCap37的乳腺癌耐藥細胞株及其應用。 背景技術：
惡性腫瘤是目前包括中國在內的世界上許多國家最主要的致死原因之一(CA Cancer J Clin. 2005,55 :74-108.)。世界衛生組織(WHO)在美國亞特蘭大召開的2008年國際腫瘤學年會上提出警告，到2010年癌症將取代心血管病成為世界死亡人數最多的疾病。 我國衛生部統計資料顯示，我國每年新增腫瘤患者160 170萬，現有腫瘤患者總數約450 萬，居致死疾病的首位。化療是全世界目前治療腫瘤的主要手段之一，儘管不斷研製出新的化療藥物，也不斷應用新的化療方案，但是惡性腫瘤獲得性耐藥導致最終治療失敗。腫瘤耐藥機制十分複雜，不同的耐藥逆轉機制之間又存在錯綜複雜的關係。多藥耐藥(multidrug resistance,MDR)是其中的重要機制。多藥耐藥是腫瘤細胞免受外來有害物質損傷的自身防禦機制，是指腫瘤細胞對一種化療藥物產生抗藥性的同時也對其它從未接觸過的、結構和作用機制完全不同的抗腫瘤藥物產生抗藥性。許多天然來源的抗腫瘤藥物如紫杉醇類、 長春新鹼類，蒽環類等會誘導腫癌細胞產生MDR。ATP結合盒膜轉運蛋白超家族(ATP-binding cassette, ABC)具有ATP依賴性的藥物外排泵功能，能將藥物泵出細胞膜外而降低胞內藥物濃度，是目前MDR的主要機制。其中P-gp蛋白(P-glyeoprotein，P-gp)是目前研究較廣泛的耐藥機制。1976年，Juliano和 Ling在具有MDR表型的中國倉鼠卵巢細胞上發現一種跨膜糖蛋白，是分子量為170KD的跨膜磷酸糖蛋白(Biochim Biophys Acta，1976，455 (1) :152-162.)。腫瘤細胞膜上的 P-gp 過度表達，化療藥物與其結合後，導致ATP結合區活化，ATP水解釋放能量，在Mg2+的作用下使P-gp形態發生變化，在藥物尚未發生細胞毒作用時，即將其泵出細胞外，降低了細胞內藥物的濃度，使得細胞免受化療藥物的毒性作用而產生了 MDR(Biochem Pharmacol, 2002, 64(5-6) :943-948.)。目前研究發現人類幾乎所有腫瘤細胞中均可檢測到MDRl基因，在結腸癌、肝癌、腎癌、胰腺癌、神經母細胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、食管癌、胃癌、膀胱癌、肺癌、膽囊癌、膽管癌等癌腫中，P-gp均有不同程度的表達。耐藥細胞依據P-gp表達與否，分為P-gp 依賴型和非P-gp依賴型。通過耐藥細胞株的建立可以進一步構建體內外腫瘤耐藥模型，從而深入研究MDR 耐藥機制，甚至發現其他新的耐藥機制。2004年Yi Wang等人曾報導了通過轉染mdrl基因構建的高度表達P-gp的Bcap37細胞。親代Bcap37細胞和高表達P_gp的Bcap37耐藥株可用於P-gp底物的篩選及作為研究藥物生物學分布和藥物動力學的模型(World Journal ofGastroenterology 2004，10 (9) 1365-1368)，但這是在 BCap37 細胞中導入外源性的 MDRl基因，具有一定的局限性。Masashi Takeda等篩選出耐紫杉醇的DU145和PC-3細胞株，並用表觀遺傳學和DNA晶片技術分析其潛在的分子耐藥機制(The Prostate 2007,67 955-967)，但只得到了 P-gp依賴型的耐藥細胞株。
發明內容
本發明目的是提供兩株源於同一親代細胞BCap37的P_gp依賴型和非P_gp依賴型的乳腺癌耐藥細胞株及其應用。本發明採用的技術方案是一種非P-gp依賴型乳腺癌耐藥細胞株bast72，保藏於中國典型培養物保藏中心， 地址中國，武漢，武漢大學，430072，保藏日期2010年8月17日，保藏編號CCTCC No C201065。一種P-gp依賴型乳腺癌耐藥細胞株bads200，保藏於中國典型培養物保藏中心， 地址中國，武漢，武漢大學，430072，保藏日期2010年8月17日，保藏編號CCTCC No C201066。本發明細胞株採用改創的「兩階篩選法」獲得，其中Bats-72通過依賴於紫杉醇高劑量衝擊時間遞增的「兩階篩選法」獲得，Bads-200通過依賴於紫杉醇劑量遞增的「兩階篩選法」獲得。「兩階篩選法」分為耐藥性適應階段和鞏固階段。在適應階段注重於讓腫瘤細胞逐漸適應於藥物(如紫杉醇)刺激，並不斷地擴增藥物處理後的存活細胞；而在鞏固階段則是通過加強藥物刺激強度，對逐漸適應於藥物刺激存活細胞的耐藥性狀進行鞏固。普通藥物高劑量衝擊誘導腫瘤細胞耐藥株，都是短時間固定衝擊(通常為1 6 小時)，所得細胞株耐藥係數不高，相關細胞特性不突出，而依賴於藥物高劑量衝擊時間遞增的「兩階篩選法」可將衝擊時間提高至72h，可大幅提高所得細胞株耐藥性狀，本發明提供的耐藥株Bats-72對紫杉醇的耐藥性是其親代BCap37細胞的113. 5倍。本發明乳腺癌耐藥細胞株Bats-72的具體篩選操作為1)適應階段；BCap37細胞用增殖培養液(含10 %小牛血清的1640培養液)，5 % CO2, 37°C條件下，培養至70 % 90 % 貼壁率時，去上清，加入200nM紫杉醇培養液(含200nM紫杉醇的增殖培養液)衝擊培養1 小時，去200nM紫杉醇培養液，空白1640培養液洗滌2次後，更換增殖培養液培養72_%h擴增存活細胞。至存活細胞擴增至70% 90%貼壁率時，再重複用200nM紫杉醇培養液衝擊培養1小時2次，即總共完成3次200nM紫杉醇培養液衝擊培養1小時，細胞命名為Bats-I。 進一步以Bats-I細胞為基礎，重複上述操作，將篩選條件依次改為200nM紫杉醇培養液衝擊培養 2、4、12、24、和 48 小時，依次獲得 Bats-2、Bats-4、Bats-12、Bats-24、Bats_48 細胞。 2)鞏固階段以Bats-48細胞為基礎，用200nM紫杉醇培養液衝擊培養72小時，換殖培養液擴增48h，重複10次，得至Bats-72細胞。而普通藥物劑量遞增誘導法篩選腫瘤細胞耐藥株至少需要近一年的時間，而依賴於藥物劑量遞增的「兩階篩選法」可大為縮減篩選時間，本發明提供的耐藥株Bads-200僅需約3個月時間，對紫杉醇的耐藥性是其親代BCap37細胞的1137. 5倍。本發明乳腺癌耐藥細胞株Bads-200的具體篩選操作為1)適應階段；BCap37細胞用增殖培養液，5% CO2, 370C條件下，培養至70 % -90 %貼壁率時，去上清，加入5nM紫杉醇培養液(含5nM紫杉醇的增殖培養液)持續培養72小時，去5nM紫杉醇培養液，空白 1640培養液洗滌2次後，更換增殖培養液培養48-7 擴增存活細胞。至存活細胞擴增至 70% -90%貼壁率時，再重複用5nM紫杉醇培養液持續培養72小時2次，即總共完成3次 5nM紫杉醇培養液持續培養72小時，細胞命名為Bads-5。進一步以Bads-5細胞為基礎，重複上述操作，將篩選條件依次改為10nM，20nM, 50nM, IOOnM紫杉醇培養液持續培養72小時，依次獲得Bads-10、Bads-20、Bads-50、Bads-100細胞。2)鞏固階段以Bads-IOO細胞為基礎，一直用200nM紫杉醇培養液持續培養，得至Bads-200細胞。所述的乳腺癌耐藥細胞株bast72或kidS200可用於構建體內外腫瘤耐藥模型，進一步可用於篩選新的抗腫瘤藥物。本發明提供了兩種新型乳腺癌耐藥細胞株Bats-72和Bads-200，兩者均起源於 BCap37細胞，Bats-72不表達P_gp蛋白，而Bads-200過表達P_gp。這表明Bats-72是非 P-gp依賴耐藥細胞株，而Bads-200是P-gp依賴型的耐藥細胞株。這一特有的生物學特性使其可以廣泛應用於研究腫瘤耐藥機制和逆轉腫瘤多藥耐藥、提取腫瘤耐藥標誌物、篩選和評估新型腫瘤藥物、單克隆抗體藥物的生產等，具有較高的科研和生產應用的價值，預期能產生良好的科研、經濟和社會效益。


圖1為BCap37，Bats-72和Bads-200細胞在倒置光鏡和Giemsa染色後在正置顯微鏡下拍攝的照片；圖2為BCap37，Bats-72和Bads-200細胞生長曲線檢測；圖3紫杉醇對BCap37，Bats-72和Bads-200細胞毒性檢測；圖4為BCap37，Bats-72和Bads-200細胞P_gp表達檢測；其中陽性對照為MCF7/ ADR ；圖5為多西紫杉醇，長春瑞濱，阿黴素，依託泊苷，5-氟尿嘧啶，順鉬，甲氨蝶呤，健擇對BCap37，Bats-72和Bads-200細胞的細胞毒性檢測。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護範圍並不僅限於此實施例1 :BCap37，Bats-72和Bads-200細胞形態學檢測(1)實驗材料細胞株紫杉醇敏感細胞株BCap37 (從中科院上海細胞庫定購)。兩種新型細胞株 Bats-72(CCTCC No :C201065)和 Bads-200 (CCTCC No :C201066)；試劑耗材1640培養液(杭州吉諾生物醫藥技術有限公司)，超級新生牛血清(上海依科賽生物製品有限公司)，基本培養液(含10%新生牛血清的1640培養液)，篩選培養液(含200nM紫杉醇的基本培養液)，Giemsa染色試劑盒(上海源葉生物科技有限公司)， 35mm培養皿(Corning)；儀器倒置顯微鏡，正置顯微鏡，細胞培養箱，超淨工作檯。(2)實驗方法BCap37, Bats-72 和 Bads-200 分別接種於；35讓培養皿，BCap37 和 Bats-72 使用基本培養液，Bads-200用篩選培養液，分別培養72小時，更換新鮮基本培養液，倒置顯微鏡上觀察，拍照。去培養液，PBS洗滌2次，Giemsa染色(完全按照試劑盒操作說明)，正置顯微鏡下觀察，拍照。(3)實驗結果
結果見圖1，與親代細胞BCap37比較，Bats_72細胞體積增大，細胞間距增大，克隆生長相對鬆散；Bads-200形態學與BCap37差異不大，克隆生長相對更緊密，克隆邊緣相對更規整。(4)結論Bats-72和Bads-200細胞形態上較BCap37有所改變。實施例2 :BCap37, Bats-72和Bads-200細胞生長曲線檢測(1)實驗材料細胞株同實施例1;試劑耗材1640培養液(杭州吉諾),0. 25%胰酶(杭州吉諾)，超級新生牛血清 (上海依科賽)，基本培養液(含10%新生牛血清的1640培養液)，篩選培養液(含200nM 紫杉醇的基本培養液)，IOOmm培養皿(Corning)，6孔板(Corning)；儀器倒置顯微鏡，細胞培養箱，超淨工作檯，血球細胞計數器。(2)實驗方法BCap37, Bats-72 和 Bads-200 接種於 IOOmm 培養皿，BCap37 和 Bats-72 使用基本培養液，Bads-200用篩選培養液分別培養72小時，0. 25%胰酶消化，收集細胞，細胞計數， 配製20000個/ml濃度的單細胞懸液，分別每孔接種2ml單細胞懸液至5塊6孔板，每總細胞數為40000個。依據情況更換新鮮基本培養液，保證充足的營養成分，分別在對、48、72、 96、120、144、168、196J40小時，消化3孔細胞計數，取平均值，繪製生長曲線，並計算細胞倍增時間。(3)實驗結果結果見圖2，親代細胞BCap37增殖最快，以平均每21. 6小時倍增速度生長； Bads-200細胞次之，以平均每沈.2小時倍增速度生長；Bats-72細胞增殖速度相對最慢，以平均每39. 4時倍增速度生長；(4)結論Bats-72和Bads-200相對於親代細胞BCap37增殖速度有不同程度的減慢。實施例3 紫杉醇對BCap37，Bats-72和Bads-200細胞毒性檢測。(1)實驗材料細胞株紫杉醇敏感細胞株BCap37，兩種新型細胞株Bats-72和Bads-200試劑耗材1640培養液(杭州吉諾)，0· 25%胰酶(杭州吉諾)，超級新生牛血清(上海依科賽)， 基本培養液(含10%新生牛血清的1640培養液)，篩選培養液(含200nM紫杉醇的基本培養液)，IOOmm培養皿(Corning)，96孔板(Corning)，DMSO (上海國藥)，MTT，紫杉醇。儀器細胞培養箱，超淨工作檯，血球細胞計數器，酶標儀。(2)實驗方法BCap37, Bats-72 和 Bads-200 接種於 IOOmm 培養皿，BCap37 和 Bats-72 使用基本培養液，Bads-200用篩選培養液分別培養72小時，0. 25%胰酶消化，收集細胞，細胞計數， 配製20000個/ml濃度的單細胞懸液，分別每孔接種0. 2ml單細胞懸液至96孔板，每總細胞數為4000個，培養過液，加入紫杉醇處理，BCap37細胞處理濃度為0、1、2、5、10、20、50、 100、200、500nM。Bats-72 和 Bads200 細胞處理濃度為(05、10、20、50、100、200、500、1000、 2000、5000nM紫杉醇處理72h，去上清，加入0. 2ml DMSO,酶標儀570nM波長檢測OD值。
(3)實驗結果結果見圖3，紫杉醇對BCap37、Bats_72和Bads-200細胞的IC50分別為4、妨4和 4550nM, Bats-72的耐藥係數為113. 5，Bads-200的耐藥係數為1137. 5。(4)結論相對於BCap37，Bats-72和Bads-200對紫杉醇產生了不同程度的耐受。實施例 4 多西紫杉醇，長春瑞濱，阿黴素，依託泊苷，5-氟尿嘧啶，順鉬，甲氨蝶呤，健擇對BCap37， Bats-72和Bads-200細胞的細胞毒性檢測。(1)實驗材料細胞株紫杉醇敏感細胞株BCap37，兩種新型細胞株Bats-72和Bads-200試劑耗材1640培養液(杭州吉諾)，0· 25%胰酶(杭州吉諾)，超級新生牛血清(上海依科賽)， 基本培養液(含10%新生牛血清的1640培養液)，篩選培養液(含200nM紫杉醇的基本培養液)，IOOmm培養皿(Corning)，96孔板(Corning)，DMSO(上海國藥)，MTT，多西紫杉醇， 長春瑞濱，阿黴素，依託泊苷，5-氟尿嘧啶，順鉬，甲氨蝶呤，健擇(Gemzer)；儀器細胞培養箱，超淨工作檯，血球細胞計數器，酶標儀。(2)實驗方法BCap37, Bats-72 和 Bads-200 接種於 IOOmm 培養皿，BCap37 和 Bats-72 使用基本培養液，Bads-200用篩選培養液分別培養72小時，0. 25%胰酶消化，收集細胞，細胞計數， 配製20000個/ml濃度的單細胞懸液，分別每孔接種0. 2ml單細胞懸液至96孔板，每總細胞數為4000個，培養過液，加入藥物處理處理，處理終濃度如下多西紫杉醇為0、1、2、5、10、 20、50、100、200、500、1000、2000、和 5000nM ；長春瑞濱為 0、10、20、50、100、200、500、1000、 2000、和 5000nM ；阿黴素為 0、20、50、100、200、500、1000、2000、5000 和 IOOOOnM ；依託泊苷為 0,0. 5、1、2、5、10、20、50、100 和 200uM ；5-氟尿嘧啶為 0,0. 5、1、2、5、10、20、50、100 和 200uM ；順鉬為 0、20、50、100、200、500、1000、2000、5000 和 IOOOOnM ；甲氨蝶呤為 0、1、2、5、 10、20、50、100、200 和 500nM ；健擇為 5、10、20、50、100、200、500、1000 和 2000nM。藥物處理 72h，去上清，加入0. 2ml DMSO,酶標儀570nM波長檢測OD值。(3)實驗結果實驗結果如圖4和表1所示，Bats-72和Bads-200對多西紫杉醇、長春瑞濱、阿黴素、依託泊苷都耐受，對5-氟尿嘧啶、順鉬都不耐受，但是Bats-72對甲氨蝶呤，健擇耐受， Bads-200對甲氨蝶呤、健擇卻不耐受；BCap37Bats-72 和 Bads-200 細胞的 IC50 分別為 4、454 和 4550nM，Bats-72 的耐藥係數為113. 5，Bads-200的耐藥係數為1137. 5。(4)結論Bats-72和Bads-200為選擇性多藥耐藥細胞株，並且兩者的耐藥性存在差異，可組合用於新的抗腫瘤藥物的篩選和抗腫瘤藥物耐藥機制的研究。實施例5 :BCap37, Bats-72 和 Bads_200P-gp 細胞形態學檢測(1)實驗材料細胞株紫杉醇敏感細胞株BCap37，兩種新型細胞株Bats-72和Bads-200，P-gp 陽性細胞株MCF7/ADR(從中科院上海細胞庫定購)。試劑耗材1640培養液(杭州吉諾),0. 25%胰酶(杭州吉諾)，超級新生牛血清
7(上海依科賽)，基本培養液(含10%新生牛血清的1640培養液)，篩選培養液(含200nM 紫杉醇的基本培養液)，PBS，Tween-20，IOOmm培養皿(Corning)，蛋白裂解液(碧雲天生物技術有限公司)，BCA蛋白定量試劑盒(碧雲天生物技術有限公司)，一抗anti-P-gp (Santa Cruz，sc-55510)，二抗(Santa Cruz，sc-2005)，ECL 試劑盒，顯影暗匣，X-膠片，0. 45um PVDF膜。儀器細胞培養箱，超淨工作檯，酶標儀。(2)實驗方法細胞接種於IOOmm培養皿，培養Cap37和Bats-72使用基本培養液，Bads-200用篩選培養液分別培養72小時，0. 25%胰酶消化，收集細胞，分別加入0. 15 0. 3ml細胞裂解液，冰浴裂解30分鐘，12000g離心30分鐘，取上清。按BCA蛋白定量試劑盒操作說明進行蛋白濃度測定。配製7. 5%濃度分離膠，上樣40ug蛋白量，SDS-PAGE操作，100V, 150分鐘條件下，將蛋白轉移至0.45um PVDF膜上。5%脫脂牛奶封閉1小時，一抗4°C孵化過夜， 二抗室溫孵化3小時，按ECL試劑盒操作進行顯影。(3)實驗結果結果見圖5，Bats-72與親代細胞BCap37 —樣，為P_gp陰性，而Bads-200則高表達P-gp。(4)結論Bats-72是非P_gp依賴耐藥細胞株，而Bads-200是P_gp依賴的耐藥細胞株。
權利要求
1.一種非P-gp依賴型乳腺癌耐藥細胞株bast72，保藏於中國典型培養物保藏中心， 地址中國，武漢，武漢大學，430072，保藏日期2010年8月17日，保藏編號CCTCC No: C201065。
2.—種P-gp依賴型乳腺癌耐藥細胞株bads200，保藏於中國典型培養物保藏中心， 地址中國，武漢，武漢大學，430072，保藏日期2010年8月17日，保藏編號CCTCC No: C201066。
3.如權利要求1或2所述的乳腺癌耐藥細胞株bast72或kidS200在構建體內外腫瘤耐藥模型中的應用。
4.如權利要求1或2所述的乳腺癌耐藥細胞株bast72或bads200在篩選抗腫瘤藥物中的應用。
全文摘要
本發明提供了兩株源於同一親代細胞BCap37的P-gp依賴型和非P-gp依賴型的乳腺癌耐藥細胞株及其應用。本發明提供了兩種新型乳腺癌耐藥細胞株Bats-72和Bads-200，兩者均起源於BCap37細胞，Bats-72不表達P-gp蛋白，而Bads-200過表達P-gp。這表明Bats-72是非P-gp依賴耐藥細胞株，而Bads-200是P-gp依賴型的耐藥細胞株。這一特有的生物學特性使其可以廣泛應用於研究腫瘤耐藥機制和逆轉腫瘤多藥耐藥、提取腫瘤耐藥標誌物、篩選和評估新型腫瘤藥物、單克隆抗體藥物的生產等，具有較高的科研和生產應用的價值，預期能產生良好的科研、經濟和社會效益。
文檔編號C12Q1/02GK102268406SQ20101050265
公開日2011年12月7日 申請日期2010年10月11日 優先權日2010年10月11日
發明者範偉民, 蔣東海, 隋梅花 申請人:浙江大學