系統性紅斑狼瘡外周血單個核細胞超保守區域轉錄表達基因模型的構建方法與應用的製作方法

2023-05-28 18:24:21

系統性紅斑狼瘡外周血單個核細胞超保守區域轉錄表達基因模型的構建方法與應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及系統性紅斑狼瘡外周血單個核細胞超保守區域轉錄表達基因模型的構建方法與應用，構建方法包括以下步驟：設置SLE組與正常對照組，每組包括若干份全血標本，分離得到外周血單個核細胞；測定標本RNA的含量、質量與完整性，確定可用則執行下一步驟；採用T-UCR晶片分析人體T-UCRs表達水平，檢測基因特異性探針標記的UCRs；進行RNA標記和晶片雜交；採用特徵提取方法，分析晶片掃描結果；採用FC過濾鑑定差異表達的潛在T-UCRs及與其重疊UCRs的RNA轉錄子，採用GO分析測定與UCRs相關聯的差異性mRNA在生物進程中的作用；比較兩組中各標本間的倍數變化，篩選出表達差異的RNA。
【專利說明】系統性紅斑狼瘡外周血單個核細胞超保守區域轉錄表達基因模型的構建方法與應用【【技術領域】】
[0001]本發明涉及系統性紅斑狼瘡領域，尤其涉及一種系統性紅斑狼瘡外周血單個核細胞超保守區域轉錄表達基因模型的構建方法與應用。
【【背景技術】】
[0002]系統性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus, SLE)是一種與瀰漫性結締組織相關的典型的全身性自身免疫病，其具有重要的特徵是發生免疫炎症。SLE的發病機制複雜，涉及家族遺傳，免疫和環境因素等，可能會導致組織和器官的損害，其中最複雜的是腎功能損害。
[0003]最近研究發現，在人、小鼠和大鼠基因中極度保守的長段非編碼基因區域，命名為超保守區域(ultra-conserved regions, UCRs)。UCR 為長約 200 ~779bp 的序列，最初於2004年由Be j erano發現。UCR常位於腫瘤相關的基因區域或脆性位點。UCR編碼的一群特殊的非編碼核糖核酸(ncRNA),稱為超保守區域轉錄子(transcribedultraconserved regions, T-UCRs),在人腫瘤中其表達發生變化。T-UCR是長鏈非編碼核糖核酸(Long-noncoding RNA, IncRNA)重要組成部分,轉錄自人類基因組中481個極度保守區域(Ultraconserved regions),在白血病、肝癌、結腸癌、神經母細胞瘤等多種癌症中會改變表達模式。這表明，T-UCRs參與癌症生物學和腫瘤發生，並有可能作為疾病診斷，預後和預測的指標，以及一類新的治療靶點。
[0004]但是，T-UCRs尚未有應用於SLE的研究。
【
【發明內容】
】
[0005]有鑑於此，有必要提出系統性紅斑狼瘡外周血單個核細胞超保守區域轉錄表達基因模型的構建方法與應用。
[0006]本發明的一個技術方案是系統性紅斑狼瘡外周血單個核細胞超保守區域轉錄表達基因模型的構建方法，其包括以下步驟:SI，設置系統性紅斑狼瘡組與正常對照組，每組包括若干份相異人體的已經脫離人體的全血標本，分別分離得到外周血單個核細胞；S2，測定標本核糖核酸的含量、質 量與完整性，確定可用，則執行下一步驟；S3，採用超保守區域轉錄子晶片分析人體超保守區域轉錄子表達水平，檢測基因特異性探針標記的超保守區域基因；S4，進行核糖核酸標記和晶片雜交；S5，採用特徵提取方法，分析獲得的晶片掃描結果，過濾低強度表達的探針，將原始信號探針的強度進行歸一化；S6，採用倍數變化方法過濾鑑定差異表達的潛在的超保守區域轉錄子及與其重疊超保守區域的核糖核酸轉錄子，並採用基因本體論方法分析測定與超保守區域相關聯的差異性的信使核糖核酸在生物進程中的作用；S7，比較所述系統性紅斑狼瘡組與所述正常對照組中各標本間的倍數變化，篩選出表達差異的核糖核酸。
[0007]優選的，所述構建方法中，步驟S2中，採用全波長超微量分光光度計測定標本核糖核酸的含量與質量，用瓊脂凝膠電泳評估標本核糖核酸的完整性。
[0008]優選的，所述構建方法中，步驟S3中，在各超保守區域基因的兩端分別添加Ikb的片段，然後用40bp的特異性探針標記。
[0009]優選的，所述構建方法中，步驟S4中，採用單色晶片基底基因表達分析方案進行核糖核酸標記和晶片雜交，把信使核糖核酸和長鏈非編碼核糖核酸在去除核糖體核糖核酸後從總核糖核酸中純化出來。
[0010]優選的，所述構建方法中，步驟S5中，篩選出至少1/3樣本的信使核糖核酸和長鏈非編碼核糖核酸。
[0011]優選的，所述構建方法中，步驟S7中，設置所述倍數變化的閾值> 2.0。
[0012]優選的，所述構建方法中，所述基因模型中，包括表達上調的8個超保守區域轉錄子，以及表達下調的29個超保守區域轉錄子，並且，各所述超保守區域轉錄子均為外顯子。
[0013]優選的，所述構建方法中，表達上調的8個超保守區域轉錄子包括uc.285+、uc.234+、uc.102+、uc.341+、uc.267+、uc.221-、uc.290-以及 uc.90+，表達下調的 32 個超保守區域轉錄子包括 uc.101-、uc.138-、uc.141-、uc.144-、uc.151-、uc.166-、uc.173+、uc.185-、uc.186-、uc.208-、uc.209-、uc.266+、uc.267+、uc.268-、uc.276+、uc.280+、uc.28+、uc.324_、uc.36+、uc.418-、uc.419-、uc.420_、uc.45_、uc.455-、uc.457-、uc.46_、uc.475+、uc.50_、uc.61_、uc.63_、uc.77-以及 uc.97+。
[0014]本發明的又一個技術方案是採用任一上述構建方法所得到的系統性紅斑狼瘡外周血單個核細胞超保守區域轉錄表達基因模型在獲取系統性紅斑狼瘡標誌物的應用。
[0015]優選的，所述應用中，所述基因模型包括基因HNRNPH1。
[0016]上述方案獲得了外周血單個核細胞的T-UCRs的差異表達情況相關聯的關鍵基因，可能作為SLE的潛在的生物標誌物或是治療靶點，並且由於標本量小而且結果的穩定性和準確性，對於臨床方面的轉錄表達調控研究具有特別重要的意義。
【【專利附圖】

【附圖說明】】
[0017]圖1是本發明一個實施例的示意圖。
【【具體實施方式】】
[0018]為了便於理解本發明，下面結合附圖和具體實施例，對本發明進行更詳細的說明。附圖中給出了本發明的較佳的實施例。但是，本發明可以採用許多不同的形式來實現，並不限於本說明書所描述的實施例。相反地，提供這些實施例的目的是使對本發明的公開內容的理解更加透徹全面。
[0019] 除非另有定義，本說明書所使用的所有的技術和科學術語與屬於本發明的【技術領域】的技術人員通常理解的含義相同。本說明書中在本發明的說明書中所使用的術語只是為了描述具體的實施例的目的，不是用於限制本發明。本說明書所使用的術語「和/或」包括一個或多個相關的所列項目的任意的和所有的組合。
[0020]本發明旨在通過對系統性紅斑狼瘡的單個核細胞的T-UCRs的表達水平研究，發現其臨床病理特徵，以及新的可能的診斷或預後生物標誌物。如圖1所示，本發明的一個實施例是，系統性紅斑狼瘡外周血單個核細胞超保守區域轉錄表達基因模型的構建方法，其包括以下步驟:S1，設置系統性紅斑狼瘡組與正常對照組，每組包括若干份相異人體的已經脫離人體的全血標本，分別分離得到外周血單個核細胞；S2，測定標本核糖核酸的含量、質量與完整性，確定可用，則執行下一步驟；S3，採用超保守區域轉錄子晶片分析人體超保守區域轉錄子表達水平，檢測基因特異性探針標記的超保守區域基因；S4，進行核糖核酸標記和晶片雜交；S5，採用特徵提取方法，分析獲得的晶片掃描結果，過濾低強度表達的探針，將原始信號探針的強度進行歸一化；S6，採用倍數變化方法過濾鑑定差異表達的潛在的超保守區域轉錄子及與其重疊超保守區域的核糖核酸轉錄子，並採用基因本體論方法分析測定與超保守區域相關聯的差異性的信使核糖核酸在生物進程中的作用；S7，比較所述系統性紅斑狼瘡組與所述正常對照組中各標本間的倍數變化，篩選出表達差異的核糖核酸。
[0021]又一個實施例是，系統性紅斑狼瘡外周血單個核細胞超保守區域轉錄表達基因模型的構建方法，其包括以下步驟。
[0022]SI，設置系統性紅斑狼瘡組與正常對照組，每組包括若干份相異人體的已經脫離人體的全血標本，分別分離得到外周血單個核細胞；優選的，分離後置於_80°C保存。
[0023]例如，本發明各實施例採用兩組全血標本，採集時間為2011年I月-9月，分別來自15名系統性紅斑狼瘡患者和15名健康正常對照組，對應作為系統性紅斑狼瘡組與正常對照組。如表1所示，這兩組全血標本均來自中國廣西桂林第一八一醫院，標本分離得到所需外周血單個核細胞後放置於_80°C保存。需要說明的是，標本收集的方案與執行，均獲得廣西代謝性疾病重點實驗室和第一八一醫院倫理委員會的批准。
[0024]表1系統性紅斑狼瘡標本特徵(n=15)
[0025]
【權利要求】
1.系統性紅斑狼瘡外周血單個核細胞超保守區域轉錄表達基因模型的構建方法，其特徵在於，包括以下步驟: S1，設置系統性紅斑狼瘡組與正常對照組，每組包括若干份相異人體的已經脫離人體的全血標本，分別分離得到外周血單個核細胞； S2，測定標本核糖核酸的含量、質量與完整性，確定可用，則執行下一步驟； S3，採用超保守區域轉錄子晶片分析人體超保守區域轉錄子表達水平，檢測基因特異性探針標記的超保守區域基因； S4，進行核糖核酸標記和晶片雜交； S5，採用特徵提取方法，分析獲得的晶片掃描結果，過濾低強度表達的探針，將原始信號探針的強度進行歸一化； S6，採用倍數變化方法過濾鑑定差異表達的潛在的超保守區域轉錄子及與其重疊超保守區域的核糖核酸轉錄子，並採用基因本體論方法分析測定與超保守區域相關聯的差異性的信使核糖核酸在生物進程中的作用； S7，比較所述系統性紅斑狼瘡組與所述正常對照組中各標本間的倍數變化，篩選出表達差異的核糖核酸。
2.根據權利要求1所述構建方法，其特徵在於，步驟S2中，採用全波長超微量分光光度計測定標本核糖核酸的含量與質量，用瓊脂凝膠電泳評估標本核糖核酸的完整性。
3.根據權利要求2所述構建方法，其特徵在於，步驟S3中，在各超保守區域基因的兩端分別添加Ikb的片段，然後用40bp的特異性探針標記。
4.根據權利要求3所述構建方法，其特徵在於，步驟S4中，採用單色晶片基底基因表達分析方案進行核糖核酸標記和晶片雜交，把信使核糖核酸和長鏈非編碼核糖核酸在去除核糖體核糖核酸後從總核糖核酸中純化出來。
5.根據權利要求4所述構建方法，其特徵在於，步驟S5中，篩選出至少1/3樣本的信使核糖核酸和長鏈非編碼核糖核酸。
6.根據權利要求5所述構建方法，其特徵在於，步驟S7中，設置所述倍數變化的閾值^ 2.0。
7.根據權利要求6所述構建方法，其特徵在於，所述基因模型中，包括表達上調的8個超保守區域轉錄子，以及表達下調的32個超保守區域轉錄子，並且，各所述超保守區域轉錄子均為外顯子。
8.根據權利要求7所述構建方法，其特徵在於，表達上調的8個超保守區域轉錄子包括uc.285+、uc.234+、uc.102+、uc.341+、uc.267+、uc.221-、uc.290-以及 uc.90+,表達下調的 32 個超保守區域轉錄子包括 uc.101-、uc.138-、uc.141-、uc.144-、uc.151-、uc.166-、uc.173+、uc.185-、uc.186-、uc.208-、uc.209-、uc.266+、uc.267+、uc.268-、uc.276+、uc.280+、uc.28+、uc.324_、uc.36+、uc.418_、uc.419_、uc.420_、uc.45_、uc.455_、uc.457-、uc.46-、uc.475+、uc.50-、uc.61-、uc.63-、uc.77-以及 uc.97+。
9.採用如權利要求1至8任一所述構建方法所得到的系統性紅斑狼瘡外周血單個核細胞超保守區域轉錄表達基因模型在獲取系統性紅斑狼瘡標誌物的應用。
10.根據權利要求9所述應用，其特徵在於，所述基因模型包括基因HNRNPH1。
【文檔編號】C12N5/0786GK103911437SQ201410093623
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2014年3月13日 優先權日:2014年3月13日
【發明者】眭維國, 戴勇, 曹翠輝, 薛雯 申請人:眭維國, 戴勇