一種提取魚類基因組dna的方法
2023-05-29 03:11:26
專利名稱：一種提取魚類基因組dna的方法
技術領域：
本發明涉及一種提取基因組DNA的方法。
背景技術：
聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)是80年代中期發展起來的體 外核酸擴增技術，它具有特異、敏感、快速、簡便、重複性好和易自動化等特點，目前已成為 生物學研究領域不可或缺的研究方法。在水產魚類生物學研究中，PCR方法是進行核酸檢 測的首先方法。目前基因組DNA提取主要採用蛋白酶K的方法。首先應用蛋白酶K將樣品消化 後，採用酚/氯仿進行2 3次抽提，去除雜蛋白，如果鹽離子濃度較高，須透析，然後加入 2倍體積無水乙醇沉澱、75%酒精洗滌，待乾燥後，加入1/10TE溶解，該過程耗時長，工作量 較大。特別對於魚類生物學研究，樣品數量多，因此基因組DNA提取的工作量無疑將是更大 的，而且提取樣品中鹽離子濃度的高低直接影響提取DNA的質量和PCR擴增效率。
發明內容
本發明的目的是為了解決目前魚類普通PCR反應模板提取工作量大、時間長的問 題，而提供一種提取魚類基因組DNA的方法。提取魚類基因組DNA的方法按以下步驟實現一、魚類採集樣品製備；二、魚類基 因組DNA提取；三、PCR擴增；步驟二是將鹼性反應液加入裝有魚類採集樣品的試管並沒過 魚類採集樣品，然後置於95士2°C的環境中作用30 90min，再冰浴，加入與鹼性反應液等 體積的中和反應液並震蕩2 3min，然後離心保留離心上清液，即得到魚類基因組DNA模 板；步驟二中鹼性反應液由乙二胺四乙酸二鈉溶液和氫氧化鈉溶液組成，鹼性反應液中乙 二胺四乙酸二鈉的濃度為0. 2mmol/L、氫氧化鈉的濃度為25mmol/L ；步驟二中中和反應液 是濃度是40mmol/L、pH值為8. 0的Tris-HCL ；步驟三PCR擴增反應體系為15μ L由1. 5μ L 的 10 X PCRbuffer、0. 3 μ L 濃度為 10mmol/L 的 dNTP、0. 6U 的 TaqDNA 聚合酶、1 μ L 魚類基因 組DNA模板、1 μ L濃度為0. 1 μ mol/L的上遊引物、1 μ L濃度為0. 1 μ mol/L的下遊引物和 餘量的滅菌雙蒸水組成。本發明方法提取魚類基因組DNA所用的時間為蛋白酶K提取魚類基因組DNA方法 的1/5 1/10，而且只需要EDTA、Na0H和Tris-HCL(pH 8. 0)三種普通試劑，不需要蛋白酶 K等特殊試劑，大大降低了反應成本。由於本發明方法在魚類基因組提取過程中不發生樣品上清液轉移、沉澱等多步操 作，確保了樣品在製作過程中沒有丟失，從而保證了實驗過程中樣品的數目，尤其是對於較 珍貴的魚類樣品。同時，本發明方法所需樣品數量較少，尤其對於魚類受精卵和剛孵化魚苗 均適用，因此本發明方法能夠克服樣品基因組DNA量較少的問題，從而使反應實驗順利進 行。
圖1是具體實施方式
六中利用引物HLJ058對鯉魚進行PCR擴增，得到的擴增圖譜。圖2是具體實施方式
六中利用引物HLJ328對鯉魚進行PCR擴增，得到的擴增圖譜。圖3是具體實施方式
六中利用引物HLJ360對鯉魚進行PCR擴增，得到的擴增圖譜。圖4是具體實施方式
六中利用引物HLJ379對鯉魚進行PCR擴增，得到的擴增圖譜。圖5是具體實施方式
六中利用引物HLJ383對鯉魚進行PCR擴增，得到的擴增圖譜。圖6是具體實施方式
六中利用引物HLJ041對鯉魚進行PCR擴增，得到的擴增圖譜。圖7是具體實施方式
六中利用引物HLJ044對鯉魚進行PCR擴增，得到的擴增圖譜。圖8是具體實施方式
六中利用引物HLJ046對鯉魚進行PCR擴增，得到的擴增圖譜。圖9是具體實施方式
六中利用引物HLJ693對鯉魚進行PCR擴增，得到的擴增圖譜。圖10是具體實施方式
六中利用引物HLJ809對鯉魚進行PCR擴增，得到的擴增圖譜。
具體實施例方式本發明技術方案不局限於以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方式
間的 任意組合。
具體實施方式
一本實施方式提取魚類基因組DNA的方法按以下步驟實現一、魚 類採集樣品製備；二、魚類基因組DNA提取；三、PCR擴增；步驟二是將鹼性反應液加入裝有 魚類採集樣品的試管並沒過魚類採集樣品，然後置於95士2°C的環境中作用30 90min，再 冰浴，加入與鹼性反應液等體積的中和反應液並震蕩2 3min，然後離心保留離心上清液， 即得到魚類基因組DNA模板；步驟二中鹼性反應液由乙二胺四乙酸二鈉溶液和氫氧化鈉溶 液組成，鹼性反應液中乙二胺四乙酸二鈉的濃度為0. 2mmol/L、氫氧化鈉的濃度為25mmol/ L ；步驟二中中和反應液是濃度為40mmol/L、pH值為8. 0的Tris-HCL ；步驟三PCR擴增反 應體系為 15μ L 由 1. 5μ L 的 10XPCR buffer、0. 3 μ L 濃度為 10mmol/L 的 dNTP、0. 6U 的 TaqDNA聚合酶、1 μ L魚類基因組DNA模板、1 μ L濃度為0. 1 μ mol/L的上遊引物、1 μ L濃度 為0. 1 μ mol/L的下遊引物和餘量的滅菌雙蒸水組成。本實施方式方法對PCR模板的製備具有快速、高效的優點，尤其是在魚類樣品數 量較大的情況下，即可大大減少財力和工作量，又保證了實驗質量而提高工作效率。本實施方式方法特別適用於目的片段大小為100 500bp的PCR。可以根據PCR擴增引物確定步驟三PCR退火溫度和時間，以及PCR反應參數。
具體實施方式
二 本實施方式與具體實施方式
一的不同點是步驟三中PCR擴增 循環數為25 27。其它步驟及參數與實施方式一相同。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
一或二的不同點是步驟一將魚厚 度小於Imm的軟鰭割下，取小於2. 5mmx2. 5mm的組織塊並將表層粘液刮掉，即得到魚類採集 樣品；或者取剛孵化體高、體厚均小於2mm的未開口魚苗、卵徑為0. 8 1. 2mm未孵化受精 卵或大卵徑受精卵的動物極作為魚類採集樣品。其它步驟及參數與實施方式一或二相同。對於未形成硬鰭的魚可以直接取其軟鰭，對於硬鰭的魚可以直接取較薄較嫩部位 軟鰭，如尾鰭尖端。本實施方式採用軟鰭則在去掉表層粘液後儘量破碎。
具體實施方式
四本實施方式與具體實施方式
一、二或三的不同點是步驟一中 將魚類採集樣品保存於體積濃度為75%的酒精中，DNA提取前先用蒸餾水將酒精洗淨。其 它步驟及參數與實施方式一、二或三相同。
具體實施方式
五本實施方式與具體實施方式
一、二、三或四的不同點是步驟三 中將步驟二得到的魚類基因組DNA模板用滅菌蒸餾水稀釋10 50倍後使用。其它步驟及 參數與實施方式一、二、三或四相同。
具體實施方式
六本實施方式提取魚類基因組DNA的方法按以下步驟實現一、魚 類採集樣品製備；二、魚類基因組DNA提取；三、PCR擴增。其中步驟二是將鹼性反應液加入 裝有魚類採集樣品的試管並沒過樣品，然後置於95°C 士2°C的環境中作用30 90min，再 冰浴，加入與鹼性反應液等體積的中和反應液並震蕩2 3min，然後離心保留離心上清液， 即得到魚類基因組DNA模板；步驟二中鹼性反應液由乙二胺四乙酸二鈉溶液和氫氧化鈉溶 液組成，鹼性反應液中乙二胺四乙酸二鈉的濃度為0. 2mmol/L、氫氧化鈉的濃度為25mmol/ L ；步驟二中中和反應液是濃度為40mmol/L、pH值為8. 0的Tris-HCL ；步驟三PCR擴增反 應體系為 15μ L 由 1. 5μ L 的 10XPCR buffer、0. 3 μ L 濃度為 10mmol/L 的 dNTP、0. 6U 的 TaqDNA聚合酶、1 μ L魚類基因組DNA模板、1 μ L濃度為0. 1 μ mol/L的上遊引物、1 μ L濃度 為0. 1 μ mol/L的下遊引物和餘量的滅菌雙蒸水組成。步驟一將魚厚度小於Imm的軟鰭割下，取小於2. 5mmx2. 5mm的組織塊並將表層粘 液刮掉，即得到魚類採集樣品；或者取剛孵化體高、體厚均小於2mm的未開口魚苗、卵徑為 0. 8 1. 2mm未孵化受精卵或大卵徑受精卵的動物極作為魚類採集樣品。禾Ij用引物 HLJ058、HLJ328、HLJ360、HLJ379、HLJ383、HLJ041、HLJ044、HLJ046、 HLJ693和HLJ809採用本實施方式提取魚類基因組DNA (引物序列及退火溫度如表1所示)。表 權利要求
一種提取魚類基因組DNA的方法，提取魚類基因組DNA的方法按以下步驟實現一、魚類採集樣品製備；二、魚類基因組DNA提取；三、PCR擴增；其特徵在於步驟二是將鹼性反應液加入裝有魚類採集樣品的試管並沒過魚類採集樣品，然後置於95±2℃的環境中作用30～90min，再冰浴，加入與鹼性反應液等體積的中和反應液並震蕩2～3min，然後離心保留離心上清液，即得到魚類基因組DNA模板；步驟二中鹼性反應液由乙二胺四乙酸二鈉溶液和氫氧化鈉溶液組成，鹼性反應液中乙二胺四乙酸二鈉的濃度為0.2mmol/L、氫氧化鈉的濃度為25mmol/L；步驟二中中和反應液是濃度是40mmol/L、pH值為8.0的Tris HCL；步驟三PCR擴增反應體系為15μL由1.5μL的10×PCR buffer、0.3μL濃度為10mmol/L的dNTP、0.6U的TaqDNA聚合酶、1μL魚類基因組DNA模板、1μL濃度為0.1μmol/L的上遊引物、1μL濃度為0.1μmol/L的下遊引物和餘量的滅菌雙蒸水組成。
2.根據權利要求1所述的一種提取魚類基因組DNA的方法，其特徵在於步驟三中PCR 擴增循環數為25 27。
3.根據權利要求1或2所述的一種提取魚類基因組DNA的方法，其特徵在於步驟一將 魚厚度小於Imm的軟鰭割下，取小於2. 5mmx2. 5mm的組織塊並將表層粘液刮掉，即得到魚類 採集樣品；或者取剛孵化體高、體厚均小於2mm的未開口魚苗、卵徑為0. 8 1. 2mm未孵化 受精卵或大卵徑受精卵的動物極作為魚類採集樣品。
4.根據權利要求3所述的一種提取魚類基因組DNA的方法，其特徵在於步驟一中將魚 類採集樣品保存於體積濃度為75%的酒精中，DNA提取前先用蒸餾水將酒精洗淨。
5.根據權利要求4所述的一種提取魚類基因組DNA的方法，其特徵在於步驟三中將步 驟二得到的魚類基因組DNA模板用滅菌蒸餾水稀釋10 50倍後使用。
全文摘要
一種提取魚類基因組DNA的方法，它涉及一種提取基因組DNA的方法。它解決了目前魚類普通PCR反應模板提取工作量大、時間長的問題。本發明方法一、魚類採集樣品製備；二、魚類基因組DNA提取；三、PCR擴增。本發明方法可用於魚類基因組DNA的提取。
文檔編號C12N15/10GK101967473SQ201010509719
公開日2011年2月9日 申請日期2010年10月15日 優先權日2010年10月15日
發明者石連玉, 賈智英 申請人:中國水產科學研究院黑龍江水產研究所