噴鼻免疫流感多價疫苗的製備及其方法

2023-05-29 02:04:01

專利名稱：：噴鼻免疫流感多價疫苗的製備及其方法
技術領域：
：本發明涉及一種疫苗，特別涉及一種噴鼻免疫的流感多價疫苗。
背景技術：
：流感是一種由流感病毒引起的急性發熱性呼吸道傳染病，可引起嚴重的併發症。流感病毒的抗原不斷發生變化，具有較強的傳染性，經常造成大範圍流行。在正常的流行季節，全球約10%的人口即5億多人患流感，目前還未找到十分理想的防治藥物，接種流感疫苗仍是當今預防流感的有效手段。給健康人群接種流感疫苗，70-90%的人會起到預防發病的效果(當傳播的病毒毒株與疫苗採用毒株相同時)，更重要的是，給高危人群接種疫苗可以明顯降低流感的發生，減少住院率及死亡率。當前，高致病性禽流感H5N1在全球迅速蔓延，而最近對1918年爆發流行的流感病毒基因組研究結果表明，那次大流行的病原就是禽流感，而且與現代流行的禽流感病毒H5N1有驚人的相似性。自1997年H5和2003年H7亞型禽流感病毒首次突破種屬屏障，直接感染人，給人類的健康帶來極大的威脅，特別是自2003年底以來，在泰國、越南以及柬埔寨造成138人感染，其中76人死亡(截至到2008年6月19日)。但是到目前為止，人們還不知道禽流感病毒直接感染人的機制以及確切的感染途徑，在臨床上是否存在隱性感染者或亞臨床感染者也不確定。目前科技界普遍認為現在的H5N1毒株，不需要與人流感病毒多價，就有可能進行變異，越過種屬屏障，引起人類的流感大流行，有可能造成500萬-2億人的死亡。WHO已為各國提供了製備滅活疫苗的病毒株，但國內外廣泛使用的還是上世紀70年代基於雞胚生產的流感滅活疫苗，已有的滅活全病毒疫苗不能用於12歲以下兒童的接種、裂解疫苗抗原性弱、組分疫苗效果差，均不適用於流感突發性流感大流行和生物恐怖/生物戰劑造成的短期內流感大流行的預防。因此噴鼻免疫的流感四價(H1N1、H3N2、H5N1、B型)或任意組合的多價(H1N1、H3N2、B、H5N1、H7N7、H9N2等亞型)減毒活疫4苗的製備及其方法的研究迫切又極為重要。自從1940年流感病毒滅活全病毒疫苗、裂解疫苗問世以來，老年人群的病死率及感染的發生率都明顯下降了。目前，已獲準上市的流感病毒滅活疫苗主要包括流感三價滅活全病毒疫苗、三價滅活裂解疫苗和亞單位疫苗，這些疫苗主要經注射途徑免疫，誘導血清中的抗HA/IgG抗體的產生，而不能誘導黏膜免疫slgA抗體的產生，然而對異型流感病毒的交叉保護性反應，主要決定於自然感染過程中誘導的IgA抗體交叉反應性。因此，隨著現代免疫學技術和方法的迅速發展，一種針對刺激機體產生更強的黏膜IgA免疫應答的流感新型疫苗應運而生。近些年，一系列經鼻免疫的流感病毒疫苗得到研製和發展，例如滅活病毒疫苗的免疫，含有羧基乙烯聚合物的滅活疫苗，帶有百日咳毒素B寡聚物的滅活疫苗，含有霍亂弧菌腸毒素、大腸桿菌熱穩定性外毒素及脂質體等佐劑的流感病毒裂解疫苗，這些疫苗不僅誘導機體產生血清HA/IgG抗體，同時也能誘導黏膜分泌性IgA抗體的產生。然而，經鼻免疫的滅活疫苗必須以高濃度劑量免疫，才能激發機體產生高濃度的抗體。經鼻免疫滅活流感病毒疫苗，目前還缺少合適的人用噴鼻疫苗佐劑，不能產生理想的免疫應答反應。此外，現有的免疫程序對老年人和兒童存在有效性和安全性問題亟待解決。而噴鼻流感減毒活疫苗具有類似自然感染的優越性，可以誘導包括體液免疫、細胞免疫和黏膜免疫在內的更全面免疫應答，使機體獲得較廣泛的免疫保護，可以在機體內長時間起作用而誘導較強的交叉免疫反應，同時可以人為任意地對其基因組進行操作。因此，國外一直致力於噴鼻流感減毒活疫苗的研究，並取得了階段性的成果。2003年6月，通過反向遺傳技術產生的冷適應噴鼻流感三價減毒活疫苗FluMistTM在美國被批准和投入使用，採用了冷適應流感病毒株A/AnnArbor/6/60和B/AnnArbor/1/66的內部基因骨架，是一種降低了毒力並能在最佳適應溫度下生長的減毒人流感病毒株。臨床實驗證明該疫苗在成年人和兒童中都有良好的安全性和有效性，可以有效預防流感。俄羅斯利用傳統方法篩選獲得的冷適應流感減毒活疫苗株，由於製備周期長，篩選過程煩瑣，費時費力，且不能人為任意操作其基因組，使得其發展和應用大大受限。目前，反向遺傳技術的迅速發展，為噴鼻流感減毒活疫苗的研發提供了前所未有的機遇，美國的Medlmmime,Inc.公司走在最前沿，該公司作為該項新技術的主要倡導者，50多年來投入了大量的人力物力進行開發研究，並對季節性流感疫苗和大流行流感疫苗進行大規模研究和生產，尤其對噴鼻流感三價減毒活疫苗的研究已經取得了可喜的成果。基於RG技術的噴鼻流感三價減毒活疫苗通過冷適應病毒株獲得的流感病毒骨架保證了疫苗的安全性，從當年流行株獲得的主要保護性抗原保證了疫苗的有效性，通過鼻腔免疫獲得較全面的局部免疫和系統免疫保證了可靠的保護效果、交叉保護和接種簡便。Medlmmune，Inc.於2006年7月宣布，美國FDA已經正式批准該公司利用反向遺傳技術來生產冷適應噴鼻季節性流感疫苗。該疫苗通過鼻腔接種，使用方法簡便，應用範圍廣泛，為噴鼻流感多價減毒活疫苗的研究提供了理論基礎和技術保證。鼻腔富有淋巴樣組織，是疫苗接種的重要靶部位，即鼻相關淋巴樣組織(NALT)，它主要位於喉部的淋巴樣組織環，稱為Waldeyer氏環。研究表明，鼻腔黏膜面積約150cm2，上皮細胞間隙較大並與毛細血管緊密相連，血管和淋巴結豐富，鼻黏膜的單位血流量約40ml/min，比肌肉、腦、肝臟的都大，實際上鼻咽部是良好的免疫器官，有豐富的抗原提呈細胞，能對抗原有效的提呈、加工，產生黏膜免疫和系統免疫應答，並且局部的黏膜免疫，還能引起呼吸道、消化道、泌尿生殖道等部位黏膜免疫應答的相通性，但以呼吸道最強。已有的研究證實，90%以上的病原體感染是通過黏膜途徑感染而致病，特別是通過呼吸道感染致病，給其有效免疫預防提出了新課題。早就知道，鼻腔接種疫苗，富含有淋巴樣組織，是鼻腔接種疫苗的靶部位，富含有敏感的抗原提呈細胞，即鼻相關淋巴組織的淋巴樣組織環為黏膜局部免疫接種提供了良好的微環境，並且蛋白疫苗不被酸鹼破壞。就其流感疫苗至今是通過注射免疫接種，所引起的免疫應答和免疫保護沒有局部的黏膜免疫效果，即不能使流感病毒入侵時獲得有效的抗體中和及細胞免疫的效果。鼻腔給藥是目前研究活躍、應用最多的黏膜給藥途徑，國外已有加壓素的一種類似物和降鈣素鼻腔給藥製品等上市。近年來許多製藥企業開發鼻腔接種疫苗，特別是預防呼吸道感染的疫苗，如近年應用於臨床的冷適應流感減毒活疫苗，通過噴鼻途徑接種，不僅可以產生局部黏膜免疫，還可以產生系統免疫，並且產生具有交叉免疫保護，具有良好的免疫原性和免疫保護效果。因此，開發鼻腔接種的流感多價減毒活疫苗替代注射具有很大的應用前景，這是由於鼻腔免疫具有簡單、有效、非常適於廣大人群的自我使用，同時使得機體能夠抵抗流感病毒感染，並且對流感疫苗免疫應答類型可以轉變，由此達到更加安全的目的，為流感的免疫預防提供了保證。鼻腔給藥是相對較新的給藥方式，它有可能在鎮痛、勃起障礙和疫苗方面提供許多的商業機會。致力於開發新型鼻腔製劑的科學家認為，鼻腔有良好的血液供應，豐富的黏膜面積，避免了藥物進入內臟的通道等。鼻腔給藥至少有起效速度快，比注射更容易被患者接受的優點。目前在美國市場上只有27個鼻腔給藥產品。根據Nastech的統計，這27個產品所具有的市值，超過15億美元，其中2/3(17個)的產品是局部作用產品，1/3(10個)的產品是全身作用產品，全身作用產品都是類固醇藥物製劑。IMS的統計結果顯示，僅鼻腔給藥類固醇產品在美國市場的價值就達到9億美元。2000年3月底在倫敦召開的"鼻腔釋藥系統"會議上，美國專門從事鼻腔給藥研究的Nastech公司的R&D執行副總裁CharanBehl博士介紹了鼻腔給藥的研究情況，認為在過去的幾年裡，鼻腔給藥的研究進展很快，有很好的市場前景和相對較低的風險；鼻腔給藥的市場主要集中在疼痛，偏頭疼，勃起障礙和疫苗方面。
發明內容本發明目的在於提供噴鼻免疫流感多價疫苗及其製備方法。本發明噴鼻免疫流感疫苗包含穩定劑、抗生素和流感多價疫苗抗原。每0.2ml噴鼻免疫流感疫苗中，穩定劑含0.01-0.20%w/v的穀氨酸鹽，1.0-4.0%w/v的明膠，1-4%w/v的精氨酸，5-10%w/v的蔗糖，0.8-3.0%w/v的磷酸鹽；優選0.07%w/v的穀氨酸鹽，3.0%w/v的明膠，3%w/v的精氨酸，7。/。w/v的蔗糖，2.0。/ow/v的磷酸鹽；0.05%w/v的穀氨酸鹽，1.5%w/v的明膠，2。/。w/v的精氨酸，9Ww/v的蔗糖，0.9。/。w/v的磷酸鹽；0.09%w/v的穀氨酸鹽，3.0%w/v的明脫3.8%w/v的精氨酸，6%w/v的蔗糖2.5%w/v的磷酸鹽；抗生素含量〈0.015mcg/mL;多價流感抗原的用量為1X106EID5。-15X106EID5。/0.2ml/人份或0.1X106'5—75TCID5。-10X1065—75TCID5。/0.2ml/人份，多價流感抗原包括四價或多價A型流感抗原和四價或多價B型流感抗原。本發明流感多價疫苗抗原包含了流感四價(H1N1、H3N2、B、H5N1)或在此基礎上任意組合的多價(H1N1、H3N2、B、H5N1、H7N7、H9N2等亞型)疫苗抗原；也可以是包含了H1-H16亞型，Nl-N9亞型的所有組合得到的流感多價疫苗抗原；本發明包含的流感四價及多價疫苗抗原為通過反向遺傳學方法製備的多價流感減毒活疫苗抗原，具體地講，A型多價病毒抗原以冷適應減毒的A/AnnArbor/6/60為病毒骨架，而B型多價病毒抗原以B/AnnArbor/1/66為病毒骨架。本發明噴鼻流感疫苗成品中含有A型流感(H1N1、H3N2、H5N1、H7N7和H9N2等亞型)和B型病毒製備的流感四價或多價減毒活疫苗抗原的用量為1X106EID5。-15X106EID5Q/0.2ml/人份或0.1X1065—75TCID5。—10X1065_75TCID5。/0.2ml/人份。流感多價減毒活疫苗抗原的製備通過現有反向遺傳學方法，A、B型多價病毒分別以冷適應減毒流感病毒株A/AnnArbor/6/60和B/AnnArbor/1/66為拯救病毒骨架，整合當年流行病毒株的表面抗原基因，利用現有流感病毒質粒拯救系統製備的多價疫苗抗原，通過感染雞胚或哺乳動物細胞(如Vero細胞、MDCK細胞、2BS細胞等)進行培養，然後除菌、超濾濃縮、蔗糖密度梯度離心或柱層析分離純化、透析及過濾除菌，濃縮純化後得流感減毒活疫苗抗原。本發明所提供的通過雞胚生產噴鼻流感四價(H1N1、H3N2、H5N1和B型)減毒活疫苗的方法，主要包括以下步驟1)利用現有反向遺傳學方法，分別將H1N1、H3N2、H5N1和B型流感病毒基因片段構建的8、3或4個重組質粒共轉染哺乳動物細胞(如C0S1、C0S7、Vero、MDCK、293T等細胞或C0S/MDCK、293T/MDCK等共培養細胞)產生4種多價疫苗抗原；2)雞胚大量培養病毒，收集病毒通過除菌、超濾濃縮、蔗糖密度梯度離心或柱層析分離純化，透析及過濾除菌；83)濃縮純化後的多種流感病毒抗原等量混合，同時加入穩定劑如蔗糖磷酸穀氨酸鹽緩衝液、抗生素如硫酸慶大黴素製備成噴鼻疫苗。本發明所提供的通過哺乳動物細胞(如Vero細胞、MDCK細胞、2BS細胞等)生產噴鼻流感四價減毒活疫苗的方法，主要包括以下步驟1)利用現有反向遺傳學方法，分別將H1N1、H3N2、H5N1和B型流感病毒基因片段構建的8、3或4個重組質粒共轉染哺乳動物細胞(如C0S1、C0S7、Vero、MDCK、293T等細胞或C0S/MDCK、293T/MDCK等共培養細胞)產生4種多價疫苗抗原；2)使用無血清培養基培養哺乳動物細胞(如Vero細胞、MDCK細胞、2BS細胞等)大量培養病毒，收集病毒通過除菌、超濾濃縮、蔗糖密度梯度離心或柱層析分離純化疫苗抗原，透析及過濾除菌。3)濃縮純化後的多種流感病毒抗原等量混合，同時加入穩定劑如蔗糖磷酸穀氨酸鹽緩衝液、抗生素如硫酸慶大黴素製備成噴鼻疫苗。本發明所提供的通過雞胚生產任意組合的噴鼻流感多價(H1N1、H3N2、B、H5N1、H7N7、H9N2等亞型)減毒活疫苗的方法，包括以下步驟1)利用現有反向遺傳學方法，分別將各型流感病毒的基因片段構建的8、3或4個重組質粒共轉染哺乳動物細胞(如C0S1、C0S7、Vero、MDCK、293T等細胞或C0S/MDCK、293T/MDCK等共培養細胞)產生多種多價疫苗抗原；2)雞胚大量培養病毒，收集病毒通過除菌、超濾濃縮、蔗糖密度梯度離心或柱層析分離純化，透析及過濾除菌；3)濃縮純化後的多種流感病毒抗原等量混合，同時加入穩定劑如蔗糖磷酸穀氨酸鹽緩衝液、抗生素如硫酸慶大黴素製備成噴鼻疫苗。本發明所提供的通過哺乳動物細胞(如Vero細胞、MDCK細胞、2BS細胞等)生產任意組合的噴鼻流感多價(H1N1、H3N2、B、H5N1、H7N7、H9N2等亞型)減毒活疫苗的方法，包括以下步驟l)利用現有反向遺傳學方法，分別將各型流感病毒的基因片段構建的8、3或4個重組質粒共轉染哺乳動物細胞(如C0S1、C0S7、Vero、MDCK、293T等細胞或C0S/MDCK、293T/MDCK等共培養細胞)產生多種多價疫苗抗原。2)使用無血清培養基培養哺乳動物細胞(如Vero細胞、MDCK細胞、2BS細胞等)大量培養病毒，收集病毒通過除菌、超濾濃縮、蔗糖密度梯度離心或柱層析分離純化疫苗抗原，透析及過濾除菌。3)濃縮純化後的多種流感病毒抗原等量混合，同時加入穩定劑如蔗糖磷酸穀氨酸鹽緩衝液、抗生素如硫酸慶大黴素製備成噴鼻疫苗。根據本發明闡述，經鼻免疫屬於黏膜免疫途徑，本發明疫苗可以是經鼻腔途徑的液體、噴霧式的氣溶膠形式、粉末狀、乳脂狀及乳化的病毒顆粒等。本發明中涉及流感多價疫苗抗原包括流感四價(Hl、H3、H5、B),流感五價(Hl、H3、H5、H7、B)也可是(Hl、H3、H5、H9、B)也可是(Hl、H3、H5、H7、H9)等等量組合；流感六價(Hl、H3、H5、H7、H9、B)也可是(Hl、H2、H3、H5、H7、H9)也可是(Hl、H2、H3、H4、H5、H6)等等量組合；流感八價(Hl、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H9)也可是(Hl、H2、H3、H4、H5、H6、H7、B)也可是(Hl、H2、H3、H4、H5、H6、H9、B)等等量組合；流感十價(Hl、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H9、HIO、B)也可以是(Hl、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10)等等量組合；流感十二價(Hl、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、HIO、Hll、H12)也可是(Hl、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、HIO、Hll、B)等等量組合；流感十四價(Hl、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、HIO、Hll、H12、H13、H14)也可是(Hl、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、HIO、Hll、H12、H13、B)等等量組合；流感十六價(Hl、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、HIO、Hll、H12、H13、H14、H15、H16)也可以是(Hl、H2、H3、H4、H5、朋、H7、H8、H9、HIO、Hll、H12、H13、H14、H15、B)等等量組合，也可以是包含了H1-H16亞型，Nl-N9亞型的所有組合得到的流感多價疫苗抗原。本發明流感多價疫苗抗原均採用CN20061007909.5專利申請的方法製備。經鼻腔接種不僅可以產生系統免疫，還可以產生局部黏膜免疫。鼻腔噴霧免疫接種還具有一下特點(1)使用簡便，適宜人人可以自己噴鼻接種，適合於流感大流行或家庭化；(2)抗原用量小，免疫原性與肌肉注射相當，避免了注射的疼痛和交叉感染；(3)—苗多效，既可預防普通流感，又可預防高致病性人禽流感；(4)雙重的效果，既可產生系統免疫，又可產生黏膜免疫；(5)副反應低，既可用於成年，又可適用兒童與老年；(6)製備簡單、成本低廉，工藝流程簡單，成本可降低10倍以上。因此，開發鼻腔接種流感疫苗代替傳統的注射接種具有很大的應用前景，因為鼻腔噴霧接種流感疫苗具有簡單、有效、安全，非常適於所有人群的自我使用。本發明使用流感四價(H1N1、H3N2、H5N1、B型)或多價減毒活疫苗經鼻腔噴鼻進行免疫接種，可安全、有效地預防人普通流感和高致病性人禽流感病毒的感染。本發明的優點在於，經鼻途徑免疫的流感四價(H1N1、H3N2、H5N1、B型)或多價減毒活疫苗，在哺乳動物中可同時誘導有效的黏膜免疫和系統免疫，並使機體產生高效價sIgA和IgG、IgA，其效果較目前所應用的疫苗組分——無論是單純的滅活病毒顆粒、加佐劑的滅活病毒及活病毒都理想。本發明使用無血清培養基培養哺乳動物細胞(如Vero細胞、MDCK細胞、2BS細胞等)製備抗原的優勢是，可以避免雞胚特異性蛋白所引起的過敏反應。因此本疫苗尤其適用於如患有哮喘、過敏、免疫缺陷及老年人等高危人群，可有效地預防流感病毒感染。本發明的流感四價或多價減毒活疫苗經不同實驗動物(小鼠、雪貂和人體)滴鼻途徑免疫，結果證明，按第0、28天兩次滴鼻免疫程序，可產生高效價的IgA和IgG抗體，即可同時誘導黏膜免疫和系統免疫。可以很好的保護小鼠免受流感病毒的攻擊，且產生了一定的交叉保護性。流感四價減毒活疫苗的小鼠實驗結果顯示有AL(0H)3佐劑的情況下，噴鼻流感四價滅活疫苗不能激發機體較高水平的IgA和IgG免疫應答，相反，噴鼻流感四價減毒活疫苗在無佐劑情況下，則可激發機體產生更高效價的IgA、IgG、和HAI。流感四價減毒活疫苗的雪貂實驗結果顯示無論是雞胚培養得到的，還是Vero細胞培養得到的病毒抗原，經噴鼻途徑免疫雪貂後，較流感滅活疫苗加AL(0H)3佐劑組可產生較高的HI效價。說明流感多價減毒活疫苗噴鼻免疫途徑為可供選擇的理想途徑之一。流感四價減毒活疫苗的人體實驗結果顯示在健康人群志願者中，一劑量接種28天後，噴鼻免疫流感多價減毒活疫苗和滅活疫苗產生相似的血清陽性，血清轉化率ii和血清保護率。但是噴鼻免疫流感多價減毒活疫苗比滅活疫苗產生更高水平的IgA抗體。具體實施例方式實施例l:流感四價(H1N1、H3N2、H5N1和B型)減毒活疫苗株的製備A型流感病毒株H1、H3、H5和B型流感病毒株由中國CDC和華蘭生物技術股份有限公司提供。採用傳統的雞胚尿囊腔培養流感病毒方法或微載體懸浮培養和馴服哺乳動物細胞(如Vero細胞、MDCK細胞、2BS細胞等)培養流感病毒。①利用現有反向遺傳學方法，A型多價病毒以冷適應減毒流感病毒株A/AnnArbor/6/60為病毒骨架，B型多價病毒以B/AnnArbor/1/66為拯救病毒骨架，分別整合當年流行A、B型流感病毒株的HA、NA表面抗原基因，即將H1N1、H3N2、H5N1和B型流感病毒基因片段構建的8、3或4個重組質粒共轉染哺乳動物細胞(如C0Sl、C0S7、Vero、MDCK、293T等細胞或C0S/MDCK、293T/MDCK等共培養細胞)產生4種多價病毒。②雞胚大量培養4種多價病毒，收集病毒通過除菌、超濾濃縮、12-60%蔗糖密度梯度離心或柱層析分離純化，透析及過濾除菌。③由哺乳動物細胞(如Vero細胞、MDCK細胞、2BS細胞等)生產4種多價病毒用無血清培養基，採用的方法有微載體懸浮培養和馴服哺乳動物細胞(如Vero細胞、MDCK細胞、2BS細胞等)培養流感病毒。收集病毒通過除菌、超濾濃縮、蔗糖密度梯度離心或柱層析分離純化，透析及過濾除菌。④濃縮純化後的4種流感病毒抗原等量混合，病毒抗原用穩定液稀釋，最終使得每一劑0.2ml，包含0.188mg穀氨酸一鈉(monosodiumglutamate)，2.OOmg水解豬明膠(hydrolyzedporcinegelatin)，2.42mg精氨酸(arginine)，13.68mg蔗糖(sucrose)，2.26mg磷酸氫二鉀(dibasicpotassiumphosphate)，0.96mg磷酸二氫鈉(monosodiumphosphate)，以及抗生素如硫酸慶大黴素含量要求〈0.015mcg/mL。從而製備流感四價疫苗用於噴鼻免疫，該疫苗在2-8'C下是穩定的，便於運輸和長期保存。12實施例2:流感多價(H1N1、H3N2、B、H5N1、H7N7、H9N2亞型)減毒活疫苗抗原的製備A型流感病毒株H1N1、H3N2、H5N1、H7N7、H9N2亞型和B型流感病毒株由中國CDC和華蘭生物技術股份有限公司提供。採用傳統的雞胚尿囊腔培養流感病毒方法或微載體懸浮培養和馴服哺乳動物細胞(如Vero細胞、MDCK細胞、2BS細胞等)培養流感病毒。①利用現有反向遺傳學方法，A型多價疫苗抗原以冷適應減毒流感病毒株A/AnnArbor/6/60為病毒骨架，B型多價疫苗抗原以B/AnnArbor/1/66為拯救病毒骨架，分別整合當年流行A、B型流感病毒株的HA、NA表面抗原基因，即將任意組合的各型流感病毒基因片段構建的8、3或4個重組質粒共轉染哺乳動物細胞(如C0S1、C0S7、Vero、MDCK、293T等細胞或C0S/MDCK、293T/MDCK等共培養細胞)產生多種多價疫苗抗原。②雞胚大量培養多種多價病毒，收集病毒通過除菌、超濾濃縮、12-60%蔗糖密度梯度離心或柱層析分離純化疫苗抗原，透析及過濾除菌。③由哺乳動物細胞(如Vero細胞、MDCK細胞、2BS細胞等)生產多種多價病毒用無血清培養基，採用的方法有微載體懸浮培養和馴服哺乳動物細胞(如Vero細胞、MDCK細胞、2BS細胞等等)培養流感病毒。收集病毒通過除菌、超濾濃縮、蔗糖密度梯度離心或柱層析分離純化疫苗抗原，透析及過濾除菌。④濃縮純化後的多種流感疫苗抗原等量混合，疫苗抗原用穩定液稀釋，最終使得每一劑0.2ml，包含0.188mg穀氨酸一鈉(monosodiumglut扁te)，2.OOmg水解豬明膠(hydrolyzedporcinegelatin)，2.42mg精氨酸(arginine)，13.68mg蔗糖(sucrose)，2.26mg磷酸氫二鉀(dibasicpotassiumphosphate)，0.96mg磷酸二氫鈉(monosodiumphosphate)，以及抗生素如硫酸慶大黴素含量要求〈0.015mcg/mL。從而製備流感多價疫苗用於噴鼻免疫，該疫苗在2-8"C下是穩定的，便於運輸和長期保存。實施例3:流感四價減毒活疫苗的小鼠體內效果觀察1、免疫策略，使用不同劑型的流感病毒疫苗免疫小鼠①按照例1所製備流感四價(H1N1、H3N2、H5N1和B型)減毒活病毒株的方法，同時將抗原用穩定劑稀釋到減毒活疫苗的量^5X106EID5。，其中以噴鼻滅活流感疫苗+AL(OH)3佐劑組為對照(Tabl)。②6組Balb/c小鼠分別接受不同劑型的疫苗經鼻免疫，每隻小鼠20ii1的抗原溶液，其中滅活流感疫苗含有AL(OH)3佐劑。分別於第O、28天進行免疫，並於第42天測定血清，鼻衝洗液及肺灌洗液中的IgG、IgA及HAI效價。表l疫苗噴鼻免疫Balb/c小鼠組別設計tableseeoriginaldocumentpage142、血清，鼻衝洗液及肺灌洗液中的IgG、IgA及HAI效價的測定①免疫後42天，取動物的鼻衝洗液、肺臟及血清標本，測定每份標本的抗體效價②分離小鼠的NALT，用0.5mlPBS衝洗，收集鼻衝洗液測定其IgA含量③肺組織裂解標本的製備處死小鼠，打開喉部，取出肺臟並用PBS清洗，研磨肺組織並離心勻漿去處細胞組織，收集上清液並儲存於-20°C，用於IgA效價測定。IgG和IgA效價測定使用商品化甲型或乙型流感病毒ELISA檢測試劑盒(GenzymeVirotech)。37。C孵育2h後加入羊抗鼠IgG或IgA抗體(Pharmigen)及底物液和顯色液檢測特異性IgG和IgA抗體效價。⑤HAI效價測定取小鼠血液，按照Palmeretal指定方法測定甲型和乙型流感病毒HAI效價。⑥數據顯示在有AL(0H)3佐劑的情況下，噴鼻流感四價滅活疫苗不能激發機體較高水平的IgA和IgG免疫應答，相反，噴鼻流感四價減毒活疫苗在無佐劑情況下，則可激發機體產生更高效價的IgA、IgG、和HAI(Tab2)。表2不同種類流感疫苗株噴鼻免疫小鼠後鼻衝洗液、肺灌洗液中IgA效價以及血清IgG和HAI效價的測定結果種類疫苗滅活苗(來源於細胞)滅活苗(來源於雞胚)減毒活疫苗(來源於細胞)減毒活疫苗(來源於雞胚)毒株NC,WSX丄MLNC，WSXJ,MLX丄ML效價IgAIgG佐劑鼻衝洗液肺灌洗液血清血清FluAFluBFluAFluBFluAFluBFluAFluBHAINCWSXJMLH1NH3N2H5N1B1AL(OH)3<10<10<10<10<10<1080010080808020NC,WSX丄MLAL(0H)3101010<10<10<1016001001601608040804064080800320204,80051,2008008001280640雞胚對照8020320160640320102,40025，600640320640160<10<10n.dn.d<10<10<10<108016080<10<10<10n.dn.d<10<10<10<108016080<10NC表示NewCaledonia/20/99,WS表示Wisconsin/67/2005,XJ表示XiJiang/424/2004,ML表示Malaysia/2506/2004，PL表示肺灌洗液，n.d表示沒有測定實施例4:流感四價減毒活疫苗的雪貂體內效果觀察1、免疫策略，使用不同劑型的流感病毒疫苗免疫雪貂①按照例1所製備流感四價(H1N1、H3N2、H5N1和B型)減毒活疫苗的方法，製備適用於雪貂噴鼻免疫的劑型。②9-10周齡的雄性雪貂，選取體重為l-2kg的用於本實驗，所有這些動物在實驗之前均為血清陰性。免疫之前，雪貂用0.5ml體積比為9:3"的氯胺酮/甲苯噻嗪/阿託品混合物麻醉，通過頸靜脈取血測定HI效價。③6組雪貂，分別接受不同劑型的流感四價減毒活疫苗噴鼻免疫，每隻0.2ml抗原溶液，每隻鼻孔10(HU，按照表3的組別分別進行免疫，並於第28天測定HI效價。④血清HI效價測定雪貂頸靜脈取血，按照OIE標準指定的方法進行HI測定。⑤實驗結果顯示，流感四價減毒活疫苗，無論是雞胚培養得到的，還是Vero細胞培養得到的病毒抗原，經噴鼻途徑免疫雪貂後，較流感滅活疫苗加AL(OH)3佐劑組可產生較高的HI效價。說明流感多價減毒活疫苗噴鼻免疫途徑為可供選擇的理想途徑之一(表3)。表3實驗一疫苗免疫雪貂後HI效價測定結果組別疫苗免疫劑量疫苗來源雪貂個數免疫前血清HI效價GMTC免疫後28天HI效價GMTA滅活苗5X106EID50細胞1A<10<108050+AL(OH)32A<101603A<1080B滅活苗5X106EIDW雞胚IB<10<10160202+AL(OH)32B<103203B<10160C減毒活疫苗5X106EID5。細胞1C〈10<103204032C<106403C<10320D減毒活疫苗5X10BEID50雞胚ID<10<103206402D<10640犯<101280E雞胚尿囊液IE<10<10<10<102E<10<103E<10<10FMDCK細胞介質IF<10<10<10<102F<10<103F<10<10對照陽性雪貂抗血2560清c:Geometrimeantiter幾何平均效價162、流感四價減毒活疫苗在雪貂上的複製情況流感四價減毒活疫苗的減毒表型通過免疫雪貂得以驗證，選取9-10周齡的雄性雪貂，評價多價疫苗株在動物呼吸道的複製情況。每隻動物鼻腔接種8.51og,。pfu的流感多價疫苗抗原，感染後3天，雪貂用氯胺酮-HCL溶液作為鎮靜劑，收穫肺和鼻甲，肺組織勻漿通過系列稀釋接種10日齡雞胚，利用Karber方法測定病毒滴度logl。EID50。空斑測定NT中病毒的複製情況，用1og④fu/g表示，實驗結果見表4。表4:實驗二流感多價疫苗在雪貂上的複製情況tableseeoriginaldocumentpage17(5)僅對IgA:從0-28天受試者IgA抗體滴度增加2-4倍的百分率。5、經過對局部和全身症狀的8天隨訪期，兩種疫苗對安全性和反應性均耐受。關於接種無嚴重有害作用顯示。6、疫苗免疫原性的檢測通過血凝抑制滴度來決定血清轉化率(疫苗的百分率是根據28天HI滴度是0天至少增加4倍而限定的，每一疫苗株)，轉化係數(是根據28天比0天HI幾何平均滴度(GMTs)的倍增值而限定的，每一疫苗株)，血清保護率(接種後公認顯示保護HI滴度》40而限定的，每一疫苗株)，另外黏膜IgA抗體反應用ELISA來檢測。7、接種一劑量噴鼻流感滅活疫苗或四價減毒活疫苗28天後HI血清陽性，血清轉化率和血清保護率見表5。接種一劑量28天時HI的血清陽性、血清保護率和血清轉化率組別時間編號n血清陽性%血清保護率n%血清轉化率n%NCo天20420.00028天201785.01575.01575.0滅活苗o天19421.1315.828天1919100.01819.419100.0WSo天201365.0315.028天2020100.01995.01575.0滅活苗o天191473.715.328天1919鳳01894.71684.2o天20420.00028天201785.01575.01575.0滅活苗o天191050,0735.028天1920100,01890.01470.0ML0天20420.00028天201785.01575.01575.0滅活苗o天191789.51157.928天1919100.019100.01578.9血清陽性(n，％):編號和受試者的滴度》10血清保護率(n，％):編號和受試者的滴度^40血清轉化率(n，％):編號和受試者從0天到28天的滴度至少是4倍的增殖8、所有實驗中，血清轉化係數(接種後血清HIGMTs增加)要高於2.5,這一水平是所有成功流感疫苗必須的。9、在0天，28天中(一劑i倍的受試者百分率見下表6。t)，亞型/總IgA抗體比率增加2倍或40天，28天亞型/總IgA抗體比率增加2倍或4倍的受試者百分率組別N增加2倍(％)增加4倍《)NC2056.031.7滅活苗1952.325,8ws2068.047.0滅活苗1948.25.3x:r2048.045.0滅活苗1932.010.9ML2040.038.6滅活苗1928.95.910、結果表明一劑量接種28天後，噴鼻免疫流感多價減毒活疫苗和滅活疫苗產生相似的血清陽性，血清轉化率和血清保護率。但是噴鼻免疫流感多價減毒活疫苗比滅活疫苗產生更高水平的IgA抗體。實施例6:噴鼻免疫流感疫苗每0.2ml噴鼻免疫流感疫苗，0.07%w/v的穀氨酸鹽，3.0%w/v的明膠，3%w/v的精氨酸，7%w/v的蔗糖，2.0%w/v的磷酸鹽；流感多價疫苗抗原包含了流感四價(H1N1、H3N2、B、H5N1)或在此基礎上任意組合的多價(H1N1、H3N2、B、H5N1、H7N7、H9N2等亞型)疫苗抗原；流感四價及多價疫苗病毒為通過反向遺傳學方法製備的多價流感減毒活疫苗抗原。具體地講，A型多價病毒以冷適應減毒的A/ArmArbor/6/60為病毒骨架，而B型多價病毒以B/AnnArbor/1/66為病毒骨架。噴鼻流感疫苗成品中含有A型流感(H1N1、H3N2、H5N1、H7N7和H9N2等亞型)和B型病毒製備的流感四價或多價減毒活疫苗抗原的用量為lX106EID5。-15X106EID5Q/0.2ml/人份或0.ixi06.5-7.5TCID5。_10x10"-"TCID5。/0.2ml/人份。流感多價減毒活疫苗抗原的製備通過現有反向遺傳學方法，A、B型多價病毒分別以冷適應減毒流感病毒株A/AnnArbor/6/60和B/AnnArbor/1/66為拯救病毒骨架，整合當年流行病毒株的表面抗原基因，利用現19有流感病毒質粒拯救系統製備的多價疫苗抗原，通過感染雞胚或哺乳動物細胞(如Ve:m細胞、MDCK細胞、2BS細胞等)進行培養，然後除菌、超濾濃縮、蔗糖密度梯度離心或柱層析分離純化、透析及過濾除菌，濃縮純化後得流感減毒活疫苗抗原。實施例7:每0.2ml噴鼻免疫流感疫苗，0.05%w/v的穀氨酸鹽，1.5%w/v的明膠，2%w/v的精氨酸，9%w/v的蔗糖，0.9%w/v的磷酸鹽；流感多價疫苗抗原包含了流感四價(H1N1、H3N2、B、H5N1)或在此基礎上任意組合的多價(H1N1、H3N2、B、H5N1、H7N7、H9N2等亞型)疫苗抗原；流感四價及多價疫苗病毒為通過反向遺傳學方法製備的多價流感減毒活疫苗抗原。具體地講，A型多價病毒以冷適應減毒的A/AnnArbor/6/60為病毒骨架，而B型多價病毒以B/ArmArbor/1/66為病毒骨架。噴鼻流感疫苗成品中含有A型流感(H1N1、H3N2、H5N1、H7N7和H9N2等亞型)和B型病毒製備的流感四價或多價減毒活疫苗抗原的用量為1X106EID5。-15X106EID5。/0.2ml/人份或0.1X1065—75TCID5。—10X1065—75TCID5。/0.2ml/人份。流感多價減毒活疫苗抗原的製備通過現有反向遺傳學方法，A、B型多價病毒分別以冷適應減毒流感病毒株A/AnnArbor/6/60和B/AnnArbor/1/66為拯救病毒骨架，整合當年流行病毒株的表面抗原基因，利用現有流感病毒質粒拯救系統製備的多價疫苗抗原，通過感染雞胚或哺乳動物細胞(如Vero細胞、MDCK細胞、2BS細胞等)進行培養，然後除菌、超濾濃縮、蔗糖密度梯度離心或柱層析分離純化、透析及過濾除菌，濃縮純化後得流感減毒活疫苗抗原。實施例8:每0.2ml噴鼻免疫流感疫苗，0.09%w/v的穀氨酸鹽，3.0%w/v的明膠，3.8%w/v的精氨酸，6%w/v的蔗糖2.5%w/v的磷酸鹽。抗生素如硫酸慶大黴素含量〈0.015mcg/mL。流感多價疫苗抗原包含了流感四價(H1N1、H3N2、B、H5N1)或在此基礎上任意組合的多價(H1N1、H3N2、B、H5N1、H7N7、H9N2等亞型)疫苗抗原；流感四價及多價疫苗病毒為通過反向遺傳學方法製備的多價流感減毒活疫苗抗原。具體地講，A型多價病毒以冷適應減毒的A/ArmArbor/6/60為病毒骨架，而B型多價病毒以B/AnnArbor/1/66為病毒骨架。噴鼻流感疫苗成品中含有A型流感(H1N1、H3N2、H5N1、H7N7和H9N2等亞型)和B型病毒製備的流感四價或多價減毒活疫苗抗原的用量為lX106EID5。_15X106EID5。/0.2ml/人份或0.1X1065—75TCID5。—10X1065—75TCID5o/0.2ml/人份。流感多價減毒活疫苗抗原的製備通過現有反向遺傳學方法，A、B型多價病毒分別以冷適應減毒流感病毒株A/AnnArbor/6/60和B/AnnArbor/1/66為拯救病毒骨架，整合當年流行病毒株的表面抗原基因，利用現有流感病毒質粒拯救系統製備的多價疫苗抗原，通過感染雞胚或哺乳動物細胞(如Vero細胞、MDCK細胞、2BS細胞等)進行培養，然後除菌、超濾濃縮、蔗糖密度梯度離心或柱層析分離純化、透析及過濾除菌,濃縮純化後得流感減毒活疫苗抗原。實施例9:每0.2ml噴鼻免疫流感疫苗，0.05%w/v的穀氨酸鹽，1.5%w/v的明膠，2%w/v的精氨酸，9%w/v的蔗糖，0.9%w/v的磷酸鹽；抗生素如硫酸慶大黴素含量<0.015mcg/mL。流感多價疫苗抗原包含了流感四價(H1N1、H3N2、B、H5N1)或在此基礎上任意組合的多價(H1N1、H3N2、B、H5N1、H7N7、H9N2等亞型)疫苗抗原；流感四價及多價疫苗病毒為通過反向遺傳學方法製備的多價流感減毒活疫苗抗原。具體地講，A型多價病毒以冷適應減毒的A/AnnArbor/6/60為病毒骨架，而B型多價病毒以B/AnnArbor/1/66為病毒骨架。噴鼻流感疫苗成品中含有A型流感(H1N1、H3N2、H5N1、H7N7和H9N2等亞型)和B型病毒製備的流感四價或多價減毒活疫苗抗原的用量為lX106EID5。-15X106EID5。/0.2ml/人份或0.1X1065—75TCID5。-10X1065-75TCID50/0.2ml/人份。21流感多價減毒活疫苗抗原的製備通過現有反向遺傳學方法，A、B型多價病毒分別以冷適應減毒流感病毒株A/AnnArbor/6/60和B/AnnArbor/1/66為拯救病毒骨架，整合當年流行病毒株的表面抗原基因，利用現有流感病毒質粒拯救系統製備的多價疫苗抗原，通過感染雞胚或哺乳動物細胞(如Vero細胞、MDCK細胞、2BS細胞等)進行培養，然後除菌、超濾濃縮、蔗糖密度梯度離心或柱層析分離純化、透析及過濾除菌，濃縮純化後得流感減毒活疫苗抗原。實施例10:每0.2ml噴鼻免疫流感疫苗，0.09%w/v的穀氨酸鹽，3.0%w/v的明膠，3.8%w/v的精氨酸，6%w/v的蔗糖2.5%w/v的磷酸鹽。抗生素如硫酸慶大黴素含量〈0.015mcg/mL。流感多價疫苗抗原包含了流感四價(H1N1、H3N2、B、H5N1)或在此基礎上任意組合的多價(H1N1、H3N2、B、H5N1、H7N7、H9N2等亞型)疫苗抗原；流感四價及多價疫苗病毒為通過反向遺傳學方法製備的多價流感減毒活疫苗抗原。具體地講，A型多價病毒以冷適應減毒的A/ArmArbor/6/60為病毒骨架，而B型多價病毒以B/AnnArbor/1/66為病毒骨架。噴鼻流感疫苗成品中含有A型流感(H1N1、H3N2、H5N1、H7N7和H9N2等亞型)和B型病毒製備的流感四價或多價減毒活疫苗抗原的用量為1X106EID5。-15X106EID5。/0.2ml/人份或0.1X1065-75TCID5o-10X1065—75TCID5。/0.2ml/人份。流感多價減毒活疫苗抗原的製備通過現有反向遺傳學方法，A、B型多價病毒分別以冷適應減毒流感病毒株A/AnnArbor/6/60和B/AnnArbor/1/66為拯救病毒骨架，整合當年流行病毒株的表面抗原基因，利用現有流感病毒質粒拯救系統製備的多價疫苗抗原，通過感染雞胚或哺乳動物細胞(如Vero細胞、MDCK細胞、2BS細胞等)進行培養，然後除菌、超濾濃縮、蔗糖密度梯度離心或柱層析分離純化、透析及過濾除菌,濃縮純化後得流感減毒活疫苗抗原。實施例11:每0.2ml噴鼻免疫流感疫苗，0.05%w/v的穀氨酸鹽，1.5%w/v的明膠，222%w/v的精氨酸，9%w/v的蔗糖，0.9%w/v的磷酸鹽；流感多價疫苗抗原包含了流感四價(H1N1、H3N2、B、H5N1)或在此基礎上任意組合的多價(H1N1、H3N2、B、H5N1、H7N7、H9N2等亞型)疫苗抗原；流感四價及多價疫苗病毒為通過反向遺傳學方法製備的多價流感減毒活疫苗抗原。具體地講，A型多價病毒以冷適應減毒的A/ArmArbor/6/60為病毒骨架，而B型多價病毒以B/ArmArbor/1/66為病毒骨架。噴鼻流感疫苗成品中含有A型流感(H1N1、H3N2、H5N1、H7N7和H9N2等亞型)和B型病毒製備的流感四價或多價減毒活疫苗抗原的用量為1X106EID5。-15X106EID5。/0.2ml/人份或0.1X1065—75TCID5。—10X1065_75TCID5。/0.2ml/人份。流感多價減毒活疫苗抗原的製備通過現有反向遺傳學方法，A、B型多價病毒分別以冷適應減毒流感病毒株A/AnnArbor/6/60和B/AnnArbor/1/66為拯救病毒骨架，整合當年流行病毒株的表面抗原基因，利用現有流感病毒質粒拯救系統製備的多價疫苗抗原，通過感染雞胚或哺乳動物細胞(如Vero細胞、MDCK細胞、2BS細胞等)進行培養，然後除菌、超濾濃縮、蔗糖密度梯度離心或柱層析分離純化、透析及過濾除菌，濃縮純化後得流感減毒活疫苗抗原。實施例12:每0.2ml噴鼻免疫流感疫苗，0.09%w/v的穀氨酸鹽，3.0%w/v的明膠，3.8%w/v的精氨酸，6%w/v的蔗糖2.5%w/v的磷酸鹽。抗生素如硫酸慶大黴素含量〈0.015mcg/mL。流感多價疫苗抗原包含了流感四價(H1N1、H3N2、B、H5N1)或在此基礎上任意組合的多價(H1N1、H3N2、B、H5N1、H7N7、H9N2等亞型)疫苗抗原；流感四價及多價疫苗病毒為通過反向遺傳學方法製備的多價流感減毒活疫苗抗原。具體地講，A型多價病毒以冷適應減毒的A/ArmArbor/6/60為病毒骨架，而B型多價病毒以B/ArmArbor/1/66為病毒骨架。噴鼻流感疫苗成品中含有A型流感(H1N1、H3N2、H5N1、H7N7和H9N2等亞型)和B型病毒製備的流感四價或多價減毒活疫苗抗原的用量為1X106EID5。-15X106EID5。/0.2ml/人份或0.1X1065-75TCID5。—10X1065—75TCID5。/0.2ml/人份。流感多價減毒活疫苗抗原的製備通過現有反向遺傳學方法，A、B型多價病毒分別以冷適應減毒流感病毒株A/AnnArbor/6/60和B/AnnArbor/1/66為拯救病毒骨架，整合當年流行病毒株的表面抗原基因，利用現有流感病毒質粒拯救系統製備的多價疫苗抗原，通過感染雞胚或哺乳動物細胞(如Vero細胞、MDCK細胞、2BS細胞等)進行培養，然後除菌、超濾濃縮、蔗糖密度梯度離心或柱層析分離純化、透析及過濾除菌，濃縮純化後得流感減毒活疫苗抗原。權利要求1、一種噴鼻免疫流感多價疫苗，其特徵在於該噴鼻免疫流感疫苗包含穩定劑、抗生素和流感多價疫苗抗原；每0.2ml噴鼻免疫流感疫苗中，穩定劑含0.01-0.20％w/v的穀氨酸鹽，1.0-4.0％w/v的明膠，1-4％w/v的精氨酸，5-10％w/v的蔗糖，0.8-3.0％w/v的磷酸鹽；抗生素含量<0.015μg/mL；多價流感抗原的用量為1×106EID50-15×106EID50/0.2ml/人份或0.1×106.5-7.5TCID50-10×106.5-7.5TCID50/0.2ml/人份，多價流感抗原包括A、B型重組流感病毒組合形成的四價或多價病毒抗原；流感多價疫苗抗原包含了流感四價(H1N1、H3N2、B、H5N1)或在此基礎上任意組合的多價(H1N1、H3N2、B、H5N1、H7N7、H9N2等亞型)疫苗抗原；也包含了H1-H16亞型，N1-N9亞型的所有組合得到的流感多價疫苗抗原。2、如權利要求1所述的噴鼻免疫流感疫苗，其特徵在於所述穩定劑為0.07%w/v的穀氨酸鹽，3.0%w/v的明膠，3%w/v的精氨酸，7%w/v的蔗糖，2.0。/ow/v的磷酸鹽。3、如權利要求1所述的噴鼻免疫流感疫苗，其特徵在於所述穩定劑為0.05%w/v的穀氨酸鹽，1.5%w/v的明膠，2%w/v的精氨酸，9%w/v的蔗糖，0.9。/。w/v的磷酸鹽。4、如權利要求1所述的噴鼻免疫流感疫苗，其特徵在於所述穩定劑為0.09%w/v的穀氨酸鹽，3.0%w/v的明膠，3.8%w/v的精氨酸，6%w/v的蔗糖2.5呢w/v的磷酸鹽。5、如權利要求l-4任一所述的噴鼻免疫流感疫苗，其特徵在於所述流感四價及多價疫苗抗原為通過反向遺傳學技術製備的重組流感減毒活疫苗，A型重組病毒以冷適應、減毒的A/AnnArbor/6/60為病毒骨架，而B型重組病毒以B/AnnArbor/1/66為病毒骨架。6、如權利要求l-4任一所述的噴鼻免疫流感疫苗，其特徵在於所述疫苗是經鼻腔途徑的液體、噴霧式的氣溶膠形式、粉末狀、乳脂狀及乳化的病毒顆粒。7、如權利要求1-4任一所述的噴鼻免疫流感疫苗的製備方法，其特徵在於該方法為包括以下步驟1)利用現有反向遺傳學方法，分別將H1N1、H3N2、H5N1和B型流感病毒基因片段構建的8、3或4個重組質粒共轉染哺乳動物細胞產生4種多價疫苗抗原；2)雞胚大量培養病毒，收集病毒通過除菌、超濾濃縮、蔗糖密度梯度離心或柱層析分離純化，透析及過濾除菌；3)濃縮純化後的多種流感病毒抗原等量混合，同時加入穩定劑如蔗糖磷酸穀氨酸鹽緩衝液、抗生素如硫酸慶大黴素製備成噴鼻疫苗。8、如權利要求1-4任一所述的噴鼻免疫流感疫苗的製備方法，其特徵在於該方法為包括以下步驟1)利用現有反向遺傳學方法，分別將H1N1、H3N2、H5N1和B型流感病毒基因片段構建的8、3或4個重組質粒共轉染哺乳動物細胞產生4種多價疫苗抗原；2)使用無血清培養基培養哺乳動物細胞大量培養病毒，收集病毒通過除菌、超濾濃縮、蔗糖密度梯度離心或柱層析分離純化疫苗抗原，透析及過濾除菌；3)濃縮純化後的多種流感病毒抗原等量混合，同時加入穩定劑、抗生素製備噴鼻疫苗。全文摘要本發明公開一種噴鼻免疫流感多價疫苗及其製備方法，本發明使用流感四價(H1N1、H3N2、H5N1、B型)或多價減毒活疫苗經鼻腔噴鼻進行免疫接種，可安全、有效地預防人普通流感和高致病性人禽流感病毒的感染。文檔編號A61K39/295GK101450208SQ20081024702公開日2009年6月10日申請日期2008年12月31日優先權日2008年12月31日發明者楊鵬輝,段躍強,王希良,王金成,羅德炎,麗邢申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所