改進的從磁性玻璃顆粒中的核酸回收的製作方法
2023-05-29 12:10:11
專利名稱:改進的從磁性玻璃顆粒中的核酸回收的製作方法
改進的從磁性玻璃顆粒中的核酸回收
發明領域
本發明涉及分離核酸的領域，和具體地使用固體支持物分離核酸的領域。
技術背景
分離核酸是分子診斷學中的重要步驟。從樣品中分離的核酸的質量和數量大大影響了下遊診斷應用的成功。臨床和野外應用也要求分離程序迅速且能夠自動化。
存在很多程序用於從多種生物和組織中分離核酸。一些類型的臨床和環境樣品對核酸的成功分離提出了特別的挑戰。例如，某些組織例如骨含有在可以評估核酸以前需要去除的大量細胞外材料。一些生物，例如真菌、植物和細菌具有需要劇烈化學處理的細胞壁或外膜。在劇烈處理中使用的試劑對利用分離的核酸的下遊應用造成挑戰。此外，在劇烈處理期間的靶核酸的降解可導致下遊檢測測定中的假陰性結果。但是為了臨床上可接受的，診斷程序必須具有足夠的靈敏度，即避免在患者樣品中的假陰性結果。因此在分子診斷學領域中，需要改進分離核酸的方法，從而使診斷程序靈敏、可信和易於操作。
成功的基於核酸的診斷試驗的先決條件是分離沒有降解的、無抑制劑的核酸。同時，需要簡單、易於自動化的核酸分離程序。最近開始流行使用固體支持物，例如球形微粒分離核酸。特別流行的是含有或覆蓋玻璃樣物質的磁性微粒，通常被稱為「磁性玻璃顆粒」或「MGP」。使用MGP的核酸分離程序需要相對少的步驟和易於自動化。特別流行的是通過在歐洲公開EP I 154 443或美國專利6，255，477和6，870，047中描述的溶膠-凝膠法(sol-gel)製備的 MGP。
通過溶膠-凝膠法製備的MGP的一般描述和具體實例可在文獻中容易地獲得(見例如EP I 154 443)。這些MGP由覆蓋基於二氧化矽的玻璃樣材料的鐵磁核心組成。鐵磁核心一般包含鐵氧化物，例如Fe3O4或Fe203。核心可為簡單的鐵核心，或可由複合材料組成。核心也可由結晶的、陶瓷或玻璃樣結構組成，其中包埋氧化鐵。玻璃塗層可由含氧化矽的無定形材料組成，並可還包含一種或多種另外的金屬氧化物例如氧化硼(B2O3)，氧化招(Al2O3),氧化韓(CaO),氧化鋇(BaO),氧化鉀(K2O),氧化鈉(Na2O),氧化酶(MgO)或氧化鉛(Pb2O3)。在一些實施方案中，玻璃是矽氧化物並也包含在以下濃度範圍中的一種或多種化合物=B2O3 (0-30%)，Al2O3 (0-20%)，CaO (0-20%)，BaO (0-10%)，K2O (0-20%)，Na2O(0-20%)，MgO (0-18%) ,Pb2O3 (0-15%)。玻璃可也包含小百分比(0_5%)的若干其他氧化物例如Mn2O3, TiO2, As2O3, Fe2O3, CuO和CoO。 已證明，由硼矽玻璃組合物組成的表面特別有效。硼矽玻璃具有超過25%的氧化硼含量，例如70/30的Si02/B203組成。
有時候用便於核酸結合的官能團修飾磁性顆粒。這樣的基團包括(不限於)用於捕獲含多聚A的核酸的多聚T寡核苷酸，用於捕獲生物素標記的核酸的鏈黴抗生物素，和用於捕獲包含與探針互補的唯一序列的核酸的特定探針序列。但是，最常用的是具有未修飾表面的磁性顆粒，其能夠分離在樣品中存在的任意核酸，不管其序列。
使用MGP的一般的核酸分離方案從破壞細胞或組織以釋放核酸開始。通常使用的組織破壞程序是化學、酶或物理性質的，包括超聲、高壓、剪切力、強鹼、去垢劑或離液劑、蛋白酶或脂酶。用於化學和酶裂解，裂解試劑一般包括緩衝劑、鹽、一種或多種變性物質和離液物質、蛋白酶和任選地核酸酶抑制劑和防腐劑。裂解試劑導致蛋白質的降解，核酸酶的抑制和脂、脂蛋白等的增溶。例如，緩衝劑可為Tris，鹽可為鈉、鉀、銨或鎂鹽，例如氯化物或醋酸鹽，去垢劑可為十二烷基硫酸鈉、Triton-X或Tween，離液劑可為尿素、硫脲、亞碘酸鈉、十二烷基硫酸鈉、高氯酸鈉、硫氰酸胍、異硫氰酸胍或亞氯酸胍，核酸酶抑制劑可為螯合劑例如EDTA，防腐劑可為金屬疊氮化物，和蛋白酶可為蛋白酶K。通常，在70至100 C之間的溫度，例如，90對大多數樣品，上面描述的裂解試劑和條件足以獲得細胞的裂解和將核酸釋放到溶液中。不幸的是，對一些樣品類型，裂解造成了主要挑戰。一些細胞、生物和組織需要劇烈的裂解條件以破壞細胞壁或組織和釋放細胞內含物。例如，革蘭氏陽性病原體例如結核分支桿菌iMercwAxsis)具有富含脂類的肽聚糖細胞壁。檢測結核分支桿菌和其他分支桿菌的快速方法是世界範圍內的需要。然而，核酸分離經常是達到測定靈敏度期望水平的限制因素。見Neonakis等人(2008) Molecular diagnostic tools inmycobacteriology, J. Microbiol. Methods, 75:111 目前，在分支桿菌檢測測定中的期望靈敏度是通過包括重複洗滌和離心步驟的多步驟核酸分離程序得到。見Shamputa等人(2004) Molecular genetic methods for diagnosis and antibiotic resistance detection of mycobacteria from clinical specimens,122:728。然而這樣的程序不可自動化，且對大多數使用者不實用。
在使用MGP分離核酸的一般方法中，在樣品中的細胞區室已被破碎以釋放核酸後，使樣品與MGP接觸以實現核酸與MGP的結合。可在裂解前將MGP加入樣品。例如，MGP可存在於將加入初始樣品的容器中。已經發現，MGP的存在不影響樣品的裂解。可選地，可首先裂解樣品，並僅在裂解步驟完成後引入MGP。
為了實現與MGP的結合，一般將樣品與MGP混合併在此結合混合物中孵育足夠的時間使結合發生。通過在不同時點測定固定在磁性玻璃顆粒表面上的核酸量，或通過在不同的孵育時間後測定核酸產量，可容易地最優化此步驟。一般，10秒至30分鐘之間的孵育時間對核酸是合適的。
在大多數情況下，包含釋放的核酸的裂解試劑是適於MGP結合發生的環境。然而，在有些情況下，裂解試劑使環境不適於核酸結合至磁性玻璃顆粒的表面。特別是當磁性玻璃顆粒具有未修飾的表面時，核酸和顆粒表面之間的結合依賴於例如結合混合物的PH和離子強度的條件。已經發現，核酸與MGP的最大結合發生在低pH下，例如pH 5或更低。然而，對有些應用，可能不能達到結合混合物的這樣低的pH。例如，用於裂解分支桿菌的裂解試劑具有12或更高的pH值。在用於分離分支桿菌核酸的一般程序中，在細胞裂解後的中和步驟期間降低pH，但不低於pH9。在pH 9或更高時，核酸與磁性玻璃顆粒的結合是低效的。迄今為止，通過延長的孵育時間克服此結合的低效率。這種解決問題的方式對臨床應用是不現實的。此外，延長的孵育對核酸模板的穩定性有威脅，特別是RNA模板。
發明概述
本發明是從包含核酸的樣品溶液中分離核酸的方法，其包括使樣品溶液接觸能夠結合核酸的固相和包含乙烯胺化合物的結合混合物；在核酸可結合固相的條件下孵育包含固相的樣品溶液；和從溶液中分離固相。本方法任選地包含在洗脫前洗滌結合的核酸的步驟。在一些實施方案中，所述方法包括在分離後檢測核酸。本發明還包括用於分離核酸的反應混合物，所述混合物包含能夠結合核酸的固相和乙烯胺化合物。本發明也包括使用固相從樣品中分離核酸的試劑盒，所述試劑盒包含能夠結合核酸的固相和乙烯胺化合物。
發明詳述 定義
本文中使用的術語「乙烯胺化合物」指具有通式(NH2-CH2=CH2) n-NH2的分子，其中η是
1-10或更多。用於本發明的乙烯胺化合物包括，但不限於，乙烯二胺(EDA)，二乙烯三胺(DETA)，三乙烯四胺(TETA)，四乙烯五胺(TEPA)和五乙烯六胺(PEHA)。本領域技術人員將理解，其他乙烯胺化合物可用於本發明。
本文中使用的術語「樣品」指包含目的物質(例如核酸)的混合物或溶液。樣品可包含固體或液體組織、體液、真核細胞(包括植物、真菌、動物或人細胞)的培養物或懸浮 物，原核細胞(包括細菌細胞)的培養物或懸浮物。樣品可包含病毒。樣品也可包含含有目的物質的無細胞溶液。取決於樣品的性質，其可能需要化學或物理處理以便於從樣品中分離目的物質。例如，可能需要處理樣品以從細胞和亞細胞區室中釋放核酸。
本文中使用的術語生物樣品的「成分」指一類分子(例如，蛋白質、核酸等)或特定靶，例如希望檢測的特定蛋白質或核酸序列。
本文中使用的術語「核酸」指脫氧核糖核苷酸(包含2-脫氧-D-核糖)的聚合物(即，DNA)，多核糖核苷酸(包含D-核糖)(即，RNA)，和嘌呤或嘧啶鹼基，或修飾的嘌呤或嘧啶鹼基的任意其他N-糖苷類似物，或其組合。
在本發明的方法中，使用磁性玻璃顆粒從樣品中分離核酸，其中核酸與磁性玻璃顆粒的結合通過一種或多種乙烯胺化合物的存在而增強。
在一些實施方案中，樣品包含全細胞。使用適於破壞細胞膜和細胞壁(如果存在)的裂解試劑裂解細胞，從而從細胞和亞細胞區室中釋放核酸。破壞細胞和組織的多種方法是本領域已知的。在 Sambrook & Ru s s e 11 ,Molecular Cloning, A Laboratory Manual (第3版，2001)中提及和描述了許多方法。
在一些實施方案中,樣品包含革蘭氏陽性菌。使用包含強化學鹼(例如鹼金屬氫氧化物)、去垢劑和鹽並具有高於12的pH的裂解試劑裂解革蘭氏陽性菌。在一些實施方案中，將包含革蘭氏陽性菌的樣品加熱至80 C和100 C之間，通常約95 C，並孵育5和30分鐘之間，通常約15分鐘。
根據本發明，在適於核酸與磁性玻璃顆粒結合的條件下，使不含細胞和亞細胞區室的含核酸樣品與磁性玻璃顆粒接觸。已經發現將乙烯胺化合物加至結合混合物大大增加了核酸與磁性玻璃顆粒表面結合的效率。此現象在高PH下特別有利。在結合混合物中存在金屬鹽，例如鎂或錳鹽，例如氯化物或醋酸鹽進一步提高結合效率。
在一些實施方案中，乙烯胺化合物的濃度在10和65 mM之間，例如，16 mM。
在結合步驟後，可從包含乙烯胺化合物的溶液中分離具有結合的核酸的磁性玻璃顆粒。取決於磁性玻璃顆粒的大小和類型，在孵育期間從液體中分離出顆粒，或在孵育後將顆粒保留在懸浮物中並需要進一步的分離。如需分離步驟，通過應用磁場從樣品溶液中分離具有結合的核酸的顆粒。例如，可將磁性玻璃顆粒拉到進行孵育的樣品容器的壁或底部。然後可通過吸移或抽吸從樣品容器中去除包含樣品中存在的任意未結合物質和汙染物的液體。
可任選地用一種或多種洗滌溶液洗滌一次或多次具有結合的核酸的磁性玻璃顆粒。洗滌溶液具有不引起核酸從顆粒表面釋放，但可洗去仍與核酸或磁性玻璃顆粒相關的(associated)不想要的汙染物的組成。在一些實施方案中，初始的洗滌溶液包含醇，例如乙醇或異丙醇。洗滌溶液也可包含離液鹽和緩衝液。在一些實施方案中，隨後的洗滌溶液是無醇的，但包含鹽、緩衝液和任選地，防腐劑。此洗滌步驟可通過孵育洗滌溶液和結合核酸的磁性玻璃顆粒進行。可在此步驟中重懸顆粒以實現與洗滌液的最大接觸。然後從樣品容器中去除汙染的洗滌溶液。
在最後的洗滌步驟後，可在真空中短暫乾燥具有結合的核酸的磁性玻璃顆粒，或允許殘留的洗滌液蒸發。如果需要，可從磁性顆粒中分離核酸和任選地從包含磁性顆粒的容器中移除核酸，留下顆粒。可使用具有低鹽含量的緩衝液從磁性玻璃顆粒中洗脫核酸。在一些實施方案中，洗脫緩衝液包含Tris。任選地，洗脫緩衝液可包含防腐劑和核酸酶抑制齊U，例如螯合劑，例如EDTA。在其他實施方案中，洗脫緩衝液是含有或不含防腐劑的水。
在一些實施方案中，在下遊應用中核酸可保持與磁性顆粒結合。(見例如美國申請 公開號20040014070)。在其他實施方案中，核酸從磁性玻璃顆粒上分離，但顆粒與核酸保留在容器中用於下遊應用。例如，公開US20040014070教導了通過溶膠-凝膠法製備的磁性玻璃顆粒提高了核酸通過PCR擴增的效率。在其他情況下，核酸在洗脫後可從磁性玻璃顆粒中分離。通常，從包含磁性玻璃顆粒的容器中移除包含核酸的溶液。
在一些實施方案中，分離核酸的方法還包括擴增和檢測分離的靶核酸。例如，使用PCR 進行擴增和檢測，見and Applications for DNA Amplification (H. A.Erlich 編，Freeman Press, New York, N. Y. , 1992) ; PCR Pro toco Is A Guide to Methodsand Applications (Innis,等人編，Academic Press, San Diego, Calif. ,1990)。也可通過連接酶鏈式反應(LCR)(美國專利號5，185，243，5，679，524和5，573，907)或任意其他合適的核酸擴增技術進行擴增和檢測。儘管任意下遊分析方法與本發明的分離方法相容，根據本發明的裂解溶液和結合溶液的組成特別地與下遊PCR應用相容。
在實時PCR測定中，標記探針產生的信號與輸入的靶核酸的量成比例。輸入越大，螢光信號越過預定閾值(Ct)越早。因此，可通過相互比較樣品或比較樣品與具有已知核酸量的對照樣品測定靶核酸的相對或絕對量。
在另一個實施方案中，本發明是用於分離核酸的反應混合物。反應混合物可包含裂解試劑，所述試劑包含一種或多種去垢劑，乙烯胺化合物和任選地，金屬鹽，例如，鎂或錳鹽，一種或多種防腐劑，和/或一種或多種螯合劑。在一些實施方案中，裂解試劑具有12或更高的pH值。在一些實施方案中，反應混合物中的裂解試劑包含濃度為1-10%的一種或多種去垢劑，濃度為O. 5-2 mM的一種或多種螯合劑例如EDTA，濃度為O. 01-0. 1%的一種或多種防腐劑，例如疊氮化鈉，濃度為10-65 mM的乙烯胺化合物和濃度為5-25 mM的金屬鹽，例如鎂或錳鹽，例如氯化物或醋酸鹽。
在一些實施方案中，反應混合物還包含含有待分離的核酸的樣品。在有些情況下，樣品包含裂解的革蘭氏陽性菌作為核酸來源。在另一個實施方案中，反應混合物包含磁性玻璃顆粒。在有些情況下，通過在美國專利6，870，047和其中引用的參考中描述的溶膠-凝膠法製造顆粒。[0030]在另一個實施方案中，本發明是使用磁性玻璃顆粒分離核酸的試劑盒。試劑盒包括裂解試劑，所述試劑包含一種或多種去垢劑，和任選地，一種或多種防腐劑，乙烯胺化合物和任選地，鎂或錳鹽。在一些實施方案中，在分開的容器中提供裂解試劑、乙烯胺化合物和鎂或錳鹽。在一些實施方案中，裂解試劑可具有12或更高的pH值。在一些實施方案中，試劑盒中包含的裂解試劑包含濃度為1-10%的一種或多種去垢劑，濃度為O. 5-2 mM的一種或多種螯合劑例如EDTA，濃度為O. 01-0. 1%的一種或多種防腐劑，例如疊氮化鈉，濃度為10-65 mM的乙烯胺化合物和濃度為5-25 mM的鎂或錳鹽，例如氯化鎂或醋酸錳。試劑盒可還包括磁性玻璃顆粒。磁性玻璃顆粒可參入裂解試劑，或存在於試劑盒中的單獨容器中。當磁性玻璃顆粒存在於單獨的容器中時，可在醇 例如異丙醇中懸浮顆粒。在有些情況下，通過在美國專利6，870，047和其中引用的參考中描述的溶膠-凝膠法製造在本發明的試劑盒中包含的磁性顆粒。在一些實施方案中，試劑盒任選地包含中和試劑、洗滌試劑和洗脫試齊U。中和試劑可包含緩衝液、鹽和防腐劑並具有6和8之間的pH，最優選pH 7.5。在一些實施方案中，緩衝液可為Tris，鹽可為氯化鎂和防腐劑可為疊氮化鈉。洗滌試劑可包含醇。洗脫試劑可包含緩衝液和防腐劑並具有8. 5的pH。
實施例
僅作為說明且不限制本發明的範圍，應用本方法從結核分支桿菌(MTB)中分離核酸。
實施例I:
為了裂解，包含100 μ 結核分支桿菌(MTB)細胞懸浮物或相同體積的在67 mM磷酸鹽 pH 6. 8 中的 MTB DNA 的樣品與 400 μ 裂解試劑(50 mM NaOH, 1% Triton X-100,1 mMEDTA,O. 05% NaN3,pH 12+)混合併在95°C孵育15分鐘。然後加入400 μ 中和試劑(8-64mM 乙烯胺，200 mM Tris, 8-23 mM MgCl2 或Mg (OAc) 2 O. 05% NaN3, pH 7. 5)。然後加入 IOOuL磁性玻璃顆粒(Roche Molecular Systems, Inc. , Branchburg, N. J.)並在室溫或在 37°C孵育樣品5-30分鐘。然後通過去除上清分離磁性玻璃顆粒，並用7. 5 mM檸檬酸鈉二水合物，O. 05% (w/v) MIT, pH 4· I 洗 2 次。用 50-100 μ 洗脫試劑(30 mM Tris, pH 8. 5,0. 2%w/v對輕基苯甲酸甲酯(輕苯甲酯)，0. 09% NaN3)洗脫核酸。人工或通過Hamilton Star儀器(Hamilton Robotics, Inc.，Reno, Nev.)自動進行裂解後程序。
通過定量PCR又稱實時PCR檢測分離的核酸。使用50 μ 洗脫液和50 μ 主混合物(master mix)進行PCR,主混合物包含154 mM三甲基甘氨酸(Tricine), 110 mM氫氧化鉀，190 mM 醋酸鉀，19% 甘油(v/v)，2. 3% DMS0,1. 16 mM dATP, I. 16 mM dCTP, I. 16 mMdGTP, I. 16 mM dUTP，上遊和下遊引物，靶探針，內部對照探針，DNA聚合酶，尿嘧啶-N-DNA糖基化酶，0. 09%疊氮化鈉(w/v)，pH 8. 50和20拷貝/反應的內部對照DNA。在C0BAS TAQMAN 48分析儀上的擴增條件是在50°C 5分鐘，之後2個循環的98°C 20秒、61°C秒和70°C秒，然後55個循環的95°C 25秒、61°C 40秒和70°C 20秒。
結果以「達到閾值的循環」(Ct)值(來自樣品的螢光超過背景螢光和因此「越過閾值」的循環數)表示。Ct反映了核酸模板的初始量。較低的Ct值指示反應中核酸模板的初始量較多，而較高的Ct值指示反應中核酸模板的初始量較少。表1-3顯示了包含使用本發明的方法分離的核酸的每個PCR反應的Ct值。[0035]表I
權利要求
1.一種從包含核酸的樣品溶液中分離核酸的方法，其包括 a.使樣品溶液與能夠結合核酸的固相和包含乙烯胺化合物的結合混合物接觸； b.在核酸可結合固相的條件下孵育包含固相的樣品溶液；和 c.從溶液中分離固相。
2.權利要求
I的方法，其還包括洗滌結合固相的核酸。
3.權利要求
I的方法，其還包括從固相洗脫核酸。
4.權利要求
I的方法，其中所述樣品溶液通過裂解細胞得到。
5.權利要求
4的方法，其中所述樣品溶液通過裂解選自芽孢桿菌梭菌iClostridium)，葡萄球菌{Staphylococcus'),鏈球菌(^Streptococcus')，腸球菌iEnterococcus),分支桿菌(Mycobacterium")及其組合的革蘭氏陽性菌得到。
6.權利要求
I的方法，其中在步驟a中的所述結合混合物還包含金屬離子。
7.權利要求
6的方法，其中在步驟a中的所述結合混合物包含鎂或錳離子。
8.權利要求
I的方法，其中在步驟a中的所述結合混合物還包含鹼金屬氫氧化物和去垢劑。
9.權利要求
8的方法，其中在步驟a中的所述結合混合物包含等體積的溶液I(50mMNaOH, 1% Triton X-100, ImM EDTA,0. 05% NaN3，pH 12+)和溶液2 (10_65mM 乙烯胺，200mMTris,5-25mM MgCl2,0. 05% NaN3, pH 7.5)的混合物。
10.權利要求
I的方法，其中所述能夠結合核酸的固相包含具有磁性核心和含二氧化矽的外層的顆粒。
11.一種用於使用固相從樣品中分離核酸的反應混合物，所述混合物包含能夠結合核酸的固相和乙烯胺化合物。
12.權利要求
11的反應混合物，其還包含鹼金屬氫氧化物和去垢劑。
13.權利要求
11的反應混合物，其還包含金屬離子。
14.權利要求
13的反應混合物，其包含鎂或錳離子。
15.權利要求
11的反應混合物,其中所述能夠結合核酸的固相包含具有磁性核心和含二氧化矽的外層的顆粒。
16.一種用於使用固相從樣品中分離核酸的試劑盒，所述試劑盒包含能夠結合核酸的固相和乙烯胺化合物。
17.權利要求
16的試劑盒，其還包含一種或多種裂解試劑、中和試劑、洗滌試劑和洗脫試劑。
18.權利要求
16的試劑盒，其中所述能夠結合核酸的固相包含具有磁性核心和含二氧化矽的外層的顆粒。
19.權利要求
16的試劑盒，其中所述裂解試劑包含鹼金屬氫氧化物和去垢劑，中和試劑包含乙烯胺化合物，鎂或錳離子和緩衝液。
專利摘要
本發明是一種使用能夠結合核酸的固相，例如磁性玻璃顆粒分離核酸的方法，其中通過乙烯胺化合物的存在增強核酸與固相的結合。本發明還包括用於分離核酸的包含乙烯胺化合物的反應混合物和用於實施所述方法的試劑盒。
文檔編號C12N15/10GKCN102834518SQ201180005525
公開日2012年12月19日 申請日期2011年1月5日
發明者J.A.詹森, E.凱格 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan