用於改善脂質代謝的組合物和食品的製作方法

2023-05-29 06:22:41 1

專利名稱：用於改善脂質代謝的組合物和食品的製作方法
發明的背景發明的領域本發明涉及具有PPAR(過氧化物酶體增殖劑激活的受體)激動劑活性的藥物，更詳細地說，涉及胰島素抗性的改善、脂質代謝的改善、體重增加的抑制、或瘦身所用的藥物。本發明還涉及與這些藥物配合而製成的食品。
背景技術：
近年來，隨著飲食生活的逐漸歐美化，每位居民的脂肪攝取量也在上升，稱為糖尿病、高血脂症、高血壓、肥胖等生活習慣病的疾病迅速增加。這些疾病容易相互並發，其根源與胰島素抗性的存在有很大的關係。
如山田等的報導，大多數表現出耐糖能力異常的患者中，多數出現並發高中度脂肪血症、高膽固醇血症、低HDL-膽固醇血症的情況(Diabetes Care 17107-114，1994)。Reaven將具有胰島素抗性引起的耐糖能力障礙、高血壓、高VLDL-膽固醇血症、低HDL-膽固醇血症的症狀稱為綜合症X，它的改善對腦血管障礙、冠動脈疾病的預防很重要(Diabetes 371595-1607，1988)。這樣的糖尿病、高血脂症、高血壓等的所謂成人病容易集中在一個患者身上，這種情況稱之為腦血管障礙、冠動脈疾病原因的多危險因子。
胰島素抗性引起的糖尿病患者及其後備群體的總人數在日本超過1300萬人，該數目正在不斷增加。因胰島素抗性而引起的胰島素的過量分泌，通過脂質代謝的異常而引起LDL膽固醇和中性脂肪的增加、高血壓等。此外，因糖尿病引起的血糖值上升，會引起神經障礙和視網膜症、腎臟障礙等的併發症。因此，開發改善胰島素抗性和高血糖的藥物變得尤為重要。已知改善胰島素抗性的藥有四氫噻唑衍生物等藥劑，但也有報導長期服用有增加身體脂肪的副作用，所以必須開發新的藥物。此外，從胰島素抗性的發病與生活習慣密切相關的性質考慮，還希望在日常的飲食中，持續攝取具有改善作用的食品。
脂質代謝的異常不僅是因為胰島素抗性，而且是由於脂肪和膽固醇的過量攝取而產生的。血中的LDL膽固醇或中性脂肪量的增加，以及HDL膽固醇量的降低都是引起動脈硬化的原因。包括缺血性心臟病、腦血管障礙在內的動脈硬化症的死亡率已超過了惡性腫瘤，根據青少年中的脂肪攝取量和成年人中的動物脂肪攝取量的顯著增加，可以預料，在將來，因動脈硬化的死亡率進一步上升。在這種狀況下，迫切希望使具有改善脂質代謝的效果、抑制脂肪積累的效果、以及使能從末梢組織抽出過剩的膽固醇的好膽固醇HDL升高的效果的醫藥品、飲食品。己知，以前有攝取作為脂質代謝改善劑的亞油酸等多價不飽和脂肪酸的方法，和用祛脂乙酯製劑和煙酸等方法。但是，因多價不飽和脂肪酸必須長期連續服用，所以也有過量攝取的問題；纖維素酯製劑有筋痙攣等副作用；而煙酸也有全身潮紅和胃腸障礙等副作用的缺點。
作為改善胰島素抗性和脂質代謝異常等病態的藥劑，有四氫噻唑衍生物(ビオグリタゾン、トログリタゾン)和祛脂乙酯製劑(苯基祛脂乙酯製劑)，已知這些藥物對PPAR起激動劑的作用。前者主要以分布在脂肪組織中的γ型(以下稱為「PPARγ」)為靶標，後者以存在於肝臟、腎臟、心臟、消化道的α型(以下稱為「PPARα」)為靶標而作用。
忽布是歐洲原產的桑木科多年草(學名啤酒花Humulusluplus)，一般，將其球果(雌花成熟的果)稱為忽布，用以使啤酒有苦味、香氣而著名，人們可以長期攝取。這些苦味、香氣來自忽布的蛇麻素部分(球果內苞的根部形成的黃色顆粒)。忽布還用作民間藥，已知其功效有鎮靜效果、入眠、安眠效果、增進食慾、健胃作用、利尿作用等多種生理效果。而且，關於其抗糖尿病作用也有報導(特開昭50-70512號公報，特開昭59-59623號公報)。但是，至於忽布中的哪種成分產生這些生理作用尚不清楚。
此外，最近，還報導了有關來源於忽布球果除去蛇麻素部分後的忽布苞的多酚類的脂肪酶抑制作用、體重增加抑制作用(特開2001-321166號公報、特開2001-131080號公報)。但是，與忽布的苦味成分葎草酮和異葎草酮類有關的作為PPAR激動劑的活性、和有關該激動劑活性的脂肪細胞分化的活性、和有關活化β氧化酶的活性都尚不清楚。而且，有關該苦味成分改善胰島素抗性，增加血中HDL膽固醇，和抑制肝臟脂質積累的效果等改善脂質代謝效果、抑制體重增加效果、防止脂肪積累效果等都尚未公開。
發明的概要本發明者發現，忽布的主要苦味成分葎草酮類及其異構化物等具有PPARα和PPARγ的激動劑作用。本發明者等還發現，這些化合物具有降低血中游離脂肪酸濃度、中性脂肪濃度、胰島素濃度和抵抗素濃度的作用，以及改善耐糖能力的作用等改善胰島素抗性的作用。本發明者還進一步發現，這些化合物具有增加血中HDL膽固醇濃度的作用、抑制肝臟的膽固醇和中性脂肪積累的作用等改善脂質代謝的作用；具有抑制內臟脂肪積累的作用；具有抑制因高脂肪和高膽固醇的攝取而使體重增加的作用。本發明是基於這些知識的發明。
本發明的目的是提供用於治療、預防、或改善通過PPAR的活化，能夠治療、預防、或改善的疾病或症狀，特別是胰島素抗性糖尿病和高血脂症的組合物和食品。
本發明的另一個目的是提供用於胰島素抗性的改善、脂質代謝的改善、體重增加的抑制、以及瘦身等的組合物和食品。
本發明的藥物組合物是含有式(I) [上述式中，R1和R2代表C1-6的烷基或C2-6的鏈烯基，R3和R4代表羥基、C1-6的烷基、或C2-6的鏈烯基，但R3和R4不同時代表羥基。]、式(II)
[上述式中，R5、R6、和R7代表氫原子、C1-6的烷基或C2-6的鏈烯基，R8和R9代表氫原子、羥基、C1-6的烷基、C2-6的鏈烯基、-C(＝O)R10、或-CH(-OH)R10，R10代表C1-6的烷基或C2-6的鏈烯基，但R8和R9不同時代表羥基。]、式(III) [上述式中，R11和R12代表氫原子、C1-6的烷基、或C2-6的鏈烯基，R13和R14代表羥基、C1-6的烷基、C2-6的鏈烯基、-C(＝O)R15、或-CH(-OH)R15，R15代表C1-6的烷基或C2-6的鏈烯基，但R13和R14不同時代表羥基。]、式(IV) [上述式中，R16、R17、和R18代表氫原子、C1-6的烷基、或C2-6的鏈烯基。]、或式(V)
[上述式中，R19代表C1-6的烷基或C2-6的鏈烯基。]的化合物或它們的藥用鹽或溶劑化物(以下，有時稱為「本發明的有效成分」)，或含有忽布提取物和/或異構化忽布提取物作為有效成分，並用於治療、預防或改善通過PPAR的活化而能夠治療、預防或改善的疾病或症狀的藥物組合物。
本發明的組合物是含有本發明的有效成分、或含有忽布提取物和/或異構化忽布提取物作為有效成分的用於胰島素抗性的改善、脂質代謝的改善、體重增加的抑制、或瘦身的組合物。
本發明的組合物是含有本發明的有效成分、或含有忽布提取物和/或異構化忽布提取物作為有效成分的用於PPAR活化的組合物。
本發明的食品是含有本發明的有效成分、或含有忽布提取物和/或異構化忽布提取物作為有效成分的用於胰島素抗性的改善、脂質代謝的改善、體重增加的抑制、或瘦身的食品。
胰島素抗性糖尿病和高血脂症是慢性病，而且其病態複雜，糖代謝異常的同時，還伴隨著脂質代謝的異常和循環器官系統的異常。它的藥物治療大多數要經過較長的期間，所以不能無視因給藥量增大和給藥的長期化所導致的副作用等種種問題。本發明的組合物的有效成分是可以長年作為食品使用的在忽布中含有的成分。因此，本發明的組合物具有患者即使長期服用，其副作用也很少、安全性高的優點。
附圖的簡要說明

圖1表示實施例1中，血中總膽固醇濃度的推移。圖中的*；表示危險率為5％以下(以下相同)。黑方塊代表Kettle給藥組，黑三角代表對照給藥組。
圖2表示實施例1中，血中HDL膽固醇濃度的推移。黑方塊代表Kettle給藥組，黑三角代表對照給藥組。
圖3表示實施例1中，動脈硬化指數的推移。黑方塊代表Kettle給藥組，黑三角代表對照給藥組。
圖4表示實施例1中，血中中性脂肪濃度的推移。黑方塊代表Kettle給藥組，黑三角代表對照給藥組。
圖5表示實施例1中，每1kg體重的腎臟周圍脂肪重量。
圖6表示實施例1中，每隻小鼠1天攝食量的推移。黑方塊代表Kettle給藥組，黑三角代表對照給藥組。
圖7表示實施例1中，小鼠的體重推移。黑方塊代表Kettle給藥組，黑三角代表對照給藥組。
圖8表示實施例1中，每1g肝臟的磷脂質量(mg)。
圖9表示實施例1中，每1g肝臟的膽固醇量(mg)。
圖10表示實施例1中，每1g肝臟的中性脂肪量(mg)。
圖11表示實施例2中，血中總膽固醇濃度的推移。有意差未表示。
圖12表示實施例2中，血中HDL膽固醇濃度的推移。有意差未表示。
圖13表示實施例2中，動脈硬化指數的推移。有意差未表示。
圖14表示實施例2中，脂蛋白的分布。對照組和水溶性提取物給藥組的小鼠血漿通過凝膠過濾進行分析。用水溶性提取物表現出HDL部分的特異上升。
圖15表示實施例2中，每隻小鼠1天攝食量的推移。
圖16表示實施例2中，小鼠的體重推移。
圖17表示實施例3中，每隻小鼠1天攝食量的推移。
圖18表示實施例3中，小鼠的體重推移。
圖19表示實施例3中，解剖時的血中總膽固醇濃度。
圖20表示實施例3中，解剖時的血中HDL膽固醇濃度。
圖21表示實施例3中，解剖時的動脈硬化指數。
圖22表示實施例3中，每1g肝臟的膽固醇量(mg)。
圖23表示實施例3中，每1g肝臟的中性脂肪量(mg)。
圖24表示實施例3中，每1g肝臟的磷脂質量(mg)。
圖25表示實施例3中，每kg體重的臟器周圍(副精巢周圍和腎臟周圍)脂肪重量(mg)。
圖26表示實施例4中，解剖時的血中總膽固醇濃度。
圖27表示實施例4中，解剖時的血中HDL膽固醇濃度。
圖28表示實施例4中，解剖時的動脈硬化指數。
圖29表示實施例4中，每1g肝臟的膽固醇量(mg)。
圖30表示實施例4中，每1g肝臟的中性脂肪量(mg)。
圖31表示實施例4中，每1g肝臟的磷脂質量(mg)。
圖32表示實施例5中，各基因對酸性核糖體蛋白質36B4基因的相對表達量。
圖33表示實施例6中，小鼠每天的飲水量。
圖34表示實施例6中，第5周非絕食時的血糖值。
圖35表示實施例6中，第4周絕食時的血糖值。
圖36表示實施例6中，飼養第2周、第4周的絕食時、和第6周(解剖時)非絕食時的血中中性脂肪濃度。
圖37表示實施例6中，飼養第2周、第4周的絕食時、和第6周(解剖時)非絕食時的血中游離脂肪酸濃度。
圖38表示實施例6中，解剖時副精巢周圍脂肪中抵抗素基固對核糖體蛋白質36B4的相對表達量。
圖39表示實施例7中，耐糖能力試驗的結果。
圖40表示實施例7中，胰島素感受性試驗的結果。
圖41表示實施例8中，體重增加的推移。
圖42表示實施例8中，每天的飼料攝入量的推移。
圖43表示實施例8中，耐糖能力試驗的結果。
圖44表示實施例9中，葎草酮類和異葎草酮類的PPARγ活性。
圖45表示實施例9中，四氫異葎草酮的PPARγ活性。
圖46表示實施例10中，忽布提取物、葎草酮類和異葎草酮類的PPARγ活性。
圖47表示實施例11中，水溶性忽布提取物的PPARα話性。
圖48表示實施例13中，血中中性脂肪濃度(mg/dl)。
圖49表示實施例13中，每1g肝臟的膽固醇量(mg/g)。
圖50表示實施例13中，每1g肝臟的中性脂肪量(mg/g)。
圖51表示實施例13中，每1g肝臟的磷脂質量(mg/g)。
圖52表示實施例13中，體重的推移。菱形、方塊、三角形分別表示對照組(C組)、水溶性提取物給藥組(W組)、精製的異葎草酮類給藥組(IH組)。
圖53表示實施例13中，每卡熱量的體重增加量(g/kcal)。
圖54表示實施例14中，每1g肝臟的膽固醇量(mg/g)。
圖55表示實施例14中，每1g肝臟的中性脂肪量(mg/g)。
圖56表示實施例14中，每1g肝臟的磷脂質量(mg/g)。
圖57表示實施例14中，體重的推移。菱形、方塊分別表示對照組(C組)、蛇麻酮給藥組(L組)。
圖58表示實施例14中，每卡的體重增加量(g/kcal)。
圖59表示實施例15中，水溶性忽布提取物給藥實驗組的OGTT時的血糖值變化。菱形、方塊、三角形分別表示對照組(C組)、水溶性提取物按100mg/kg/天的給藥組(W100組)、水溶性提取物按330mg/kg/天的給藥組(W330組)。
圖60表示實施例15中，水溶性忽布提取物給藥實驗組的OGTT時的血中胰島素濃度變化。菱形、方塊、三角形分別表示對照組(C組)、水溶性提取物按100mg/kg/天的給藥組(W100組)、水溶性提取物按330mg/kg/天的給藥組(W330組)。
圖61表示實施例15中，精製的異副葎草酮給藥實驗組的OGTT時的血糖值變化。菱形、方塊、三角形分別表示對照組(C組)、精製的異副葎草酮按10mg/kg/天的給藥組(IH10組)、精製的異副葎草酮按30mg/kg/天的給藥組(IH30組)。
圖62表示實施例15中，精製的異副葎草酮給藥實驗組的OGTT時的血中胰島素濃度變化。菱形、方塊、三角形分別表示對照組(C組)、精製的異副葎草酮按10mg/kg/天的給藥組(IH10組)、精製的異副葎草酮按30mg/kg/天的給藥組(IH30組)。
圖63表示實施例16中分析的胸部大動脈粥樣硬化病灶的面積(％)。
圖64表示實施例16中分析的腹部大動脈粥樣硬化病灶的面積(％)。
圖65表示實施例16中分析的弓狀大動脈內膜肥厚度。
圖66表示實施例16中分析的大動脈瓣內膜肥厚度。
圖67表示實施例16中測定的解剖時的體重(g)。
圖68表示實施例16中測定的解剖時的腹腔內脂肪重量(g)。
圖69表示實施例16中分析的解剖時的肝臟中性脂肪含量(mg/g)。
圖70表示實施例16中分析的解剖時的血漿高半胱氨酸量(nM/L)。
圖71表示實施例17中分析的大腸的PGE2產生量。
發明的具體說明有效成分及其生產方法本說明書中的C1-6烷基代表碳原子數為1-6的直鏈或支鏈的烷基。
C1-6烷基的例子包括甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、異戊基、新戊基、仲戊基、叔戊基。優選的C1-6烷基可以是C3-5的烷基。
本說明書中的C2-6鏈烯基代表碳原子數為2-6的直鏈或支鏈的鏈烯基。C2-6鏈烯基的例子包括烯丙基、丁烯基、戊烯基、己烯基、3-甲基-1-丁烯、3-甲基-2-丁烯、3-甲基-3-丁烯。優選的C2-6鏈烯基可以是C3-5的鏈烯基。
優選R1代表異丁基、異丙基、1-甲基-丙基、乙基、或異戊基。
優選R2代表3-甲基-2-丁烯。
優選R3代表3-甲基-2-丁烯或羥基。
優選R4代表3-甲基-2-丁烯或羥基。
優選R5代表異丁基、異丙基、1-甲基-丙基、乙基、或異戊基。
優選R6代表氫原子、3-甲基-2-丁烯、或異戊基。
優選R7代表氫原子、或3-甲基-2-丁烯。
優選R8代表氫原子、羥基、-C(＝O)CH2CH＝C(CH3)2、-CH(OH)-(CH2)2CH(CH3)2、-C(＝O)-(CH2)2-CH(CH3)2、-C(＝O)-CH＝CH-CH(CH3)2、或-CH(OH)-CH2CH＝C(CH3)2。
優選R9代表氫原子、羥基、-C(＝O)CH2CH＝C(CH3)2、-CH(OH)-(CH2)2CH(CH3)2、-C(＝O)-(CH2)2-CH(CH3)2、-C(＝O)-CH＝CH-CH(CH3)2、或-CH(OH)-CH2CH＝C(CH3)2。
優選R11代表異丁基、異丙基、1-甲基-丙基、乙基、或異戊基。
優選R12代表3-甲基-2-丁烯。
優選R13代表羥基或-C(＝O)-CH＝CHCH(CH3)2。
優選R14代表羥基或-C(＝O)-CH＝CHCH(CH3)2。
優選R16代表異丁基、異丙基、1-甲基-丙基、乙基、或異戊基。
優選R17代表3-甲基-2-丁烯。
優選R18代表3-甲基-2-丁烯。
優選R19代表異丁基、異丙基、1-甲基-丙基、乙基、或異戊基。
本發明的有效成分之一的式(I)的化合物代表葎草酮類和蛇麻酮類。
葎草酮類包括葎草酮、近葎草酮、副葎草酮、後葎草酮、和預葎草酮。
蛇麻酮類包括蛇麻酮、近蛇麻酮、副蛇麻嗣、後蛇麻酮、和預蛇麻酮。
式(I)的優選化合物為R1代表異丁基、R2代表3-甲基-2-丁烯、R3代表羥基、R4代表3-甲基-2-丁烯的化合物(葎草酮)；R1代表1-甲基-丙基、R2代表3-甲基-2-丁烯、R3代表羥基、R4代表3-甲基-2-丁烯的化合物(近葎草酮)；R1代表異丙基、R2代表3-甲基-2-丁烯、R3代表羥基、R4代表3-甲基-2-丁烯的化合物(副葎草酮)；R1代表乙基、R2代表3-甲基-2-丁烯、R3代表羥基、R4代表3-甲基-2-丁烯的化合物(後葎草酮)；R1代表異戊基、R2代表3-甲基-2-丁烯、R3代表羥基、R4代表3-甲基-2-丁烯的化合物(預葎草酮)；R1代表異丁基、R2代表3-甲基-2-丁烯、R3代表3-甲基-2-丁烯、R4代表3-甲基-2-丁烯的化合物(蛇麻酮)；R1代表1-甲基-丙基、R2代表3-甲基-2-丁烯、R3代表3-甲基-2-丁烯、R4代表3-甲基-2-丁烯的化合物(近蛇麻酮)；R1代表異丙基、R2代表3-甲基-2-丁烯、R3代表3-甲基-2-丁烯、R4代表3-甲基-2-丁烯的化合物(副蛇麻酮)；R1代表乙基、R2代表3-甲基-2-丁烯、R3代表3-甲基-2-丁烯、R4代表3-甲基-2-丁烯的化合物(後蛇麻酮)，以及R1代表異戊基、R2代表3-甲基-2-丁烯、R3代表3-甲基-2-丁烯、R4代表3-甲基-2-丁烯的化合物(預蛇麻酮)。
本發明的有效成分之一的式(II)、式(III)、式(IV)、和式(V)的化合物代表異葎草酮類。
異葎草酮類包括順式或反式-異葎草酮、順式或反式-異近葎草酮、順式或反式-異副葎草酮、順式或反式-異後葎草酮、順式或反式-異預葎草酮、順式或反式-四氫異葎草酮、順式或反式-四氫異近葎草酮、順式或反式-四氫異副葎草酮、順式或反式-四氫異後葎草酮、順式或反式-四氫異預葎草酮、順式或反式-別異葎草酮、順式或反式-別異近葎草酮、順式或反式-別異副葎草酮、順式或反式-別異後葎草酮、順式或反式-別異預葎草酮、順式或反式-副異葎草酮、順式或反式-副(パラ，para)異近葎草酮、順式或反式-副異副葎草酮、順式或反式-副異後葎草酮、順式或反式-副異預葎草酮、順式或反式-葎草酸、順式或反式-近葎草酸、順式或反式-副葎草酸、順式或反式-後葎草酸、順式或反式-預葎草酸、順式或反式-六氫異葎草酮、順式或反式-六氫異近葎草酮、順式或反式-六氫異副葎草酮、順式或反式-六氫異後葎草酮、
順式或反式-六氫異預葎草酮、順式或反式-反異葎草酮、順式或反式-反異近葎草酮、順式或反式-反異副葎草酮、順式或反式-反異後葎草酮、順式或反式-反異預葎草酮、フルポン、近フルポン、副フルポン、後フルポン、預フルポン、三環脫氫異葎草酮、三環脫氫異近葎草酮、三環脫氫異副葎草酮、三環脫氫異後葎草酮、和三環脫氫異預葎草酮。
優選的式(II)的化合物例子有R5代表異丁基、R6代表3-甲基-2-丁烯、R7代表氫原子、R8代表羥基、R9代表-C(＝O)CH2CH＝C(CH3)2的化合物(順式-異葎草酮)；R5代表異丁基、R6代表3-甲基-2-丁烯、R7代表氫原子、R8代表-C(＝O)CH2CH＝C(CH3)2、R9代表羥基的化合物(反式-異葎草酮)；R5代表異丙基、R6代表3-甲基-2-丁烯、R7代表氫原子、R8代表羥基、R9代表-C(＝O)CH2CH＝C(CH3)2的化合物(順式-異副葎草酮)；R5代表異丙基、R6代表3-甲基-2-丁烯、R7代表氫原子、R8代表-C(＝O)CH2CH＝C(CH3)2、R9代表羥基的化合物(反式-異副葎草酮)；R5代表1-甲基-丙基、R6代表3-甲基-2-丁烯、R7代表氫原子、R8代表羥基、R9代表-C(＝O)CH2CH＝C(CH3)2的化合物(順式-異近葎草酮)；R5代表1-甲基-丙基、R6代表3-甲基-2-丁烯、R7代表氫原子、R8代表-C(＝O)CH2CH＝C(CH3)2、R9代表羥基的化合物(反式-異近葎草酮)；R5代表乙基、R6代表3-甲基-2-丁烯、R7代表氫原子、R8代表羥基、
R9代表-C(＝O)CH2CH＝C(CH3)2的化合物(順式-異後葎草酮)；R5代表乙基、R6代表3-甲基-2-丁烯、R7代表氫原子、R8代表-C(＝O)CH2CH＝C(CH3)2、R9代表羥基的化合物(反式-異後葎草酮)；R5代表異戊基、R6代表3-甲基-2-丁烯、R7代表氫原子、R8代表羥基、R9代表-C(＝O)CH2CH＝C(CH3)2的化合物(順式-異預葎草酮)；R5代表異戊基、R6代表3-甲基-2-丁烯、R7代表氫原子、R8代表-C(＝0)CH2CH＝C(CH3)2、R9代表羥基的化合物(反式-異預葎草酮)；R5代表異丁基、R6代表異戊基、R7代表氫原子、R8代表羥基、R9代表-C(＝O)CH2CH2CH(CH3)2(異己醯基)的化合物(順式-四氫異葎草酮)；R5代表異丁基、R6代表異戊基、R7代表氫原子、R8代表-C(＝O)CH2CH2CH(CH3)2(異己醯基)、R9代表羥基的化合物(反式-四氫異葎草酮)；R5代表異丙基、R6代表異戊基、R7代表氫原子、R8代表羥基、R9代表-C(＝O)CH2CH2CH(CH3)2(異己醯基)的化合物(順式-四氫異副葎草酮)；R5代表異丙基、R6代表異戊基、R7代表氫原子、R8代表-C(＝O)CH2CH2CH(CH3)2(異己醯基)、R9代表羥基的化合物(反式-四氫異副葎草酮)；R5代表1-甲基-丙基、R6代表異戊基、R7代表氫原子、R8代表羥基、R9代表-C(＝O)CH2CH2CH(CH3)2(異己醯基)的化合物(順式-四氫異近葎草酮)；R5代表1-甲基-丙基、R6代表異戊基、R7代表氫原子、R8代表-C(＝O)CH2CH2CH(CH3)2(異己醯基)、R9代表羥基的化合物(反式-四氫異近葎草酮)；R5代表乙基、R6代表異戊基、R7代表氫原子、R8代表羥基、R9代表-C(＝O)CH2CH2CH(CH3)2(異己醯基)的化合物(順式-四氫異後葎草酮)；R5代表乙基、R6代表異戊基、R7代表氫原子、R8代表-C(＝O)CH2CH2CH(CH3)2(異己醯基)、R9代表羥基的化合物(反式-四氫異後葎草酮)；R5代表異戊基、R6代表異戊基、R7代表氫原子、R8代表羥基、R9代表-C(＝O)CH2CH2CH(CH3)2(異己醯基)的化合物(順式-四氫異預葎草酮)；R5代表異戊基、R6代表異戊基、R7代表氫原子、R8代表-C(＝O)CH2CH2CH(CH3)2(異己醯基)、R9代表羥基的化合物(反式-四氫異預葎草酮)；R5代表異丁基、R6代表3-甲基-2-丁烯、R7代表氫原子、R8代表羥基、R9代表-C(＝O)CH＝CHCH(CH3)2的化合物(順式-別異葎草酮)；R5代表異丁基、R6代表3-甲基-2-丁烯、R7代表氫原子、R8代表-C(＝O)CH＝CHCH(CH3)2、R9代表羥基的化合物(反式-別異葎草酮)；R5代表異丙基、R6代表3-甲基-2-丁烯、R7代表氫原子、R8代表羥基、R9代表-C(＝O)CH＝CHCH(CH3)2的化合物(順式-別異副葎草酮)；R5代表異丙基、R6代表3-甲基-2-丁烯、R7代表氫原子、R8代表-C(＝O)CH＝CHCH(CH3)2、R9代表羥基的化合物(反式-別異副葎草酮)；R5代表1-甲基-丙基、R6代表3-甲基-2-丁烯、R7代表氫原子、R8代表羥基、R9代表-C(＝O)CH＝CHCH(CH3)2的化合物(順式-別異近葎草酮)；R5代表1-甲基-丙基、R6代表3-甲基-2-丁烯、R7代表氫原子、R8代表-C(＝O)CH＝CHCH(CH3)2、R9代表羥基的化合物(反式-別異近葎草酮)；R5代表乙基、R6代表3-甲基-2-丁烯、R7代表氫原子、R8代表羥基、R9代表-C(＝O)CH＝CHCH(CH3)2的化合物(順式-別異後葎草酮)；R5代表乙基、R6代表3-甲基-2-丁烯、R7代表氫原子、R8代表-C(＝O)CH＝CHCH(CH3)2、R9代表羥基的化合物(反式-別異後葎草酮)；R5代表異戊基、R6代表3-甲基-2-丁烯、R7代表氫原子、R8代表羥基、R9代表-C(＝O)CH＝CHCH(CH3)2的化合物(順式-別異預葎草酮)；R5代表異戊基、R6代表3-甲基-2-丁烯、R7代表氫原子、R8代表-C(＝O)CH＝CHCH(CH3)2、R9代表羥基的化合物(反式-別異預葎草酮)；R5代表異丁基、R6代表3-甲基-2-丁烯、R7代表氫原子、R8代表羥基、R9代表-CH(-OH)CH2CH＝C(CH3)2的化合物(順式-副異葎草酮)；R5代表異丁基、R6代表3-甲基-2-丁烯、R7代表氫原子、R8代表-CH(-OH)CH2CH＝C(CH3)2、R9代表羥基的化合物(反式-副異葎草酮)；R5代表異丙基、R6代表3-甲基-2-丁烯、R7代表氫原子、R8代表羥基、R9代表-CH(-OH)CH2CH＝C(CH3)2的化合物(順式-副異副葎草酮)；R5代表異丙基、R6代表3-甲基-2-丁烯、R7代表氫原子、R8代表-CH(-OH)CH2CH＝C(CH3)2、R9代表羥基的化合物(反式-副異副葎草酮)；R5代表1-甲基-丙基、R6代表3-甲基-2-丁烯、R7代表氫原子、R8代表羥基、R9代表-CH(-OH)CH2CH＝C(CH3)2的化合物(順式-副異近葎草酮)；R5代表1-甲基-丙基、R6代表3-甲基-2-丁烯、R7代表氫原子、R8代表-CH(-OH)CH2CH＝C(CH3)2、R9代表羥基的化合物(反式-副異近葎草酮)；R5代表乙基、R6代表3-甲基-2-丁烯、R7代表氫原子、R8代表羥基、R9代表-CH(-OH)CH2CH＝C(CH3)2的化合物(順式-副-異後葎草酮)；R5代表乙基、R6代表3-甲基-2-丁烯、R7代表氫原子、R8代表-CH(-OH)CH2CH＝C(CH3)2、R9代表羥基的化合物(反式-副-異後葎草酮)；R5代表異戊基、R6代表3-甲基-2-丁烯、R7代表氫原子、R8代表羥基、R9代表-CH(-OH)CH2CH＝C(CH3)2的化合物(順式-副異預葎草酮)；R5代表異戊基、R6代表3-甲基-2-丁烯、R7代表氫原子、R8代表-CH(-OH)CH2CH＝C(CH3)2、R9代表羥基的化合物(反式-副異預葎草酮)；R5代表異丁基、R6代表3-甲基-2-丁烯、R7代表氫原子、R8代表羥基、R9代表氫原子的化合物(順式-葎草酸)；R5代表異丁基、R6代表3-甲基-2-丁烯、R7代表氫原子、R8代表氫原子、R9代表羥基的化合物(反式-葎草酸)；R5代表異丙基、R6代表3-甲基-2-丁烯、R7代表氫原子、R8代表羥基、R9代表氫原子的化合物(順式-副葎草酸)；R5代表異丙基、R6代表3-甲基-2-丁烯、R7代表氫原子、R8代表氫原子、R9代表羥基的化合物(反式-副葎草酸)；R5代表1-甲基-丙基、R6代表3-甲基-2-丁烯、R7代表氫原子、R8代表羥基、R9代表氫原子的化合物(順式-近葎草酸)；R5代表1-甲基-丙基、R6代表3-甲基-2-丁烯、R7代表氫原子、R8代表氫原子、R9代表羥基的化合物(反式-近葎草酸)；
R5代表乙基、R6代表3-甲基-2-丁烯、R7代表氫原子、R8代表羥基、R9代表氫原子的化合物(順式-後葎草酸)；R5代表乙基、R6代表3-甲基-2-丁烯、R7代表氫原子、R8代表氫原子、R9代表羥基的化合物(反式-後葎草酸)；R5代表異戊基、R6代表3-甲基-2-丁烯、R7代表氫原子、R8代表羥基、R9代表氫原子的化合物(順式-預葎草酸)；R5代表異戊基、R6代表3-甲基-2-丁烯、R7代表氫原子、R8代表氫原子、R9代表羥基的化合物(反式-異預葎草酸)；R5代表異丁基、R6代表異戊基、R7代表氫原子、R8代表羥基、R9代表-CH(-OH)CH2CH2CH(CH3)2的化合物(順式-六氫異葎草酮)；R5代表異丁基、R6代表異戊基、R7代表氫原子、R8代表-CH(-OH)CH2CH2CH(CH3)2、R9代表羥基的化合物(反式-六氫異葎草酮)；R5代表異丙基、R6代表異戊基、R7代表氫原子、R8代表羥基、R9代表-CH(-OH)CH2CH2CH(CH3)2的化合物(順式-六氫異副葎草酮)；R5代表異丙基、R6代表異戊基、R7代表氫原子、R8代表-CH(-OH)CH2CH2CH(CH3)2、R9代表羥基的化合物(反式-六氫異副葎草酮)；R5代表1-甲基-丙基、R6代表異戊基、R7代表氫原子、R8代表羥基、R9代表-CH(-OH)CH2CH2CH(CH3)2的化合物(順式-六氫異近葎草酮)；R5代表1-甲基-丙基、R6代表異戊基、R7代表氫原子、R8代表-CH(-OH)CH2CH2CH(CH3)2、R9代表羥基的化合物(反式-六氫異近葎草酮)；R5代表乙基、R6代表異戊基、R7代表氫原子、R8代表羥基、R9代表-CH(-OH)CH2CH2CH(CH3)2的化合物(順式-六氫異後葎草酮)；R5代表乙基、R6代表異戊基、R7代表氫原子、R8代表-CH(-OH)CH2CH2CH(CH3)2、R9代表羥基的化合物(反式-六氫異後葎草酮)；R5代表異戊基、R6代表異戊基、R7代表氫原子、R8代表羥基、R9代表-CH(-OH)CH2CH2CH(CH3)2的化合物(順式-六氫異預葎草酮)；以及R5代表異戊基、R6代表異戊基、R7代表氫原子、R8代表-CH(-OH)CH2CH2CH(CH3)2、R9代表羥基的化合物(反式-六氫異預葎草酮)。
優選的式(III)化合物的例子有R11代表異丁基、R12代表3-甲基-2-丁烯、R13代表-C(＝O)CH2CH＝C(CH3)2、R14代表羥基的化合物(順式-反異葎草酮)；R11代表異丙基、R12代表3-甲基-2-丁烯、R13代表-C(＝O)CH2CH＝C(CH3)2、R14代表羥基的化合物(順式-反異副葎草酮)；R11代表1-甲基-丙基、R12代表3-甲基-2-丁烯、R13代表-C(＝O)CH2CH＝C(CH3)2、R14代表羥基的化合物(順式-反異近葎草酮)；R11代表乙基、R12代表3-甲基-2-丁烯、R13代表-C(＝O)CH2CH＝C(CH3)2、R14代表羥基的化合物(順式-反異後葎草酮)；R11代表異戊基、R12代表3-甲基-2-丁烯、R13代表-C(＝O)CH2CH＝C(CH3)2、R14代表羥基的化合物(順式-反異預葎草酮)；R11代表異丁基、R12代表3-甲基-2-丁烯、R13代表羥基、R14代表-C(＝O)CH2CH＝C(CH3)2的化合物(反式-反異葎草酮)；R11代表異丙基、R12代表3-甲基-2-丁烯、R13代表羥基、R14代表-C(＝O)CH2CH＝C(CH3)2的化合物(反式-反異副葎草酮)；R11代表1-甲基-丙基、R12代表3-甲基-2-丁烯、R13代表羥基、R14代表-C(＝O)CH2CH＝C(CH3)2的化合物(反式-反異近葎草酮)；R11代表乙基、R12代表3-甲基-2-丁烯、R13代表羥基、R14代表-C(＝O)CH2CH＝C(CH3)2的化合物(反式-反異後葎草酮)；R11代表異戊基、R12代表3-甲基-2-丁烯、R13代表羥基、R14代表-C(＝O)CH2CH＝C(CH3)2的化合物(反式-反異預葎草酮)。
優選的式(IV)化合物的例子有R16代表異丁基、R17代表3-甲基-2-丁烯、R13代表3-甲基-2-丁烯的化合物(フルポン)；R16代表異丙基、R17代表3-甲基-2-丁烯、R13代表3-甲基-2-丁烯的化合物(副フルポン)；R16代表1-甲基-丙基、R17代表3-甲基-2-丁烯、R13代表3-甲基-2-丁烯的化合物(近フルポン)；R16代表乙基、R17代表3-甲基-2-丁烯、R13代表3-甲基-2-丁烯的化合物(後フルポン)，以及R16代表異戊基、R17代表3-甲基-2-丁烯、R13代表3-甲基-2-丁烯的化合物(預フルポン)。
優選的式(V)化合物的例子有R19代表異丁基的化合物(三環脫氫異葎草酮)；
R19代表異丙基的化合物(三環脫氫異副葎草酮)；R19代表1-甲基-丙基的化合物(三環脫氫異近葎草酮)；R19代表乙基的化合物(三環脫氫異後葎草酮)；R19代表異戊基的化合物(三環脫氫異預葎草酮)。
式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)、和式(V)的化合物可以製成藥用鹽，例如酸加成鹽。作為酸加成鹽有鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽等無機酸鹽；檸檬酸鹽、草酸鹽、蘋果酸鹽、酒石酸鹽、富馬酸鹽、馬來酸鹽、甲磺酸鹽、水楊酸鹽等有機酸鹽。此外，含有羧基的化合物也可以製成鈉、鉀、鈣、鎂、鋁等金屬的鹽；賴氨酸等的胺基酸的鹽。
式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)、和式(V)的化合物可以製成藥用的溶劑化物，例如水合物、醇化物(例如甲醇化物、乙醇化物)、醚化物。
式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)、和式(V)的化合物中，會存在固取代基鏈烯基而形成的順式-反式異構體，但任何一種異構體及它們的混合物都包括在本發明內。
本發明的有效成分可以從市售的產品獲得。
本發明的有效成分可以按照公知的方法製造，例如，可以按照Development in Food Science 27，CHEMISTRY AND ANALYSIS OFHOP AND BEER BITTER ACIDS，M.Verzele，ELSEVIER中所述的方法合成。
式(I)的化合物可以按照Riedl等，Brauwiss 52(1951)，81(1951)，85(1951)，133(1951)所述製造。根皮醯苯可以用作出發原料。在催化劑三氟化硼的存在下，使間苯三酚、醯基氯、腈、或羧酸通過縮合很容易製得根皮醯苯。將這樣所得到的根皮醯苯乙醯化，可以得到一種單烷基化的衍生物(Ia)、二種二烷基化的衍生物(Ib、Ic)、和一種三-或四-烷基化的衍生物(Id、Ie)。
(上述式中，R1的含義與上述定義的內容相同，R′代表C1-6烷基或C2-6鏈烯基)。
將式(Ib)的化合物氧化，通過鏈烯基側鏈在芳香碳原子上的加成，可以得到葎草酮。氧化反應的方法有多種，例如，可以在-50℃使其與五氯化銻反應後，在銀離子存在下，通過加水分解氧化。或也可以在醋酸溶液存在下、或者三氟乙酸和過氧化氫存在下，使其與醋酸鉛進行氧化反應。氧化反應也可以進行如下通過使其與過氧化苯甲醯進行鹼催化反應，或者在二氯甲烷存在下，與二苯硒酸酐進行氧化反應。
式(II)的化合物可以由2-甲基-2-戊烯-4-炔製造。2-甲基-2-戊烯-4-炔可在Cu2(CN)2存在下，由1-溴-4-甲基戊-1，2-二烯通過1，4消除反應得到。另外，將所得的2-甲基-2-戊烯-4-炔加入丙酮酸乙酯中，通過進行水解反應，可以得到2，6-二甲基-2-羥基-5-庚烯-3-炔。在所得的溶液中，加入(COCl)2，將得到的Cl鹽在鎂鹽的存在下，加入3-氧代-5-甲基己酸乙酯中，可以得到環化的2-(3-甲基丁醯(ビタノ)基)-3，4-二羥基-4-(4-甲基-3-戊烯-1-烯基(イニル))-2-環戊酮。所得的化物與1-溴-3-甲基-2-丁烯反應，通過將三鍵進行水合，可以得到異葎草酮類化合物。
式(II)代表的順式或反式-別異草酮可以用葎草酮為原料製造。例如，用近葎草酮、副葎草酮、後葎草酮、預葎草酮為原料，分別可以製造順式或反式-別異近葎草酮、順式或反式-別異副葎草酮、順式或反式-別異後葎草酮、順式或反式-別異預葎草酮。例如，順式或反式-別異葎草酮可按照F.Alderweireldt等的方法(Bull.Soc.Chim.Belges，74(1965)29)，或者M.Verzele等的方法(J.Inst.Brewing，71(1965)232)製造。將葎草酮在pH9.0的磷酸緩衝液中煮沸1小時，冷卻後，用鹽酸將pH調至1.0，然後用異辛烷抽提、乾燥，使溶劑蒸發。隨後用逆流分配法(以下稱為CCD法)，通過在異辛烷和pH5.5的緩衝液水相間進行分配，可將順式-反異葎草酮和反式-反異葎草酮進行分離。
式(II)代表的順式或反式-草酸可以用葎草酮為原料製造。
例如，用近葎草酮、副葎草酮、後葎草酮、預葎草酮為原料，分別可以製造順式或反式-近葎草酸、順式或反式-副葎草酸、順式或反式-後葎草酸、順式或反式-預葎草酸。例如，順式或反式-葎草酸可以通過將葎草酮在強鹼中水解而製造(H.Wieland，Ber.59(1926)2532，或J.F.Carson，J.Am.Chem.Soc.，74(1952)4615)，優選在甲醇中，添加2N的氫氧化鈉，在67℃、氨氣下加熱20分鐘而製造。用冷卻的2N鹽酸使反應停止，用氯仿抽提、然後使溶劑蒸發後，可用CCD法，用氯仿和pH5.1的緩衝液水相進行分離。
式(II)代表的順式或反式-四氫異葎草酮可以用順式或反式-異葎草酮製造。例如，用順式或反式-異近葎草酮、順式或反式-異副葎草酮、順式或反式-異後葎草酮、順式或反式-異預葎草酮為原料，分別製造順式或反式-四氫異近葎草酮、順式或反式-四氫異副葎草酮、順式或反式-四氫異後葎草酮、順式或反式-四氫異預葎草酮。例如，用順式或反式-異葎草酮類，利用碳原子上的鈀，在甲醇中，通過添加氫，可以分別製得順式或反式-四氫異葎草酮類，優選在添加氫後，使溶劑蒸發、乾燥，然後通過在異辛烷中重結晶而製造。四氫異預葎草酮在市場上有售，該市售產品也可使用。
式(II)代表的順式或反式-六氫異葎草酮可以用順式或反式-四氫異葎草酮為原料製造。例如，用順式或反式-四氫異近葎草酮、順式或反式-四氫異副葎草酮、順式或反式-四氫異後葎草酮、順式或反式-四氫異預草酮為原料，分別製造順式或反式-六氫異近葎草酮、順式或反式-六氫異副葎草酮、順式或反式-六氫異後葎草酮、順式或反式-六氫異預葎草酮。例如，順式或反式-六氫異葎草酮類可以由順式或反式-四氫異葎草酮類，用NaBH4，通過還原分別製造。
六氫異預葎草酮在市場上有售，該市售產品也可使用。
式(III)、式(IV)、和式(V)的化合物可按後面所述，將存在於忽布球果、忽布提取物或其異構物中的化合物，通過提取、精製、必要時通過進行進一步修飾而獲得。
式(III)代表的順式或反式-反異葎草酮可以用葎草酮為原料製造。例如，用近葎草酮、副葎草酮、後葎草酮、預葎草酮為原料，分別可以製造順式或反式-反異近葎草酮、順式或反式-反異副葎草酮、順式或反式-反異後葎草酮、順式或反式-反異預葎草酮。順式或反式-反異葎草酮的具體製造方法是將草酮在pH為5.4-11.0的水溶液中煮沸而製得。優選pH為約11.0，優選反應時間為約1.5小時。煮沸後冷卻，用鹽酸處理至酸性，用異辛烷進行抽提，然後蒸發、乾燥，隨後用CCD法，通過乙醚和pH5.5的緩衝液水相可以得到順式-反異葎草酮、反式-反異葎草酮。
式(IV)所代表的フルポン可以用蛇麻酮作為原料製造。例如，用近蛇麻酮、副蛇麻酮、後蛇麻酮、預蛇麻酮為原料，可以分別製造近フルポン、副フルポン、後フルポン、預フルポン。フルポン類具體可以通過蛇麻酮的氧化而製造(D.Wright，Proc.Chem.Soc.，315(1961)，D.Wright，J.Chem.Soc.，1769(1963))。例如，將蛇麻酮在環己烷中、氧氣下振蕩，除去溶劑、通過餾出透明黃色的油進行分離，可以製得フルポン。更優選將在甲醇中的亞硫酸鈉加入蛇麻酮中，直至看不到氣體的吸收，在氧氣下振蕩，然後除去溶劑，用溫熱的己烷將殘留物抽提2次，將提取物懸浮於甲醇中，用2N鹽酸調至酸性後，用水進行稀釋，再用己烷抽提，通過蒸餾可以製得フルポン。
由忽布等天然物製備的產物也可以用作本發明的有效成分。例如，本發明的有效成分存在於忽布球花或忽布提取物和它的異構物中，利用各種色譜法，可以由這些原料分離出本發明的有效成分(參照「釀造物的成分」平成11年12月10日(財)日本釀造協會發行，Developments in Food Scienee 27，CHEMISTRY AND ANALYSIS OF HOPAND BEER BITTER ACIDS的前言和後述參考例)。此外，用離心色譜法，由忽布球花的超臨界提取物(忽布提取物)，也可以大量精製高純度的葎草酮、近葎草酮、副葎草酮(A.C.J.Hermans-Lokkerbol等，J.Chromatography A 664(1994)pp45-53)。進一步將這些混合物通過重結晶，也可以得到純粹的化合物。例如，在忽布球花的超臨界提取物(忽布提取物)中，通過加入1，2-二氨基苯，可以形成由1，2-二氨基苯和葎草酮類構成的特異複合體。將該複合體通過反覆重結晶，可以使由含量最多的葎草酮和1，2-二氨基苯形成的複合體特異地結晶。將結晶的化合物溶於甲醇中，用沸石等樹脂分離出1，2-二氨基苯，即可以得到高純度的葎草酮(參照Colin P.等，J.Inst.Brew.June-July，1993，Vol.99，pp347-348)。這些方法已全部記載在Developments in Food Science 27，CHEMISTRY AND ANALYSIS OF HOPAND BEER BITTER ACIDS，M.Verzele，ELSEVIER中，本領域技術人員可以用這些方法很容易進行實施。
本發明的組合物中，由忽布的蛇麻素部分提取的提取物可以直接、或者也可以將其異構化後作為有效成分使用。忽布是屬於桑科的多年生植物，忽布是該植物的球花(由未受精的雌花成熟而成的花)。忽布的蛇麻素部分是啤酒釀造的原料，用來賦予啤酒苦味和芳香氣味。此外，啤酒的釀造過程中，忽布中的葎草酮類(副葎草酮、近葎草酮、後葎草酮、預葎草酮)異構化為異葎草酮類(異副葎草酮、異近葎草酮、異後葎草酮。異預葎草酮)，賦予啤酒特有的味和香。
忽布提取物可通過將球花或其壓縮物直接、或粉碎後進行抽提操作而製備。抽提方法有例如，用於製備啤酒釀造中所用的忽布提取物的乙醇溶劑抽提法，和超臨界二氧化碳抽提法等。其中超臨界二氧化碳抽提的特徵是多酚成分少，苦味質和精油成分高度濃縮等。此外，作為忽布的抽提方法，也可以採用其他通常所用的方法，例如，將忽布的球花、其粉碎物等在溶劑中冷浸、溫浸等浸漬方法；邊加溫邊攪拌進行抽提、過濾得到抽提液的方法；或滲濾法等。得到的提取液根據需要，用過濾或離心分離除去固形物後，根據使用的方案，直接使用，或者也可以餾去溶劑進行部分濃縮、或乾燥後使用；或者經濃縮或乾燥後，進一步用非極性溶劑洗淨、精製後使用；或將其溶解或懸浮於更適當的溶劑中使用都可以。還有，例如，也可以將如上述所得的溶劑提取液通過減壓乾燥、冷凍乾燥等常用技術，作為忽布提取物的乾燥物使用。
上述抽提中所用的溶劑有下述公知的有機溶劑例如，水；甲醇、乙醇、丙醇和丁醇等碳原予數為1-4的低級醇；醋酸乙酯等低級烷基酯；乙二醇、丁二醇、丙二醇、甘油等甘醇類；其他乙醚、丙酮、醋酸等極性溶劑；苯、己烷等烴；乙醚、石油醚等醚類的非極性溶劑。這些溶劑可以單獨使用，也可以2種以上組合使用。
隨後也可根據需要，通過過濾，將不溶物除去，通過減壓等濃縮使溶劑乾燥。或者將粉碎的球花用超臨界點的碳酸抽提，或者還可優選用液化碳酸氣抽提。此外，優選將這些抽提的粗提取物在鹼或氧化鎂存在下，加熱異構化。通過異構化使葎草酮類變換為異葎草酮類。這種狀態的提取物可以直接用於製備製劑，但也可優選進一步使用含有高濃度有效成分的部分。此外，用各種方法抽提的忽布提取物，和異構化的提取物已作為啤酒添加物在市場上銷售，這些市售產品也可以使用。例如，可以使用從忽布球花的粉碎物用超臨界二氧化碳抽提的、以葎草酮類和蛇麻酮類為主的忽布提取物(例如，CO2 Pure ResinExtract(Hopsteiner公司))、將忽布球花的粉碎物的碳酸氣提取物異構化後得到的提取物(例如，Isomerized Kettle Extract(SS，Steiner公司)，異葎草酮類和蛇麻類為主要成分)、將忽布球花的粉碎物的碳酸氣提取物異構化後，進一步鉀鹽化而形成的低粘度水溶性提取物(例如，ISOHOPCO2N(Engglish Hop Products公司)，異葎草酮為主要成分)等。
此外，當然，上述的方法也可以包括由這些提取物進一步濃縮成含有高濃度有效成分的部分。
用途本發明的有效成分具有PPARα激動劑活性和PPARγ激動劑活性(參照實施例9、10、和11)。
PPARα與脂代謝密切有關，已知PPARα的合成配體祛脂乙酯製劑使血管內的脂蛋白脂肪酶活性亢進，使肝臟的β氧化亢進，作用於肝臟中脂肪酸結合蛋白的活化而增加脂肪酸向肝臟的流入，從而抑制肝臟產生VLDL，結果使血中的VLDL降低(「改變面貌的生活習慣病-糖尿病、高血脂症、高血壓、肥胖」メデイカルレビユ公司，2000年5月25日發行)。
PPARα的合成配體フイブレト製劑還被認為解除了胰島素抗性(Guerre-Millo M.等，J.B.C.27516638-16642，2000)。可以認為，PPARα配體使以肝臟為主的組織的脂肪酸氧化亢進，降低了脂肪毒性，改善了葡萄糖代謝效率，從而解除了胰島素抗性。
已經清楚，PPARγ是承擔脂肪細胞分化的主要調節劑(Cell791147-1156，1994)。因此，PPARγ的激動劑促進脂肪細胞的分化，由該PPARγ的活化而引起的胰島素抗性改善作用的機制如以下所考慮。
具有PPARγ活化所產生的正常功能的脂肪細胞，其處理糖和游離脂肪酸的能力提高，使血液中的糖和游離脂舫酸減少，造成肌肉的游離脂肪酸減少和胰島素抗性的改善。還有，脂肪細胞分泌NTFα和抵抗素等使胰島素抗性惡化的重要生理活性介質，但已清楚，通過PPARγ活化所引起的脂肪細胞的分化，減少了這些介質的分泌量。此外，還考慮到對肌肉和肝臟中少量表達的PPARγ的激動劑的作用。
含有本發明的有效成分的提取物還在基因水平上抑制抵抗素的表達，在胰島素非依賴性糖尿病中，該抵抗素的表達增加，並被認為與胰島素抗性的發病有關(參照實施例6)。抵抗素和胰島素抗性發病的關係在Peraldi P.，等，Mol Cell Biochem.183，169-175，1998；Steppan C.M.等，Nature，409，307-312，2001中已報導。
已知，因胰島素抗性會引起高血脂症。與高血脂症關係的機理考慮如下。胰島素抗性在骨骼肌和脂肪組織中產生，但為了使伴隨著胰島素抗性而產生的耐糖能力的異常正常化，生物體從胰臟分泌過剩的胰島素，保持血糖的體內平衡。這樣造成的高胰島素血症引起了血壓的上升和脂代謝的異常。胰島素在通常情況下抑制脂肪組織中脂肪的分解，在胰島素抗性狀態下，由於該抑制作用的減弱，引起因脂肪分解而釋放過多的脂肪酸。過剩的脂肪酸抑制肌肉中的糖的攝取和分解，使耐糖能力惡化。此外，脂肪酸也進入肝臟，促進肝臟中的中性脂肪合成，增加了分泌到血中的富含在中性脂肪中的VLDL膽固醇。高胰島素血症時，引起VLDL產生的過剩。在胰島素抗性下，脂蛋白脂肪酶活性降低，所以VLDL的中性脂肪的水解也減少，由於LDL膽固醇的分解代謝異常，血中的LDL、IDL膽固醇、中性脂肪增加。進一步明確由於HDL膽固醇的合成減少和分解代謝的亢進，也造成了HDL膽固醇量的降低。
胰島素抗性和肥胖的關係也已有報導。與積累在皮下的脂肪相比，積累在內臟周圍的內臟脂肪的積累，與胰島素抗性的發病有更密切的關係。由內臟脂肪釋放的游離脂肪過量地供給門脈血區域，引起肝臟的胰島素抗性，甚至引起末梢的骨骼肌的胰島素抗性。
含有本發明的有效成分的提取物實際上造成血中HDL膽固醇量的增加、血中磷脂質的增加、血中中性脂肪量的減少、動脈硬化指數的改善、腎臟周圍脂肪量的減少、體重增加的抑制(參照實施例1-4)。
含有本發明的有效成分的提取物實際上在基因水平上使肝β氧化系統亢進(參照實施例5)。
含有本發明的有效成分的提取物表現出改善胰島素抗性的作用(參照實施例7和8)。
因此，本發明的有效成分以及忽布提取物和/或異構化的忽布提取物可以用於治療、預防、或改善通過PPAR的活化能夠治療、預防、或改善的疾病或症狀。
通過PPAR的活化能夠治療、預防、或改善的疾病或症狀包括糖尿病(例如，胰島素抗性糖尿病、胰島素非依賴性糖尿病)；糖尿病併發症(例如，動脈硬化症、心肌梗塞、和狹心症等缺血性心疾病；腦梗塞等腦動脈硬化症；動脈瘤和腎硬變症狀等的腎疾病；脂肪肝或伴隨其而產生的肝臟疾病)；脂質代謝異常(例如，高血脂症、動脈硬化症、和脂肪肝)，特別是高血脂症(例如，高膽固醇血症、低HDL膽固醇血症、高中性脂肪血症)；胰島素抗性及與其相關的疾病(例如，高胰島素血症、耐糖性異常)；肥胖症；以及體重增加。
本發明的有效成分以及忽布提取物和/或異構化的忽布提取物還可以用於胰島素抗性的改善、脂質代謝的改善、體重增加的抑制、或瘦身(飲食)。
胰島素抗性的改善作用具體是通過胰島素濃度的降低、抵抗素濃度的降低、TNFα濃度的降低、耐糖能力的改善、血中的中性脂肪、游離脂肪酸濃度的降低、脂肪細胞小型化(正常化)等的作用而實現，這也構成了本發明的用途的一部分。
脂質代謝的改善作用具體是通過血中HDL濃度的升高、動脈硬化指數的改善、血中中性脂肪降低、肝臟脂質積累的抑制的作用而實現，這也構成了本發明的用途的一部分。然後通過脂質代謝的改善作用而具有抗動脈硬化作用，這也構成了本發明的用途的一部分。
體重增加的抑制作用是通過脂肪積累的抑制，特別是內臟脂肪積累的抑制作用而實現，這也構成了本發明的用途的一部分。
根據本發明，提供本發明的有效成分以及忽布提取物和/或異構化的忽布提取物在製備用於治療、預防、或改善通過PPAR的活化能夠治療、預防、或改善的疾病或症狀的藥物中的使用。
根據本發明，提供本發明的有效成分以及忽布提取物和/或異構化的忽布提取物在製備用於胰島素抗性的改善、脂質代謝的改善、體重增加的抑制、或瘦身的組合物中的使用。
根據本發明，還提供本發明的有效成分以及忽布提取物和/或異構化的忽布提取物在製備用於PPAR活化的組合物中的使用。
根據本發明，提供治療、預防、或改善通過PPAR的活化能夠治療、預防、或改善的疾病或症狀的方法，該方法包括將治療有效量的本發明的有效成分以及忽布提取物和/或異構化的忽布提取物、必要時包括藥用製劑添加物，一起對哺乳類的給藥。
根據本發明，還提供改善胰島素抗性、改善脂質代謝、抑制體重增加、或瘦身的方法，該方法包括將治療有效量的本發明的有效成分以及忽布提取物和/或異構化的忽布提取物、必要時與藥用製劑添加物一起對哺乳類的給藥。
根據本發明，還提供PPAR的活化方法，該方法包括將治療有效量的本發明的有效成分以及忽布提取物和/或異構化的忽布提取物、必要時與藥用製劑添加物一起對哺乳類的給藥。
組合物和食品本發明的組合物作為藥物提供時，可以通過將本發明的有效成分以及忽布提取物和/或異構化的忽布提取物與藥用添加劑混合而製備。本發明的組合物可以通過口服或非口服給藥。作為口服劑有顆粒劑、散劑、片劑(包括糖衣片)、丸劑、膠囊劑、漿劑、乳劑、懸浮劑。非口服劑包括注射劑、(例如，皮下注射劑、靜脈內注射劑、肌肉內注射劑、腹腔內注射劑)、點滴劑、外用劑(經鼻給藥製劑、經皮製劑、軟膏劑)、坐劑(例如直腸坐劑、陰道坐劑)、這些製劑可以用本領域通常進行的方法，用藥用載體將其製劑化。藥用載體包括賦形劑、結合劑、稀釋劑、添加劑、香料、緩衝劑、增粘劑、著色劑、穩定劑、乳化劑、分散劑、懸浮化劑、防腐劑。例如碳酸鎂、硬脂酸鎂、滑石粉、砂糖、乳糖、果膠、糊精、澱粉、明膠、西黃著、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、低融點蠟、可可奶油。
例如，製劑可按下述方法製造。
口服劑的製造方法在有效成分中添加賦形劑(例如，乳糖、白糖、澱粉、甘露糖醇)、崩解劑、(例如，碳酸鈣、羧甲基纖維素鈣)、結合劑(例如，α-化澱粉、阿拉伯樹膠、羧甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、羥丙基纖維素)或潤滑劑(例如，滑石粉、硬脂酸鎂、聚乙二醇6000)並壓縮成形，然後根據需要，針對味的遮蓋、腸溶性、或持續性的目的，用其已知方法，通過包衣而製造。可用作包衣的試劑有乙基纖維素、羥甲基纖雛素、聚乙二醇、乙酸鈦酸纖維、羥丙基甲基鈦酸纖維素、和オイドラギツト(ロ一ム公司生產，德國，甲基丙烯酸·丙烯酸的共聚物)等。
注射劑可以通過下述方法製造將有效成分與分散劑(例如Tween80(アトラスパウダ一公司生產，美國)、HCO 60(日光ケミカルス公司生產)、聚乙二醇、羥甲基纖維素、海藻酸鈉等)、保存劑(例如，羥苯甲酸甲酯、羥苯甲酸丙酯、苯甲醇、氯丁醇、酚等)、強化劑(例如，氯化鈉、甘油、山梨醇、葡萄糖、轉化糖)等一起溶解、懸浮或乳化於水性溶劑(例如，蒸餾水、生理鹽水、生理鹽水注射液等)或油性溶劑(例如，橄欖油、芝麻油、棉籽油、玉米油等植物油、丙二醇)中。製造時，根據要求，也可以添加助溶劑(例如，水楊酸鈉、醋酸鈉)、穩定劑(例如，人血清白蛋白)、無痛化劑(例如，亞苄基毒芹、鹽酸普魯卡因)等添加劑。
外用劑可以通過將有效成分製成固狀、半固狀或液狀的組合物而製成。例如，上述的固狀組合物可以通過將有效成分直接，或添加了賦形劑(例如，乳糖、甘露糖醇、澱粉、微晶纖維素、白糖)、增粘劑(例如，天然膠類、纖維素衍生物、丙烯酸聚合物)等後進行混合，製成粉狀而製成。上述的液狀組合物的製造方法與注射劑的場合幾乎相同。半固狀的組合物可以是水性或是油性的凝膠劑，或者是軟骨狀的製劑。此外，這些組合物也都可以含有pH調節劑(例如，碳酸、磷酸、檸檬酸、鹽酸、氫氧化鈉)、防腐劑(例如，對羥基安息香酸酯類、氯丁醇、亞苄基毒芹)等。坐劑可以通過將有效成分製成油性或水性的固狀、半固狀或液狀的組合物而製成。該組成物中所用的油性基劑有高級脂肪酸的甘油酯[例如可可脂、ウイテプゾル類(ダイナマイトノ一ベル公司生產)]、中級脂肪酸[例如，ミグリオ一ル類(ダイナマイトノ一ベル公司生產)]、或植物油(例如，芝麻油、大豆油、棉籽油)。用作水性基劑的有聚乙二醇類、丙二醇。此外，水性凝膠基劑有天然膠類、纖維素衍生物、乙烯聚合物、丙烯酸聚合物。
本發明的食品是含有有效量的本發明成分的飲食品。這裡所說的「含有有效量的有效成分」是指，在攝取通常飲食量的場合，每份飲食品中，含有在後述的範圍內的被攝取有效成分量。本發明的食品可以直接用本發明的有效成分、或以上述組合物的形式配合到食品中。更具體地說，本發明的食品可以是將至少1種本發明的有效成分或上述的忽布粉碎物或提取物直接作為飲食品製成的食品、進一步與各種蛋白質、糖類、脂肪、微量元素、維生素類等配合而製成的食品、製成液狀、半液體狀或固狀的食品、添加到一般飲食品中而製成的食品。
本發明中所說的「食品」其含義是指包括健康食品、機能性食品、特定保健用食品、病人用食品。
此外，「食品」的形式無特別的限定，例如，也可以是飲料的形式。
本發明的有效成分具有改善胰島素抗性的作用和改善脂質代謝的作用、抑制因攝取脂肪和膽固醇而引起的內臟脂肪積累和體重增加的作用。因此，對於日常攝取的食品和作為補充而攝取的健康食品及機能性食品而言，通過在含有膽固醇和脂肪的食品中，適當地配合本發明的有效成分或忽布提取物和/或異構化忽布提取物，即可以提供同時具有防止肥胖、預防和改善與胰島素抗性並發的高血脂症和動脈硬化症的發病、以及防止糖尿病預備群進入胰島素非依賴性糖尿病的功能能的食品。即本發明的食品可以作為適合於血清膽固醇高的消費者的食品和擔心血糖值的消費者的食品樣的特定保健食品而提供。
關於飲食品，具體可例舉如下飯類、面類、麵包類、通心粉等含碳水化合物的飲食品；曲奇和蛋糕等西點類、饅頭和羊羹等日本糕點類、糖果類、口香糖類、酸乳類和布丁等的冷點和冰點等的各種點心類；果汁和清涼飲料水、乳飲料等各種飲料；蛋加工品；魚介類(海虹、章魚、貝、鰻等)和畜肉(包括肝等的髒物)的加工品(包括珍味)，但不特別限制於這些。
用本發明的有效成分或忽布的粉碎物或提取物添加並配合到一般食品的原料中進行食品加工時，其用量應在使忽布的苦味不影響飲食品的範圍內，或者最好採用遮蓋苦味的辦法。
因為本發明的組合物和食品是人類可以作為次食品長年攝取的忽布提取物或其衍生物，毒性也低，所以對哺乳動物(例如，人、小鼠、大鼠、兔、狗、貓、牛、馬、豬、猴)使用安全。本發明的有效成分的給藥量或攝取量可以根據接受者、接受者的年齡和體重、症狀、給藥時間、劑型、給藥方法、藥劑的組合等決定。例如，將本發明的有效成分作為藥物口服給藥的場合，成人每1人可以按0.5-100mg/kg體重(優選1-50mg/kg體重)、非口服給藥的場合，按0.05-50mg/kg體重(優選0.5-50mg/kg體重)的範圍，1天1-3次分開給藥。與本發明的有效成分組合使用的具有其它作用機制的藥劑，也可以分別以臨床上所用的用量為基準而適當決定。此外，作為食品攝取的場合，可以按成人1人每天100-6000mg的範圍，優選200-3000mg範圍的攝取量，將本發明的有效成分與食品配合。
實施例以下舉出實施例對本發明作更詳細的說明，但本發明不限於這些實施例。
參考例由水溶性提取物精製異葎草酮、異近葎草酮、異副葎草酮，以及由忽布提取物精製葎草酮、副葎草酮的說明。由後述實施列2所述的水溶性提取物，採用分離用的HPLC(島津製作所LC-8泵，PDA聯動部分收集系統)精製異葎草酮、異近葎草酮、異副葎草酮。精製在以下條件下進行移動層85％甲醇、15％(1％蟻酸水)，柱YMC-ODS-AQ25×250mm，流速20ml/分。由實施例2所述的忽布提取物，在下述條件精製葎草酮、副葎草酮移動層67％甲醇、33％(1％蟻酸水)，柱YMC-ODS-AQ 25×250mm，流速20ml/分。用乙酸乙醋抽提分離得到的部分，進行減壓乾燥和重量的測定。
實施例1用C57BL/6小鼠(雌)評價脂質代謝改善效果。也就是說，使1組9-10隻年齡為5周的C657BL/6NCrj雌小鼠(日本チヤ一ルズリバ一公司)自由攝取CE2(日本クレア公司)和水，飼養1周。然後，施給高脂肪、高膽固醇的食物(按照Lipids 28，599-605 1993 Nishina等的方法製成的飼料)1周。飼料的組成如表1所述。
表1無鹽黃油 15％蔗糖 52.45％酪蛋白 20％玉米油 1％纖維素 5％礦物質 3.5％維生素 1％氯化膽鹼 0.25％胱氨酸 0.3％膽固醇 1％膽酸鈉 0.5％預飼養1周後，絕食1晚，用血細胞計數管從尾靜脈進行採血。得到血漿後，用膽固醇C-II裝置(和光純藥公司生產)、HDL膽固醇測試裝置(和光純藥公司生產)分別按照提供的說明書測定總膽固醇和HDL膽固醇，分成2組。使其中1組自由攝取上述高脂肪、高膽固醇食物中混合了0.5％(重量％)Kettle提取物(商品名Isomerizedkettle Extract(SS.Steiner公司生產)，是將球花的粉碎物用碳酸氣抽提、異構化的提取物，以異葎草酮為主要成分，但也含有蛇麻酮類)的飼料(但第一天施給只混入0.2％的飼料)(圖中的「Kettle」)。還有1組對照組，使其自由攝取混入0.5％(重量％)纖維素的飼料(圖中的「對照」)。每二天更換一次飼料，記錄攝食量。此外，在2周、4周和解剖時的採血，分別在絕食1晚後進行。只有在解剖時從腹部大動脈採血，2周、4周的採血從尾靜脈進行。除了總膽固醇、HDL膽固醇以外，還用甘油酯G測試裝置(和光純藥公司生產)按照提供的說明書測定血中中性脂肪。從總膽固醇中減去HDL膽固醇，將此值除以HDL膽固醇所得的值作為動脈硬化脂數。所得的結果分別如圖1-4所示。
由這些結果可知，Kettle提取物施食2周、和4周後，HDL膽固醇特異地上升，結果，使動脈硬化指數減小。此外，血中中性脂肪沒有顯著性差別，但顯示出因Kett1e提取物而引起的減少趨向(圖4)。解剖時，每公斤體重的腎臟周圍脂肪重量如圖5所示。雖然己有報導，人體腎臟周圍脂肪與內臟脂肪相當，本結果明確了腎臟周圍脂肪因使用Kettle提取物而有顯著性減少。此外，未觀察到2組間的攝食量有大的差別，但看到體重有顯著性差別，顯然，由於使用了Kettle提取物，所以觀察到體重上升的抑制效果(圖6和7)。
另外，解剖時取出肝臟，測定肝臟總膽固醇、中性脂肪、磷脂含量。解剖後，肝臟立即在液氮下冷凍，然後取一部分破碎後，在9倍重量的生理鹽水中，用Teflon(註冊商標)勻漿器在冰冷下破碎。隨後，按照Timothy P.Carr等，Clinical Biochemistry 26，39-42，1993中所述的方法，提取脂質。亦即，1ml的肝臟破碎液中，加入5ml的氯仿-甲醇(2∶1)，激烈攪拌後，再加入0.5ml的0.06N H2SO4，再攪拌後，離心、抽提出氯仿相。將氯仿相的一部分在氮氣下乾燥後，用磷脂質測定裝置(過錳酸鹽灰化法)(和光純藥公司生產)測定磷脂質(圖8)。還有其餘氯仿相的一部分中，摻入含1％Tween-X100的氯仿後，在氮氣下乾燥，懸浮於水後，用上述的方法測定總膽固醇、中性脂肪酸。其結果分別示於圖9和圖10中。結果表明，使用Kettle提取物，肝臟的膽固醇、中性脂肪有顯著性減少，磷脂質有顯著性的上升。
另外，使用日立7170型血漿自動分析裝置(日立製作所公司生產)，按照提供的說明書，測定作為肝臟障礙指標的酶GOT(穀草轉氨酶)、GPT(谷丙轉氨酶)、ALP(鹼性磷酸酶)時，在Kettle提取物給藥組中，每種酶的數值都減少，確認其對肝臟不產生障礙。
由以上結果可知，在施給高脂肪、高膽固醇食物的模型中，異葎草酮類和蛇麻酮類為主要成分的異構化忽布提取物具有增加血中HDL膽固醇的作用，降低動脈硬化指數的作用，抑制中性脂肪和膽固醇在肝臟中積累的作用的改善脂質代謝的效果、抑制脂肪積累的效果、抑制由於攝取高脂肪、高膽固醇食物而增加體重的效果。
實施例2用C57BL/6小鼠，在施給實施例1的高脂肪·高膽固醇食物2周內的條件下，採用0.2％、0.5％Kettle提取物(實施例1中所述)的混合飼料，評價其容量變化效果，以及評價忽布提取物(商品名CO2 PureResin Extract(Hopsteiner公司生產)，由忽布球花提取出葎草酮類和蛇麻酮類後的提取物)、水溶性提取物(商品名ISOHOPCO2N(English Hop Products公司生產)，由忽布球花抽提出草酮類後，異構化為異葎草酮類並鉀鹽化的產物，基本上不含葎草酮類和蛇麻酮類)的效果。還設定自由涉取AIN76A(Dyets公司)的通常食物組。亦即，使1組9-10隻年齡為5周的C57BL/6NCrj雌小鼠自由攝取CE2和水，飼養1周。然後，施給高脂肪、高膽固醇的食物(按實施例1中所述的方法製成的飼料)1周。本實施例中，在飼料中加入水，使其固形化，製成小球狀保存在冷凍庫中備用。此外，每天更換新的飼料，記錄攝食量。預飼養1周後，絕食1晚，用血細胞計數管從尾靜脈進行採血，按實施例1的方法進行總膽固醇、HIDL-膽固醇的定量後，均勻地分成各組。然後，將按重量比為0.2％、0.5％的2組Kettle提取物(K0.2、K0.5)，0.2％忽布提取物(H0.2)，1％水溶性提取物(W0.1)分別按重量比混入高脂肪、高膽固醇的食物中，製成混合飼料讓小鼠自由攝取。另外，在對照的飼料中添加0.5％纖維素。1周後，由尾靜脈在非絕食條件下進行採血。2周後，在絕食條件下，由腹部靜脈進行採血。
總膽固醇、HDL膽固醇、動脈硬化的結果分別示於圖11-圖13。
由結果可知，HDL依賴於Kettle提取物(K0.2、K0.5)的容量上升，使動脈硬化指數改善。而且證實了未異構化的忽布提取物也有改善脂質代謝的效果。此外，對150μl對照和施給水溶性提取物(W1.0)的小鼠的血漿進行凝膠過濾層析，其結果如圖14所示。層析方法按照Y.C.HA等的方法(Journal of Chromatography，341(1985)154-159)進行。亦即，用Suoerose 6B(Amersham Pharmacia)，在移動相為0.15M NaCl、0.01％EDTANa2、0.02％ NaN3、pH7.2，P-500泵(Amersham Pharmacia)、流速0.33m1/的條件下進行。級分按每5ml進行收集。對各級分進行總膽固醇的測定。
由該結果可知，按照本方法，用水溶性提取物，也只有在15ml以後的洗脫HDL部分才特異升高。此外，每隻小鼠1天的攝食量變化和體重變化分別如圖15、圖16所示。除了水溶性提取物(W1.0)以外，雖然各組的攝食量無變化，但與AIN76A組、對照組比較，Kettle提取物(K0.2，K0.5)、水溶性提取物(W1.0)、和忽布提取物給藥組(H0.2)的體重有顯著性減少。
由以上的結果可知，除以異葎草酮類和蛇麻酮類為主要成分的異構化忽布提取物以外，以異葎草酮類為主要成分的水溶性提取物，以及以葎草酮類和蛇麻酮類為主要成分的忽布提取物都具有增加血中HDL膽固醇的作用，降低動脈硬化指數作用等改善脂質代謝的效果、抑制體重增加的效果。
實施例3用C57BL/6小鼠(雄)對脂質代謝改善的效果進行評價。亦即，使1組5-6隻年齡為5周的C57BL/6NCrj雄小鼠(購自日本チヤ一ルズリバ一公司)自由攝取CE2和水，自由攝取飼養1周。然後，先製備在AIN76A(Dyets公司)中添加0.2％膽固醇的飼料，使其中一組自由攝取在該同樣的飼料中添加1％的水溶性提取物(實施例2)的飼料(圖中的「W1.0」)；還有一組使其自由攝取在該同樣的飼料中添加0.2％Kettle提取物(實施例1)的飼料(圖中「K0.2」)；使對照組自由攝取按實施例2的方法製成的添加0.5％纖維的飼料。每天每隻小鼠的攝食量和體重推移分別示於圖17和圖18。水溶性提取物(W1.0)與對照組比較，攝食量雖然有上升的傾向，但體重在解剖的前一天有顯著性的減少。1周後，在絕食1晚後，由腹部靜脈進行全血採血，按照實施例1的方法測定總膽固醇和HDL膽固醇。結果看到，用水溶性提取物(W1.0)時，HDL膽固醇特異地上升，動脈硬化指數顯著性地減少(圖19-21)。此外，按實施例1的方法定量測定每1g肝臟的膽固醇量、中性脂肪量、磷脂量，由此可知，用水溶性提取物(W1.0)時，膽固醇量、中性脂肪量顯著性地減少；還有，用Kettle提取物(K0.2)時，膽固醇量、中性脂肪量有減少(圖22-24)。此外，解剖時每1kg體重的腎臟周圍脂肪重量，在用水溶性提取物(W1.0)、Kettle提取物(K0.2)時，有顯著性減少，以及，副精巢周圍脂肪重量有減少傾向(圖25)。
由以上結果可知，在施給添加了低濃度膽固醇的飼料的模型中，以異葎草酮類和蛇麻酮類為主要成分的異構化忽布提取物，和以異葎草酮類為主要成分的水溶性提取物，都具有優良的增加血中HDL膽固醇的作用，降低動脈硬化指數作用，抑制中性脂肪和膽固醇在肝臟中積累的作用等改善脂質代謝的效果、和抑制內臟脂肪積累的效果、抑制體重增加的效果。
實施例4用C57BL/6小鼠(雌)評價脂質代謝的改善效果。也就是說，使1組5-6隻年齡為5周的C57BL/6NCrj雄小鼠(日本チヤ一ルズリバ一公司)自由攝取CE2(日本クレア公司)和水，飼養1周。然後，設定分別施給下述飼料的4個組AIN76A(實施例2中所述)中添加0.2％膽固醇和0.3％纖維素的飼料；AIN76A中添加0.2％膽固醇和0.1％水溶性提取物的飼料；AIN76A中添加0.3％纖維素的飼料；AIN76A中添加0.1％水溶性提取物的飼料。飼料的製作方法和給食方法按實施例2所述。1周後，在非絕食條件下進行解剖，從腹部靜脈進行全血採血，按實施例1的方法測定總膽固醇、HDL膽固醇。雖然沒有顯著性的差別，但證實了添加水溶性提取物的HDL膽固醇上升，以及伴隨著該HDL膽固醇上升的動脈硬化指數的減少(圖26-28)。此外，在測定每1g肝臟的膽固醇量、中性脂肪量、磷脂量後，可看到使用水溶性提取物時，在不添加膽固醇的條件下，膽固醇的顯著性減少；在添加膽固醇的條件下，膽固醇含量和中性脂肪酸含量顯著性減少(圖29-31)。
根據以上結果，對於非添加膽固醇的飼料，也看到以異葎草酮類為主要成分的水溶性提取物具有優良的增加血中HDL膽固醇的作用、降低動脈硬化指數作用、抑制中性脂肪和膽固醇在肝臟中積累的作用等改善脂質代謝的效果。
實施例5實施例4中，將肝臟在解剖後立即用液氮冷凍保存。由約100mg肝臟組織，用Isogen(ニツボンヅ一ン公司生產)，按照提供的說明書，提取RNA。用分光光度計測定RNA的量後，用Thermo Script TMRT-PCR系統(ライフテツクオリエンタル公司生產)，按照提供的說明書所述，與寡聚dT退火，進行該RNA的反轉錄，得到cDNA。用所得的cDNA，對於乙醯輔酶A氧化酶(ACO)，5′-ATCTATGACCAGGTTCAGTCGGGG-3′(序列號1)用作有義引物，5′-CCACGCCACTTCCTTGCTCTTC-3′(序列號2)用作反義引物；對於乙醯輔酶A合成酶(ACS)5′-GGAACTACAGGCAACCCCAAAG-3′(序列號3)用作有義引物，5′-CTTGAGGTCGTCCATAAGCAGC-3′(序列號4)用作反義引物；對於脂肪酸轉運蛋白(FATP)，5′-TGCTAGTGATGGACGAGCTGG-3′(序列號5)用作有義引物，5′-TCCTGGTACATTGAGTTAGGGTCC-3′(序列號6)用作反義引物；對於3-羥基-3-甲基戊二醯輔酶A合成酶(HMGCS)5′-CCTTCAGGGGTCTAAAGCTGGAAG-3′(序列號7)用作有義引物，5′-CAGCCAATTCTTGGGCAGAGTG-3′(序列號8)用作反義引物；對於3-羥基-3-甲基戊二醯輔酶A還原酶酶(HMGCR)5′-TTGGCCTCCATTGAGATCCG-3′(序列號9)用作有義引物，5′-GATCTTGTTGTTGCCGGTGAAC-3′(序列號10)用作反義引物；對於低密度脂蛋白受體(LDLR)，5′-CATCAAGGAGTGCAAGACCAACG-3′(序列號11)用作有義引物，5′-CACTTGTAGCTGCCTTCCAGGTTC-3′(序列號12)用作反義引物；對於Apo-AI5′-TGTATGTGGATGCGGTCAAAGAC-3′(序列號13)用作有義引物，5′-TCATCTCCTGTCTCACCCAATCTG-3′(序列號14)用作反義引物；對於Apo-CIII，5′-AGGGCTACATGGAACAAGCCTC-3′(序列號15)用作有義引物，5′-CGACTCAATAGCTGGAGTTGGTTG-3′(序列號16)用作反義引物；對於脂蛋白脂肪酶(LPL)，5′-GTTTGGCTCCAGAGTTTGACCG-3′(序列號17)用作有義引物，5′-CATACATTCCCGTTACCGTCCATC-3′(序列號18)用作反義引物；對於膽固醇α-7-羥化酶(CYP7A1)，5′-ACGGGTTGATTCCATACCTGGG-3′(序列號19)用作有義引物，5′-TGTGTCCAAATGCCTTCGCAG-3′(序列號20)用作反義引物，分別進行測定。使用酸性核糖體磷蛋白PO(酸性核糖體蛋白質36B4)基因作為內部標準基因。對於36B4，5′-CCAAGCAGATGCAGCAGATCC-3′(序列號21)用作有義引物，5′-CAGCAGCTGGCACCTTATTGG-3′(序列號22)用作反義引物。
用LightCycler(Roche公司生產)和FastStart DNA Master SYBRGreenI(Roche公司生產)反應試劑盒，按照提供的說明書，根據cDNA，對各個mRNA進行定量。在添加膽固醇條件下，以添加水溶性提取物時對內部標準的表達量作為1，各基因的表達結果如圖32所示。所進行的2元配置分散分析確定了關於ACO、ACS、FATP、Apo-AI、Apo-CIII、LPL與水溶性提取物的相關關係。已有報導，通過施給PPARα的配體フエノフイブレ一ト，這些基因也表現出同樣的表達變化(最新分子動脈硬化學森崎信尋等，メデイカルビユ一公司，J.Clin.Invest.1996.972408-2416，Laurence Berthou等)。
以上的結果啟示，通過異葎草酮類的攝取而改善脂質的作用是由肝β氧化系統的亢進引起的，可以認為，這些基因表達的變化可能是通過異葎草酮類的PPARα激動劑作用產生的。
實施例6用KKAY小鼠(雄)評價胰島素抗性改善的效果。亦即，使1組8-9隻年齡為5周的KKAY/Ta Jcl(日本クレア公司)自由攝取CE-2(日本クレア公司)和水，進行1周的馴化飼養。然後更換用精製原料製成的AIN93(按美國國立營養研究所的標準組成)粉末飼料飼養。作為實驗組設定為對照組(AIN93)、AIN93中加入0.1％和0.6％(重量％)Kettle提取物的組(K0.1、K0.6組)、添加0.05％(重量％)ピオグリタゾン(商品名アクトス，武田公司生產)粉末的組(Pio組)、添加1.2％(重量％)水溶性提取物的組(W組)。水溶性提取物混合飼料是將提取物稀釋水加入粉末飼料中，成形後使用。對照組、K0.1組、K0.6組、Pio組、每天施給5g粉末飼料。該量為每個個體的1天食量。可以按照本給飼料的方法使各組的攝飼量固定。對於W組，採用自由攝取的條件。每周測定飲水量。飼養開始後第2周和第4周進行約15小時的絕食，然後從尾靜脈採血，測定血中的中性脂肪和游離脂肪酸濃度。中性脂肪用リビドスリ試劑盒(東洋紡公司生產)測定、游離脂肪酸用NEFA C-測定裝置(和光純藥公司生產)測定。
第4周採血時，還進行絕食時的血糖值的測定。在飼養的第5周，施給對照組、K0.1組、K0.6組、Pio組、W組10g的飼料1次，次日從尾靜脈採血，測定非絕食時的血糖值。血糖值用葡萄糖檢測傳感器(三和化學研究所公司生產)進行測定。在飼養的第6周，施給對照組、K0.1組、K0.6組、Pio組、W組10g的飼料，在非絕食的條件下進行解剖，收集副精巢周圍脂肪組織，以及從腹部大動脈進行全採血。再測定解剖時血液中的中性脂肪和游離脂肪酸濃度。用ISOGEN(ニツポンジ一ン公司生產)由副精巢周圍脂肪製備總RNA。用製得的總RNA通過RT-PCR法測定抵抗素基因的表達量。反轉錄反應用ThermoscriptRT-PCR系統(Gibco BRL公司生產)進行，定量PCR採用LightCycler(Roche公司)和LightCycler-FastStart DNA Master SYBR GreenI(Roche公司生產)進行。使用的引物為5′-CGTGGGACATTCGTGAAGAAAAAG-3′(序列號23)5′-TGTGCTTGTGTGTGGATTCGC-3′(序列號24)抵抗素的表達量按照使用下述酸性核糖體蛋白質36B4的引物時的測定值進行標準化5′-CCAAGCAGATGCAGCAGATCC-3′(序列號25)5′-CAGCAGCTGGCACCTTATTGG-3′(序列號26)飼養期間中每1天的飲水量如圖33所示。已知，胰島素抗性引起高血糖發病的KKAY小鼠的飲水量變多，抗性改善的小鼠飲水量變少(Biosci.Biotech.Biochem.，60(2)，204-208，1996，Kakuda等)，而K0.6組和W組都和施給糖尿病改善藥的Pio組同樣，其飲水量的減少得到了證實。第5周非絕食時和第4周絕食時的血糖值示於圖34和圖35。K0.6組和W組與Pio組同樣，在非絕食時、絕食時的血糖值都比對照組顯著性地降低。飼養第2周、第4周的絕食時和第6周(解剖時)非絕食時的血中游離脂肪酸濃度和血中中性脂肪濃度分別示於圖36和37。在K0.1、K0.6、W各組中，這些血中脂質濃度與對照組的相比，也有顯著性的降低。如圖38所示，在K0.1組、K0.6組、W組中，抵抗素基因的表達量也比對照組有顯著性的降低。
以上圖33-38所示的結果表明，使用異葎草酮類和蛇麻酮類為主要成分的異構化忽布提取物，和異葎草酮類為主要成分的水溶性忽布提取物，減輕了所有KKAY小鼠的胰島素抗性，證實了這些提取物明顯的改善胰島素抗性的作用。
實施例7將年齡為5周的KKAY小鼠馴化飼養1周(實施例6中所述)後，分別設定6隻1組的施給標準飼料(實施例6中所述)的對照組，和施給0.6％Kettl提取物混合飼料(實施例6中所述)的K0.6組，在自由攝取飼料和水的條件下，飼養12周。在第12周進行5小時的絕食，按照以下的要點進行耐糖能力試驗。亦即，用實施例6同樣的方法測定在施給葡萄糖前時0分鐘的血糖值。然後，按每1kg體重2g的葡萄糖施給量，用經口探測器將20％(w/v)葡萄糖水溶液施給每個個體，15分、30分、60分、120分後分別測定血糖值。耐糖能力試驗1周後，按以下的要點進行胰島素感受性試驗。亦即，對於胰島素施給前非絕食條件下的小鼠的0分鐘時的血糖值，在用生理鹽水將採取的血液稀釋2倍後，與耐糖能力試驗同樣地進行測定。隨後按每1kg體重0.75U的胰島素施給量，將生理鹽水製備的75mU/ml豬胰島素溶液施入腹腔內。在施給後的15分、30分、60分、120分、180分，分別測定血糖值。
如圖39所示，證實了K0.6組與對照組相比，其耐糖能力有改善。
進一步如圖40所示，與表現出嚴重的胰島素抗性的對照組相比，觀察到K0.6組抗性改善的傾向。由以上的結果可知，異葎草酮類和蛇麻酮類為主要成分的異構化忽布提取物具有改善胰島素抗性的作用。
實施例8已知C57BL/6攝入高脂肪食物後，呈現出肥胖和高血糖的結果(Ikemoto等，Metabolism，45(12)，1539-46，1996)。因此，針對忽布提取物對飼料引起的胰島素抗性表達的作用進行了研究。亦即，使1組8隻年齡為5周的C57BL/6NCrj(日本チヤ一ルズリバ一公司)自由攝取CE-2(日本クレア公司)和水，馴化飼養1周。然後更換為用精製原料製成的高脂肪飼料(表2)飼養。
表2 高脂肪飼料組成(數值為重量％)紅花油 33.5酪蛋白 29.0蔗糖 23.3混合維生素(オリエンタル酵母公司生產) 1.45混合礦物質(オリエンタル酵母公司生產) 5.08纖維素粉 7.25L-胱氨酸 0.44設定高脂肪食物飼料組、和高脂肪食物中0.3％(重量％)Kettle提取物添加組(K組)、0.6％(重量％)水溶性提取物添加組(W組)。
飼養期間，自由攝取飼料和飲料水，每天更換新的飼料。飼養開始後，每周測定體重。如圖41所示，K組、W組與對照組相比，其體重增加緩慢。此外，飼養開始後第60天之後，測定每1天的攝食量(6次)，結果如圖42所示，備組的攝食量間未見顯著性的差別。由以上結果證實，忽布提取物具有抑制高脂肪飲食引起的肥胖的作用。繼續在飼養開始後的第84天，對照組和W組的2組中，各選4個個體進行耐糖能力試驗。試驗按實施例7所述的方法進行。耐糖能力試驗的結果如圖43所示，W組的最高血糖值、120分鐘後的血糖值都比對照組低。
由以上結果證實，以異葎草酮類為主要成分的水溶性忽布提取物對耐糖能力的惡化還有改善的作用。
實施例9PPARγ激動劑篩選系統的構建和活性的評價結果。
為了構建人PPARγ表達質粒，由人心臟cDNA庫(human heart cDNAlibrary，Gibco公司生產)克隆PPARγ的閱讀框(ORF)。確定克隆的ORF序列後，連接於表達載體pCI neo(Promega公司生產)的NheI-SalI位點。克隆所用引物的序列如下5′-GCTAGCATGGTGGACACGGAAAGCCC-3′(序列號27)5′-GTCGACAGTACATGTCCCTGTAGATCTC-3′(序列號28)其次，為了構建報告質粒，製備PPRE重複3次的寡聚DNA，將其插入螢火蟲螢光素酶報告基因載體pGL3-啟動子載體(Promega公司生產)的KpnI-BglII位點後，確定其序列。含PPRE的寡聚DNA的序列如下5′-CAGGGGACCAGGACAAAGGTCACGTTCGGGAAGGGGACCAGGACAAAGGTCACGT-3′(序列號29)5′-GATCTTCCCGAACGTGACCTTTGTCCTGGTCCCCTTCCCGAACGTGACCTTTGTC-3′(序列號30)將上述質粒與修正用的海草(ウミシイタケ)螢光素酶報告基因載體pRL-SV40載體(Promega公司生產)一起，用脂質轉染胺試劑(Lipofect AMINE，Gibco公司生產)共轉染CV-1細胞。採用的CV-1細胞在轉染的前一天以5×104個細胞/ml的濃度，在加入2ml含有10％胎牛血清(Gibco公司生產)、青黴素、鏈黴素(各10000單位，1mg/ml，Gibco公司生產)的DMEM(Gibco公司生產)的12孔平板上，37℃、5％CO2的條件下進行培養。轉染後，將陽性對照在含有1μM ピオグリタゾン(武田公司生產)的上述DMEM培養基上進行培養。培養48小時後，回收細胞，用雙-螢光素酶報告基因測定系統(Promega公司生產)，製備裂解液，用發光計(Luminous CT-9000D，DIA-IATRON公司)測定螢火蟲螢光素酶、海蕈螢光素酶的活性。螢火蟲螢光素酶活性與海蕈螢光素酶活性的比值作為相對螢光素酶活性。
用上述的測定系統，對一系列的葎草酮化合物(葎草酮、副葎草酮、異葎草酮、異副葎草酮、異近葎草酮)的PPARγ/RXRαa活化作用進行了研究。分別研究了1、5、10、50μM的濃度，結果，證實了所有葎草酮化合物都有活性，大致上，在10μM時，該活性相當於1μM的ピオグリタゾン(圖44)。進一步看到，四氫異律草酮也有同樣的活性(圖45)。
實施例10由融合蛋白構成的PPARγ激動劑篩選系統的構建和活性的評價結果。
為了構建人PPARγ表達質粒，由人心臟cDNA庫(human heart cDNAlibrary，Gibco公司生產)克隆PPARγ的配體結合區(LBD；204a.a.-505a.a.)。確定克隆的ORF序列後，連接於表達載體pBind(Promega公司生產)的BamHI-KpnI位點，構建表達PPARγ和酵母Gal4蛋白質的融合蛋白的載體pGR-Gal4-PPARγ。克隆所用引物的序列如下5′-GGATCCTTTCTCATAATGCCATCAGGTTTG-3′(序列號31)5′-GGTACCTTCCGTGACAATCTGTCTGAG-3′(序列號32)然後，在pBind的Gal4區的N末端一側，將人糖皮質素報告基因(GR)的N末端序列(1a.a.-76a.a.)與Gal4讀碼一致地連接。GR由心臟eDNA庫(Gibco公司生產)通過PCR克隆。克隆所用的引物序列如下5′-GCTAGCATGGACTCCAAAGAATCATTAAC-3′(序列號33)5′-TGGCTGCTGCGCATTGCTTA-3′(序列號34)作為報告基因質粒，使用在啟動子區與Gal4結合的一側導入了5個拷貝螢火蟲螢光素酶的表達載體pG5luc(Promega公司生產)。將pGR-Gal4-PPARγ和pG5luc用脂質轉染胺試劑(Lipofect AMINE，Gibco公司生產)轉染CV-1細胞。轉染後，將檢測體或對照轉移至添加ピオグリタゾン的培養基(DMEM，Gibco公司生產)上，培養48小時後回收細胞。細胞回收後用雙-螢光素酶報告基因測定系統(Promega公司生產)，製備細胞溶解液，用發光計(Luminous CT-9000D，DIA-IATRON公司)測定螢火蟲螢光素酶的活性。此外，細胞溶解液的蛋白質濃度通過Dc Protein assay(BIO-RED)測定，按照蛋白質的濃度，將螢火蟲螢光素酶活性的值標準化。以陰性對照的值作為1，將結果用相對值表示。
使用上述測定系統，對Kettle提取物和一系列的葎草酮化合物(葎草酮、副葎草酮、異葎草酮、異副葎草酮)的PPARγ活化作用進行了研究。對濃度為0.05、0.5、5μg/ml的Kettl提取物和濃度分別為1、3、10μM的葎草酮化合物進行研究的結果，與實施例9同樣，證實了進行試驗的全部試樣都有活性(圖46)。
實施例11PPARα激動劑篩選系統的構建和活性的評價結果。
除以下所述的方面之外，對PPARα也和PPARγ的場合同樣地構建篩選系統。克隆所用的引如如下5′-GGATCCTTTCACACAACGCGATTCGTTTTG-3′(序列號35)5′-GGTACCGTACATGTCCCTGTAGATCTC-3′(序列號36)
轉染也和PPARγ的系統同樣地進行，但PPARα的場合，對照使用Wy14,643(和光純藥公司生產)。
使用上述測定系統，對濃度為50、100、500μg/ml的水溶性提取物進行了研究，結果，確定了50、100μg/ml時的水溶性提取物的PPARα活化能力(圖47)。
實施例12與食品的配合例650g砂糖中加入300g麥芽糖，150℃下加熱融解，冷卻至120℃後，加入10g檸檬酸，然後加入30g實施例2所述的水溶性提取物、10g香料，經攪拌、均勻化後，使其成形、冷卻而得到糖果。
實施例13用C57BL/6小鼠(雌)評價經分級後的含有順式-異葎草酮、反式-異葎草酮、順式-異近葎草酮、反式-異近葎草酮、順式-異副葎草酮、和反式-異副葎草酮部分的脂質改善效果。亦即，由水溶性提取物(實施例2所述)，對該水溶性提取物含有的由順式-異葎草酮、反式-異葎草酮、順式-異近葎草酮、反式-異近葎草酮、順式-異副葎草酮、和反式-異副葎草酮構成的部分(以下稱為「精製異葎草酮類部分」)進行分級。將該水溶性提取物用鹽酸中和後，冷凍乾燥，取3.5g的冷凍乾燥物用矽膠層析(3.5×33cm)法進行分級。用己烷∶醋酸乙酯(2∶1)平衡柱、洗脫。按每份20ml分部收集洗脫液，進行分離，用HPLC確定其純度(分析條件在參考例中描述)。收集第24-第60級分的部分，在蔽光條件下，通過用旋轉式汽化器濃縮乾燥，得到1g由順式-異葎草酮、反式-異葎草酮、順式-異近葎草酮、反式-異近葎草酮、順式-異副葎草酮、和反式-異副葎草酮構成的精製異葎草酮類部分。根據HPLC層析的面積比，該部分的組成比為異副葎草酮(順式+反式)∶異葎草酮(順式+反式)∶異近葎草酮(順式+反式)＝50.2∶27.1∶22.7。使一組8隻年齡為5周的C57BL/6NCrj雌(日本チヤ一ルズリバ一公司)自由攝取CE-2(日本クレア公司)和水，飼養1周。然後設定施給以下飼料的3組AIN76A(實施例2中所述)中添加0.2％膽固醇和0.3％纖維素的飼料(以下稱為「C」組)、AIN76A中添加0.2％膽固醇和1％水溶性提取物的飼料(以下稱為「W」組)、AIN76A中添加0.2％膽固醇和0.3％上述精製的異葎草酮類部分的飼料(以下稱為「IH」組；本飼料中含有的異葎草酮類的含量與W組的飼料中所含的異葎草酮類的含量基本上相等)。飼料的製作方法及施給方法按實施例2所述。另外說明，本實驗中進行個別飼養、每天施給3.5g的飼料，還通過使用篩子，測定吃剩下的飼料量，減去此值後計算攝食量，1周後在非絕食下進行解剖，從腹部靜脈進行全採血，中性脂肪的測定按實施例1的方法進行(圖48)。IH組和W組的血中中性脂肪量都有顯著性降低。此外，測定了每1g肝臟的膽固醇含量、中性脂肪含量、磷脂質含量(圖49-51)，證實了IH組、W組的膽固醇含量都有顯著性降低，而且中性脂肪含量都有減少的傾向。另外，體重推移、還有攝取每卡熱最的體重增加量分別示於圖52和圖53中。W組方面，表示出體重顯著性地降低，以及IH組表示出攝取每卡熱量的體重增加顯著性地減少。由以上的實施例可知，精製的異葎草酮類部分具有改善脂質代謝效果、降低血漿的中性脂肪的效果、防止膽固醇在肝臟中積累的效果、以及抑制體重增加的效果。
實施例14用C57BL/6小鼠(雌)評價分級的蛇麻酮的脂質代謝改善效果。亦即，由忽布小球(CAS小球，捷克，ザ一ス生產)精製蛇麻酮。將約2.5g的忽布小球用4升醋酸乙酯抽提3次，進行減壓濃縮後得到深綠色的提取物(329.17g)。取該提取物中的262.7g用矽膠柱進行分級。用苯-醋酸乙酯混合液分階洗脫柱，得到15個級分。對第3個級分(41.8g)用矽膠柱再進行分級，將己烷-醋酸乙酯(20∶1)溶液洗脫的級分進行重結晶，得到蛇麻酮(1.88g，白色針狀結晶，收率約0.094％)。另外，使一組8隻年齡為5周的C57BL/6NCrj雌(日本チヤ一ルズリバ一公司)自由攝取CB-2(日本クレア公司)和水，飼養1周。然後設定施給以下飼料的2組AIN76A(實施例2中所述)中添加0.2％膽固醇和0.3％纖維素的飼料(以下稱為「C」組)、AIN76A中添加0.2％膽固醇和0.3％蛇麻酮的飼料(以下稱為「L」組)。飼料的製作方法及施給方法按實施例2所述。試驗飼料施給1周後在非絕食下進行解剖，測定了每1g肝臟的膽固醇含量、中性脂肪含量、磷脂質含量(圖54-56)，證實了L組的膽固醇含量有顯著性的降低。另外，體重推移、還有攝取每卡熱量的體重增加量分別示於圖57和圖58中。L組方面，表示出體重顯著性降低、以及攝取每卡熱量的體重增加顯著性減少。由以上的實施例可知，蛇麻酮具有改善脂質代謝效果、防止膽固醇在肝臟中積累的效果、以及抑制體重增加的效果。
實施例15使C57BL/6攝取實施例8所示的高脂肪食物12周，對引起胰島素抗性的小鼠，使其連續10天口服水溶性提取物(100、330mg/kg/天)。
給藥結束後，進行16小時絕食後的耐糖能力試驗(OGTT)。另外，對同樣引起胰島素抗性的小鼠，使其連續10天口服(10、30mg/kg/天)按參考例所述方法製備的異葎草酮精製品(順式和反式的混合物)。給藥分別結束後，進行16小時絕食後的耐糖能力試驗(OGTT)。OGTT是在採血和血糖值測定後，按1g/kg的量施給葡萄糖水溶液，在15、30、60分進行採血和血糖值的測定，120分進行血糖值的測定。用胰島素測定試劑盒(森永生科學研究所)測定血中胰島素的時間進程。
水溶性提取物施給組的血糖值和胰島素濃度的變化如圖59和60所示。在水溶性提取物施給組(圖中表示為「W組」)中，可看到耐糖能力、胰島素抗性的改善。精製的異葎草酮施給組(圖中表示為「IH組」)的血糖值和胰島素濃度的變化示於圖61和62。精製的異葎草酮給藥組與水溶性提取物給藥組同樣，也觀察到耐糖能力的改善。進一步還觀察到胰島素濃度在葡萄糖施給前也有顯著性降低，施給後的濃度也有降低的傾向，所以表明了胰島素抗性的改善。由以上結果證實，通過10天的短期施給忽布提取物，改善了高脂肪食物負荷小鼠的胰島素抗性，而且認為其作用也與異葎草酮精製品相同。
實施例16購入18隻雄性年齡為8周的ApoE基因敲除小鼠(來自Jackson實驗室)，按各組9隻分成水溶性提取物組(實施例2所述)(W)、和對照組(C)，在攝取實施例1中表1所述的高脂肪、高膽固醇食物的條件下飼養10周。10周後，在乙醚麻醉下，通過從腹部脫血屠殺。取得肝臟、脂肪等臟器後，立即用液氮將肝快速冷凍。此外，連心臟一起將大動脈摘出。將此大動脈的胸部大動脈和腹部大動脈展開，直接用10％甲醛液進行固定，然後進行油紅O染色。弓形大動脈、大動脈瓣在10％甲醛液中浸漬固定後，呈圓筒形狀包埋在石蠟中，切薄後，進行蘇木精伊紅和Elastica Van gieson染色。用微量計測用的平板測量裝置VM-30(Olympus光學)對油紅O染色的胸部大動脈和腹部大動脈的粥樣硬化病灶面積、血管總面積、EVG染色的弓狀大動脈和大動脈瓣的斷面內膜面積、以及斷面總面積進行分析。由計算的結果算出胸部大動脈、腹部大動脈各自的粥樣硬化病變面積率(＝油紅O深染色的面積÷血管總面積×100)、弓狀大動脈、大動脈瓣各自的內膜肥厚度(＝內膜面積÷中膜面積，更詳細為＝內膜斷面積÷(內膜-中膜斷面積-內膜斷面積))。血漿中的高半胱氨酸量用高半胱氨酸測定試劑盒(ユニチカ公司)按照提供的說明書進行測定。肝臟中性脂肪按實施例1的方法進行測定。
結果，觀察到胸部大動脈粥樣硬化灶面積(圖63)、腹部大動脈粥樣硬化灶面積(圖64)、弓形大動脈內膜肥厚度(圖65)、大動脈瓣內膜肥厚度(圖66)都因食用了水溶性提取物(W)而減少。同時，觀察到，在W組中，解剖時的體重(圖67)、和腹腔內的脂肪重量(圖68)有顯著性的降低，而且觀察到肝臟的中性脂肪含量減少(圖69)。還表明了血漿中高半胱氨酸的量因水溶性提取物而減少(圖70)。
由以上結果可知，以異葎草酮類為主要成分的水溶性提取物(W)具有優良的抗動脈硬化作用的效果、改善脂質代謝的效果、抑制體重增加的效果、抑制內臟脂肪積累的效果。
實施例17評價忽布提取物和水溶性提取物對大腸黏膜的影響。用Fischer344大鼠(雄)的大腸黏膜的PGE2產生量作為指標。具體是使4周齡的Fischer344雄性大鼠(日本チヤ一ルズリバ一公司)自由攝取AIN-76A(實施例3所述)和水，飼養3天，使其馴化。然後，選年齡為5周的大鼠，每組4隻，共分成3組，開始施給試驗的食物。亦即，1組為AIN-76A組(C)、2組為AIN-76A中添加了1％忽布提取物(實施例2所述)的組(H)、3組為AIN-76A中添加了水溶性提取物(實施例2所述)的組(W)。1周後進行解剖，摘取出大腸，在生理鹽水中將腸的內容物洗淨後，縱向切開。用載玻片(マツナミ)刮取該大腸的黏膜組織，懸浮於500μlPBS中。用勻漿器將該黏膜組織破碎，在10000g下離心5分鐘，上清液供PGE2測定之用。PGE2測定使用前列腺素E2酶聯免疫測定系統(Amersham Pharmacia Biotech公司，產品代號RPN222)，按其操作步驟進行定量。
由此結果，證實了1％忽布提取物混合飼料施給組(H)的PGE2產生量顯著性地增加，但未觀察到1％水溶性提取物混合飼料施給組(W)的PGE2產生量有顯著性增加(圖71)。此外，1％忽布提取物混合飼料施給組(H)中，看到有盲腸肥大和下痢的症狀。
由以上所述可知，在高濃度攝取的場合，施給以葎草酮類為主要成分的忽布提取物時所觀察到的炎症，在施給以異葎草酮類為主要成分的水溶性提取物的場合未觀察到。
序列表110Kirin啤酒股份公司120改善脂代謝的組合物和食品130140875PX140
141
15036798/20021512002-02-14150139700/20021512002-05-1516036170PatentIn Ver.2.1210121124212DNA213人工合成序列220
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223人工合成序列的描述PCR引物40036ggtaccgtac atgtccctgt agatctc 2權利要求
1.用於治療、預防或改善通過PPAR的活化而能夠治療、預防或改善的疾病或症狀的藥物組合物，其含有下述式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)或式(V)的化合物或它們的藥用鹽或溶劑化物、或者忽布提取物和/或異構化忽布提取物作為有效成分， 上述式中，R1和R2代表C1-6的烷基或C2-6的鏈烯基；R3和R4代表羥基、C1-6的烷基或C2-6的鏈烯基，但R3和R4不同時代表羥基； 上述式中，R5、R6、和R7代表氫原子、C1-6的烷基或C2-6的鏈烯基；R8和R9代表氫原子、羥基、C1-6的烷基、C2-6的鏈烯基、-C(＝O)R10、或-CH(-OH)R10，R10代表C1-6的烷基或C2-6的鏈烯基，但R8和R9不同時代表羥基； 上述式中，R11和R12代表氫原子、C1-6的烷基、或C2-6的鏈烯基；R13和R14代表羥基、C1-6的烷基、C2-6的鏈烯基、-C(＝O)R15、或-CH(-OH)R15，R15代表C1-6的烷基或C2-6的鏈烯基，但R13和R14不同時代表羥基； 上述式中，R16、R17和R18代表氫原子、C1-6的烷基、或C2-6的鏈烯基； 上述式中，R19代表C1-6的烷基或C2-6的鏈烯基。
2.根據權利要求1所述的藥物組合物，其中通過PPAR的活化而能夠治療、預防或改善的疾病或症狀是糖尿病、糖尿病併發症、脂質代謝異常、高血脂症、胰島素抗性或其相關疾病、肥胖症或體重增加。
3.用於胰島素抗性的改善、脂質代謝的改善、體重增加的抑制或瘦身的組合物，該組合物含有權利要求1所述的化合物或它們的藥用鹽或溶劑化物、或者忽布提取物和/或異構化忽布提取物作為有效成分。
4.用於PPAR活化的組合物，該組合物含有權利要求1所述的化合物或它們的藥用鹽或溶劑化物、或者忽布提取物和/或異構化忽布提取物作為有效成分。
5.以食品的形式提供的權利要求1-4的任何一項所述的組合物。
6.用於胰島素抗性的改善、脂質代謝的改善、體重增加的抑制或瘦身的食品，該食品含有權利要求1所述的化合物或它們的藥用鹽或溶劑化物、或者忽布提取物和/或異構化忽布提取物作為有效成分。
7.根據權利要求6所述的食品，該食品為健康食品、功能性食品、特定保健用食品、或病人用食品。
8.根據權利要求6或7所述的食品，該食品以飲料的形式提供。
9.權利要求1所述的化合物或它們的藥用鹽或溶劑化物、或者忽布提取物和/或異構化忽布提取物在製造用於治療、預防或改善通過PPAR的活化而能夠治療、預防或改善的疾病或症狀的藥物中的使用。
10.根據權利要求9所述的使用，其中通過PPAR的活化而能夠治療、預防或改善的疾病或症狀是糖尿病、糖尿病併發症、脂質代謝異常、高血脂症、胰島素抗性或其相關疾病、肥胖症、或體重增加。
11.權利要求1所述的化合物或它們的藥用鹽或溶劑化物、或者忽布提取物和/或異構化忽布提取物在製造用於胰島素抗性的改善、脂質代謝的改善、體重增加的抑制或瘦身的組合物中的使用。
12.權利要求1所述的化合物或它們的藥用鹽或溶劑化物、或者忽布提取物和/或異構化忽布提取物在製造用於PPAR活化的組合物中的使用。
13.治療、預防或改善通過PPAR的活化而能夠治療、預防或改善的疾病或症狀的方法，該方法包括將治療有效量的權利要求1所述的化合物或它們的藥用鹽或溶劑化物、或者忽布提取物和/或異構化忽布提取物施給哺乳類。
14.根據權利要求13所述的方法，其中通過PPAR的活化而能夠治療、預防或改善的疾病或症狀是糖尿病、糖尿病併發症、脂質代謝異常、高血脂症、胰島素抗性或其相關疾病、肥胖症、或體重增加。
15.胰島素抗性的改善、脂質代謝的改善、體重增加的抑制或瘦身的方法，該方法包括將治療有效量的權利要求1所述的化合物或它們的藥用鹽或溶劑化物、或者忽布提取物和/或異構化忽布提取物施給哺乳類。
16.PPAR活化的方法，該方法包括將治療有效量的權利要求1所述的化合物或它們的藥用鹽或溶劑化物、或者忽布提取物和/或異構化忽布提取物施給哺乳類。
17.權利要求13、15、或16所述的方法，其中的有效成分以食品的形式施給。
全文摘要
本發明的目的是提供用於治療、預防或改善通過PPAR的活化而能夠治療、預防或改善的疾病或症狀，特別是胰島素抗性糖尿病和高血脂症的組合物和食品。根據本發明，可提供含有葎草酮類、異葎草酮類或蛇麻酮類、或它們的藥用鹽或溶劑化物的用於治療、預防或改善通過PPAR的活化而能夠治療、預防或改善的疾病或症狀的藥物組合物。
文檔編號A61P3/06GK1870983SQ03808389
公開日2006年11月29日 申請日期2003年2月14日 優先權日2002年2月14日
發明者矢島宏昭, 三浦裕, 藤原大介, 小田井英陽, 近藤惠二, 野沢元 申請人:麒麟麥酒株式會社