香雪蘭UDP-葡萄糖類黃酮-3-0-葡萄糖基轉移酶的cDNA的製作方法
2023-05-29 14:01:16
專利名稱：香雪蘭UDP-葡萄糖類黃酮-3-0-葡萄糖基轉移酶的cDNA的製作方法
技術領域：
本發明屬於植物分子生物學領域，具體涉及從紅花香雪蘭花瓣中克隆分離 編碼UDP-葡萄糖類黃酮-3-0-葡糖基轉移酶(UF3GT)的cDNA。
背景技術：
在植物花色形成過程中，UDP-葡萄糖類黃酮-3-O-葡糖基轉移酶(UF3GT)能將花色素催 化生成花色苷，糖基化通常發生在該物質的0 (OH-和COOH-)、 N、 S、 C原子上，通常是 在糖基轉移酶的作用下，以核酸活化的糖分子作為^^體底物進行的。最常見的受體是羥基 化的分子，而UDP-葡萄糖是最常見的供體分子。花色素結合糖苷對花色素的穩定性及在液 泡中的溶解性起著至關重要的作用，糖基化作用使花的最大吸收光譜向紫外線端移動而呈 現藍色。
到目前為止，人們已經克隆得到許多與植物次生代謝產物相關的UF3GT基因，如在玉 米(N. V. Fedoroff et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 119 (1988) 185-197)，金魚草(C. Martinet al. Plant J. 1 (1991) 37 - 49)，龍膽(Y. Tanaka et al. Plant Cell Physiol. 37 (1996) 711-716)，紫蘇(Z. Gongetal. Plant Mo 1. Biol. 35 (1997) 915 - 927)，葡萄(C.M. Ford etal. J. Biol. Chem. 273 (1998) 9224 - 9233)，矮牽牛(M. Yamazaki et al. Plant Mol. Biol. 48 (2002) 401 - 411)等。
對巳有的糖基轉移酶胺基酸序列和根據cDNA推測出的糖基轉移酶的胺基酸序列的比較 分析,編碼區具有2個保守的區域 一個是編碼44個胺基酸的糖基轉移酶所特有的特徵性區 域(Lim E.K. ， Bowles D.J. EMB0 J (2004) 23: 2915 - 2922)，它被認為是UDP-葡萄糖的 結合區域，在這個區域胺基酸序列與其它已知的糖基轉移酶基因有43% 78%的相似性；另 一個保守的區域位於糖基轉移酶基因的上遊附龍，它們的相似性在30°/。 45%。但是，這類酶 不同成員及在不同植物種類中的蛋白質一級結構序列的相似性很低，所以至今尚未見用糖 基轉移酶基因保守區合成簡併引物獲得糖基轉移酶基因的報導。
本發明克隆所得到的FhGTl基因能編碼與植物次生代謝過程相關的UF3GT，具體說該基
4因是植物花色形成過程中的結構基因之一，能將UDP-葡萄糖上的葡萄糖轉移到花色素分子 的C3羥基上生產花色苷，保持花色素分子結構穩定，同時是花色素分子運輸到液泡必不可少 的因素，與花色合成密切相關。 '
發明內容
本發明首次從紅花香雪蘭中克隆得到UDP-葡萄糖類黃酮-3-0-葡糖基轉移酶(UF3GT) 的新cDNA，並確定了它的核苷酸序列和由此得出的胺基酸序列。另外，FhGTl基因在大腸杆 菌細胞中成功的表達了所述的UF3GT蛋白，並且發現表達的重組蛋白，在體外酶活實驗中可 以將花色素催化生成花色苷。
所以，本發明的目的是提供編碼UDP-葡萄糖類黃酮-3-0-葡糖基轉移酶(UF3GT)的新 cDNA和由此推斷的胺基酸序列。
為了從香雪蘭中克隆得到FhGTl基因，本發明首先利用RT-PCR的方法在擬南芥中製備相 關的探針，使用ECL發光試劑盒對實驗室已建立的紅花香雪蘭花瓣的cDNA文庫進行篩庫，分 離得到919bp的cDNA片段，測序得到該片段的核苷酸序列。分析該序列顯示此片段與Iris hollandica的UDP-葡萄糖類黃酮-3-0-葡糖基轉移酶(UF3GT)同源性最高，達到63%。另夕卜， 序列分析顯示該片段包含ATG起始密碼子。利用RACE法克隆該基因的3'端序列，得到833bp 的片段，測序得到該片段的核苷酸序列。分析該序列顯示此片段與Iris hollandica的UDP-葡萄糖類黃酮-3-0-葡糖基轉移酶(UF3GT)同源性最高，達到64%。另外，序列分析顯示該 片段包含TGA終止密碼子。提取紅花香雪蘭花瓣總RNA作為模板，進行RT-PCR，克隆得到 1383bp的全長FhGTl基因，開放閱讀框架長1338bp，其編碼的蛋白序列長446個胺基酸，蛋 白質的分子量推測是48， 043Da，等電點為5.71。
在pET-28(a+)原核表達載體中插入克隆得到的的FhGTl基因，並且轉入到大腸桿菌 BL21(DE3)細胞中，表達重組UF3GT蛋白。
進行香雪蘭UF3GT蛋白的體外酶活反應，高效液相(HPLC)檢測反應產物，結果顯示反 應產物中有花色苷的生成，說明原核表達製備的UF3GT蛋白有糖基轉移酶的活性，證明克隆 得到的基因是UDP-葡萄糖類黃酮-3-0-葡萄糖基轉移酶基因。
香雪蘭UDP-葡萄糖類黃酮-3-0-葡萄糖基轉移酶cDNA的特徵如下 其中l: FhGTl基因5'端的核苷酸序列(SEQ ID NO. 1)CGTCAGTTTCGGCACTCTAGCAGCCCTCACCGAAGCCGAGCTCGTCGAGCTGGCATCCGGC
FhGTl基因5，端核苷酸序列長為919bp。 其中2: RACE法獲得FhGTl基因的3'端序列(SEQ ID NO. 2)
AAATTCTTCTTGAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATCGATGTCGACTCGAGTC
FhGTl基因3'端核苷酸序列長為833bp。 其中3: FhGTl基因的全長核苷酸序列(SEQ ID NO. 3)GACATTGTAATTGCACGTTGAGGTTCAGCTAGTGTTCGGAATATGACTGAAGTCTGA
克隆得到FhGTl基因全長為1383bp，開放閱讀框架長1338bp，下劃線表示的是該序列的 起始密碼子和終止密碼子。
其中4:由FhGTl基因核苷酸序列推測得到的蛋白質序列(SEQ ID N0， 4)
RANVAE細KKVVVGEEGRKMRERAAAIREMAAGSVRPGGSSVQNFKALLDIVIAR-
FhGTl基因編碼的蛋白序列長446個胺基酸，蛋白質的分子量推測是48， 043Da，等電點 為5.71。
圖l為FhGTl基因的全長RT-PCR電泳圖； 圖2為FhGTl基因原核表達載體構建的分子鑑定電泳其中M: DL 2000; 1:重組質粒酶切；2:重組質粒PCR擴增；3:重組質粒
圖3為HPLC檢測結果圖，其中體外酶活反應，在保留時間17min時檢測到花色苷的生成;圖4為HPLC檢測結果圖，其中陰性對照反應，反應無花色苷生成。
具體實施例方式
在下面的具體實施例中進一步說明本發明，但並不限制本發明的範圍。 實施例l FhGTl基因全長的克隆
1、 探針的獲得根據擬南芥序列，設計特異的引物，即5'-CGA AGA CGG TGA AGA GGA C-3' (SEQ ID NO. 5)的上遊引物和5'-GGT GAC TGA AAC AAA GAG CC-3' (SEQ ID NO. 6) 的下遊引物。然後用Trizol試劑盒提取擬南芥的總RNA，反轉錄生成cDNA的第一條鏈，以此 作為模板進行RT-PCR，得到的PCR產物即為篩庫的探針。
2、 FhGTl基因5'序列的獲得利用ECL發光試劑盒和上述探針對紅花香雪蘭花瓣的cDNA 文庫進行篩庫，挑取曝光得到的陽性菌落進行測序，序列如SEQ ID NO. l所示。
3、 FhGTl基因3'序列的獲得根據上述測序得到的結果，設計特異的上遊引物，即 5'-AATCCCACCCTGAACC-3' (SEQ ID NO. 7);根據mRNA保守的polyA結構設計特異的下遊引 物5'-AAAAAAAAAAAAAAAAATCGATGTCGACTCGAGTC-3' (SEQ ID NO. 8)。用Trizol試劑盒提 取紅花香雪蘭花瓣的總RNA，反轉錄生成cDNA的第一條鏈，以此作為模板進行RACE，得到 FhGTl基因3，序列，結果如SEQ ID NO. 2所示。
4、 FhGTl基因全長序列的獲得根據上述兩次測序得到的結果，設計特異的引物，即 5'-CAG CAA GCA ATG GGA TCG-3' (SEQ ID NO. 9)的上遊引物和5'-CAG ACT TCA GTC ATA TTC CGA-3' (SEQ ID NO. 10)的下遊引物。用Trizol試劑盒提取紅花香雪蘭花瓣的總RNA， 反轉錄生成cDNA的第一條鏈，以此作為模板進行RT-PCR，電泳結果如圖l所示，得到FhGTl 基因全長序列，結果如SEQ ID NO. 3所示。
實施例2 FhGTl基因在大腸桿菌細胞中的表達
為了表達FhGTl蛋白，利用克隆得到的全長FhGTl基因作為模板，分別帶有EcoR I和Hind III酶切位點的引物進行FhGTl基因開放閱讀框的PCR擴增。其中上遊引物5'-CTCGAATTC CAG CAA GCA ATG GGA TCG-3， (SEQ ID NO. 11);下遊引物5， -CGG AAG CTT CAG ACT TCA GTC ATA TTC CGA-3' (SEQ ID NO. 12)。
分別利用EcoR I和Hind III兩種限制性內切酶消化上述擴增得到的DNA片段，並將其克 隆進入質粒pET-28(a+)，這樣構建的重組質粒命名為pET-28a-FhGTl，構建後利用酶切及PCR 鑑定，結果如圖2所示。然後導入大腸桿菌BL21(DE3)細胞中，培養所述的轉化體表達FhGTl
8蛋白，將獲得的包涵體用6M尿素裂解，後緩慢透析得到重組的FhGTl蛋白
實施例3 FhGTl蛋白的體外酶活檢測
體外酶活反應體系 (250 ul)
0. 1M磷酸鉀緩衝液(pH7.0) : 100ul 10mM DTT : 25 u 1
10mM矢車菊花色素(cyanidin) : 10 u 1 lOmM UDP-Glu: 25 w 1
10%甘油 25 u 1
UFGT蛋白 65 ul
反應條件30°C， 30min，反應結束後14， 000rpra離心2min，所得上清液用O. 22 u m過 濾後，進行HPLC檢測。
HPLC檢測檢測使用C18 column (規格250X4.6mm);檢測條件35°C， 270咖；洗 脫條件前20min線性洗脫溶液A(10。/。乙酸+0. 1%磷酸)100-60%，溶液B(50。/。乙腈)0—40%; 後20min等度洗脫溶液A: 60%，溶液B: 40%，檢測結果如圖3所示。檢測結果表明體外 酶活檢實驗，產物中有花色苷的生成，說明原核表達製備的UFGT蛋白有活性，初步證明我 們分離的基因是尿苷二磷酸葡萄糖類黃酮-3-O-葡萄糖基轉移酶基因。
權利要求
1、香雪蘭UDP-葡萄糖類黃酮-3-O-葡萄糖基轉移酶的cDNA，其特徵如下其中1FhGT1基因5』端的核苷酸序列為TCATACTCTTGTTTCTTGCTTGTATTTGATTGATCATCAGCAACAGCAAGCAATGGGATCGGCCGATCGCTCCCACGTGGCACTCCTGGCCTTCCCCTTCGGGACCCACGCCGCCCCTCTCCTCTCCCTCGGCCTCAACCTCGCCTCCTCGGCACCCCACGGCACCACTTTCTCCTTTCTTAGCAACCGCCGTCCCGTCTCCTTGCCACCCAATTCCGCCATCAAGTTCTACGAGATCGCGGACGGCTCCGACCCCGAACACGAGGGACACGTGCACCCCGAAGAGGAGGTGAGGGTGTTCATGGAGGAGACGCCCGGGAACTACAAGAAGGCGCTGGAGGCCGCGGTTGATAGGTGCGGGGGGCAGCGTGTCACGTGCATCGTGGCGGACGCGTTCCTCTGGTTCGTTGGGGACATCGCGGCGGAGTTCGGTGTCCATTGGGTCCCACTCTGGACTGGCGGGCCGTGCAGCTTCCTCGCCCACCTCTACACCGACATGCTGAGGAACAAGATAGGTACAGGGAAGGAAGCTGATCCAGATGAGGACCTCCAATTCCTCCCTGGACTTTCCGGTTTCCGTGTACGCGACCTCCCCGACGACATTGTCACCGGAGACCTCACCGGTGCCTTCGCCAGTCTCCTCCACCGCATGTCAATCGAGATTCCCCGCTCCGCTGCCGCCATTGCCATCAACACCTTCGAGGGCCTCCATCCGGACATCGACGCCGACCTCGCCTCCAAGTTCAAGAAGTCACTCCCAATTGGCCCACTCAACCTCCTCAATCCCACCCTGAACCAACCGGACAAGTTCTCTTGCCTAGCCTGGCTGGACAAGTTCGAACCGCATTCGGTCGCCTACGTCAGTTTCGGCACTCTAGCAGCCCTCACCGAAGCCGAGCTCGTCGAGCTGGCATCCGGCFhGT1基因5』端核苷酸序列長為919bp；其中2RACE法獲得FhGT1基因的3』端序列為AATCCCACCCTGAACCAACCGGACAGGTTCTCTTGCCTAGCCTGGCTGGACAAGTTCGAACCGCATTCGGTCGCCTACGTCAGTTTCGGCACTCTAGCAGCCCTCACCGAAGCCGAGCTCGTCGAGCTGGCATCCGGCCTCGAGCAGAGTGGGGTCCCTTTCCTCTGGTCCCTCAAGGAACCGGGCCAACTGCCGGCCGGGTTCCTGGACCGGACCAAGGACCGGGGTCTCGTGGTCCCGTGGGTGCCGCAAGCCGAAGCATTGAAACATGTTGCGGTGGGCGCATCCTTGAGCCACTGCGGATGGAACTCCGTCATGGAGAGCGTAACGAGCGGCGTGCCGATGCTCTGCAGGCCGTTCCTCGGGGACCAGACAATGAATGCACGTGCCGTGTCGCATGTTTGGAAAGTCGGGGTGACGTTCGAGAATGGCACGATGACTAGGGCCAACGTGGCGGAGGCCATGAAGAAGGTGGTTGTCGGCGAAGAAGGGAGGAAGATGAGGGAGAGAGCGGCGGCGATTCGGGAAATGGCGGCCGGCTCGGTGCGACCGGGCGGAAGCTCGGTGCAAAACTTCAAGGCTCTCCTAGACATTGTAATTGCACGTTGAGGTTCAGCTAGTGTTCGGAATATGACTGAAGTCTGATTGTATTTGAGTGAGATGGAGTATTAGTATTGTGCCTATTAATTCCTTGTTATGTTTGAAGAAATGAATCTAGTAATAATATAATAAACTTCTTGCATTTCGTCCTCTCTTGCTTATTGTGAAAGAGAGACCTGCAAATTCTTCTTGAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATCGATGTCGACTCGAGTCFhGT1基因3』端核苷酸序列長為833bp；其中3FhGT1基因的全長核苷酸序列為CAGCAAGCAATGGGATCGGCCGATCGCTCCCACGTGGCACTCCTGGCCTTCCCCTTCGGGACCCACGCCGCCCCTCTCCTCTCCCTCGGCCTCAACCTCGCCTCCTCGGCACCCCACGGCACCACTTTCTCCTTTCTTAGCAACCGCCGTCCCGTCTCCTTGCCACCCAATTCCGCCATCAAGTTCTACGAGATCGCGGACGGCTCCGACCCCGAACACGAGGGACACGTGCACCCCGAAGAGGAGGTGAGGGTGTTCATGGAGGAGACTCCCGGGAACTACAAGAAGGCGCTGGAGGCCGCGGTTGATAGGTGCGGGGGGCGGCGTGTCACGTGCATCGTGGCGGACGCGTTCCTCTGGTTCGTTGGGGACATCGCGGCGGAGTTCGGTGTCCATTGGGTCCCACTCTGGACTGGCGGGCCGTGCAGCTTCCTCGCCCACCTCTACACCGACATGCTGAGGAACAAGATAGGTACAGGGAAGGAAGCTGATCCAGATGAGGACCTCCAATTCCTCCCTGGACTTTCCGGTTTCCGTGTACGCGACCTCCCCGACGACATTGTCACCGGAGACCTCACCGGTGCCTTCGCCAGTCTCCTCCACCGCGTGTCAATCGAGATTCCCCGCTCCGCTGCCGCCATTGCCATCAACACCTTCGAGGGCCTCCATCCGGACATCGACGCCGACCTCGCCTCCAAGTTCAAGAAGTCACTCCCAATTGGCCCACTCAACCTCCTCAATCCCACCCTGAACCAACCGGACAAGTCCTCTTGCCTAGCCTGGCTGGACAAGTTCGAACCGCATTCGGTCGCCTACGTCAGTTTCGGCACTCTAGCAGCCCTCACCGAAGCCGAGCTCGTCGAGCTGGCATCCGGCCTCGAGCAGAGTGGGGTCCCTTTCCTCTGGTCCCTCAAGGAACCGGGCCAACTGCCGGCCGGGTTCCTGGACCGGACCAAGGACCGGGGTCTCGTGGTCCCGTGGGTGCCGCAAGCCGAAGCATTGAAACATGTTGCGGTGGGCGCATTCTTGAGCCACTGCGGATGGAACTCTGTCATGGGGAGCGTAACGAGCGGTGTGCCGATGCTCTGCAGGCCGTTCCTCGGGGACCAGACGATGAATGCACGTGCCGTGTCGCATGTTTGGAAAGTCGGGGTGACGTTCGAGAATGGCACGATGACTAGGGCCAACGTGGCGGAGGCCATGAAGAAGGTGGTTGTCGGCGAAGAAGGGAGGAAGATGAGGGAGAGAGCGGCGGCGATTCGGGAAATGGCGGCCGGCTCGGTGCGACCGGGCGGAAGCTCGGTGCAAAACTTCAAGGCTCTCCTAGACATTGTAATTGCACGTTGAGGTTCAGCTAGTGTTCGGAATATGACTGAAGTCTGA克隆得到FhGT1基因全長為1383bp，開放閱讀框架長1338bp，下劃線表示的是該序列的起始密碼子和終止密碼子；其中4由FhGT1基因核苷酸序列推測得到的蛋白質序列為MGSADRSHVALLAFPFGTHAAPLLSLGLNLASSAPHGTTFSFLSNRRPVSLPPNSAIKFYEIADGSDPEHEGHVHPEEEVRVFMEETPGNYKKALEAAVDRCGGQRVTCIVADAFLWFVGDIAAEFGVHWVPLWTGGPCSFLAHLYTDMLRNKIGTGKEADPDEDLQFLPGLSGFRVRDLPDDIVTGDLTGAFASLLHRMSIEIPRSAAAIAINTFEGLHPDIDADLASKFKKSLPIGPLNLLNPTLNQPDRFSCLAWLDKFEPHSVAYVSFGTLAALTEAELVELASGLEQSGVPFLWSLKEPGQLPAGFLDRTKDRGLVVPWVPQAEALKHVAVGASLSHCGWNSVMESVTSGVPMLCRPFLGDQTMNARAVSHVWKVGVTFENGTMTRANVAEAMKKVVVGEEGRKMRERAAAIREMAAGSVRPGGSSVQNFKALLDIVIAR-FhGT1基因編碼的蛋白序列長446個胺基酸，蛋白質的分子量推測是48,043Da，等電點為5.71。
全文摘要
本發明屬於植物分子生物學領域，具體涉及從紅花香雪蘭花瓣中分離編碼UDP-葡萄糖類黃酮-3-O-葡糖基轉移酶(UF3GT)的cDNA。香雪蘭UF3GT基因(FhGT1)cDNA的核苷酸序列分析顯示克隆得到的FhGT1基因長1383bp，開放閱讀框架長1338bp，其編碼的蛋白序列長446個胺基酸，推測蛋白質的分子量是48,043Da，等電點為5.71。利用所述的FhGT1基因在大腸桿菌細胞中表達重組的UF3GT蛋白，該蛋白在體外酶活反應試驗中，能促使花色素與UDP-葡萄糖反應，催化生成花色苷。其在轉基因植物花卉的花色修飾方面具有應用價值。
文檔編號C12N15/54GK101659956SQ20091006736
公開日2010年3月3日 申請日期2009年7月29日 優先權日2009年7月29日
發明者楊 付, 麗 王, 昕 隋 申請人:東北師範大學