一種重組微生物穀氨醯胺轉氨酶基因及其製備方法

2023-05-29 08:17:21

專利名稱：一種重組微生物穀氨醯胺轉氨酶基因及其製備方法
技術領域：
本發明屬於食品工業生物技術領域。
背景技術：
穀氨醯胺轉胺酶(Transglutaminase.E.C.2.3.2.13)，是一種催化蛋白質分子間或分子內形成ε-(γ-穀氨醯基)賴氨酸共價鍵的酶，通過催化反應，可引起各種蛋白質分子內的交聯、分子間的交聯、蛋白質與胺基酸之間的連接以及蛋白質分子內穀氨醯胺基的水解，被譽為生物體內『天然的粘合劑』，在化妝品、皮革製品、紡織品工業，尤其是在食品加工領域有著廣泛的用途。目前已從多種生物材料(包括動植物及微生物)中獲得了穀氨醯胺轉胺酶，微生物來源的穀氨醯胺轉胺酶，因其生產不受季節和原料限制，是穀氨醯胺轉胺酶家族中最有可能進行大規模生產應用的一種，儘管有多種微生物自然狀態下能產穀氨醯胺轉胺酶，但大多數的產酶量不高；而通過常規誘變育種技術進行育種，耗時費力，又很難篩選到產穀氨醯胺轉胺酶高產菌株，這就造成了實際生產成本較高，限制了該酶的大規模工業化生產。

發明內容
本發明需要解決的問題是運用分子生物學技術和基因工程技術，將微生物穀氨醯胺轉氨酶基因克隆至大腸桿菌，然後通過誘導基因高效率表達穀氨醯胺轉氨酶，從而提高該酶的產量和降低該酶的生產成本。本發明的技術方案為1.本發明首先提供一種獲得微生物穀氨醯胺轉氨酶基因克隆的方法提取鏈黴菌屬茂原鏈黴菌基因組DNA後，通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增出穀氨醯胺轉氨酶全長基因。2.提供一種生產穀氨醯胺轉氨酶原核表達系統構建的方法主要是利用含6-His標籤的原核表達載體pQE30-xa和大腸桿菌JM109進行穀氨醯胺轉氨酶基因的融合表達。3.提供重組穀氨醯胺轉氨酶分離純化的方法，主要是利用Ni-NTA柱親和層析的方法獲得高純度的穀氨醯胺轉氨酶。
本發明有益效果是重組後的穀氨醯胺轉氨酶酶活性達到2.2U/ml，高於原始菌株2-3倍，且利用大腸桿菌搖瓶發酵生產該酶的工藝流程少，原料簡單且價格低廉。而在一些對酶純度要求不高的行業，諸如皮革製品、紡織品工業、飼料加工等行業，也可直接使用未經純化的粗酶，這將大大降低這些行業的生產成本。譬如若利用未經純化的重組谷胺醯胺轉胺酶對酪蛋白進行改性研究發現，粗酶也可很好的交聯酪蛋白，使之溶液粘度增加，乳化能力提高，發泡性下降另外，通過重組的谷胺醯胺轉胺酶粘和小體型蝦，獲得了體積增大且經煎煮後也不易分離的重疊蝦，大輻度提高了小體型蝦的商品價值。總之，通過這一方法生產的重組谷胺醯胺轉胺酶同非重組谷胺醯胺轉胺酶一樣可以廣泛應用於化妝品行業、食品加工業等領域中。
四

圖1 穀氨醯胺轉氨酶基因的PCR擴增圖2 用於生產重組穀氨醯胺轉氨酶的表達載體pQE30xa-TGase圖3 不同誘導培養時間下穀氨醯胺轉氨酶在大腸桿菌中的表達A標準蛋白質分子量；B誘導培養12h；C誘導培養10h；D誘導培養8h；E誘導培養6h；F誘導培養4h；G誘導培養2h；H pQE30xa空白載體。
圖4 親和層析純化後的重組谷胺醯胺轉胺酶五具體實施方式
1.微生物穀氨醯胺轉氨酶基因的分離克隆從茂原鏈黴菌(Streptomycesmobaraensis)提取基因組DNA為模板，具體DNA提取方法參照Promega說明書，根據相關穀氨醯胺轉氨酶基因序列合成引物，用上下遊引物TGP1(5』CGGGATCCATG CGC ATA CGC CGG AGA 3』)，TGP2(5』CG AAGCTT GCC AGC CCT GCT TTA CCTTG 3』)並在其5』端分別加入BamHI和HindIII酶切位點和相應的保護鹼基，進行穀氨醯胺轉氨酶基因全長的擴增，PCR擴增條件95℃預變性5min，94℃1min，55℃45s，72℃90s，35個循環，最後72℃延伸7min。製備1.2％TBE瓊脂糖凝膠，取PCR擴增產物5uL與6×凝膠電泳上樣緩衝液1uL混勻後電泳，電壓5V/cm，電泳完畢後，在凝膠成像分析系統中觀察結果並拍照，結果見附圖1。利用DNA凝膠純化試劑盒純化回收1.2Kb的PCR產物，與克隆pUC-mT載體(上海博亞生物科技有限公司)進行連接。10ul連接反應體系為pUC-mT載體50ng，PCR產物50ng，1x連接緩衝液2μl，T4DNA連接酶3weiss，4℃連接過夜。連接產物轉化感受態JM109細胞，並在在含有x-gal、IPTG及Amp的LB平板上進行重組子的篩選。挑選白色菌落，抽提質粒DNA後，一部分進行酶切和PCR鑑定，將重組質粒命名為pUC-mT-TGase；另外一部分送博亞公司進行目的片段序列的雙向測定，測序最終結果如下序列atgcgcatac gccggagagc tctcgtcttc gccactatga 40gtgcggtgtt atgcaccgcc ggattcatgc cgtcggccag 80gcgaggccgc cgccgacaat ggcgcggggg aaagagacga 120agtcctacgc cgaaacctac cgcctcacgg cggatgacgt 160cgcgaacatc aacgcgctca acgaaagcgc tccggccgct 200tcgagcgccg gcccgtcgtt ccgggccccc gactccgacg 240acagggtcac ccctcccgcc gagccgctcg acaggatgcc 280cgacccgtac cgtccctcgt acggcagggc cgagacggtc 320gtcaacaact acatacgcaa gtggcagcag gtctacagcc 360accgcgacgg caggaagcag cagatgaccg aggagcagcg 400ggagtggctg tcctacggct gcgtcggtgt cacctgggtc 440aattcgggtc agtacccgac gaacagactg gccttcgcgt 480ccttcgacga ggacaggttc aagaacgagc tgaagaacgg 520caggccccgg tccggcgaga cgcgggcgga gttcgagggc 560
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2.原核表達系統pQE30xa-TGase構建首先用BamHI和HindIII分別消化重組質粒(pUC-mT-TGase)和表達載體pQE30xa(Qiagen公司)，分別純化回收後，T4DNA連接酶連接得到重組表達載體pQE30xa-TGase，見圖2。轉化受體菌JM109後，挑白色菌落，按照常規方法小量製備質粒DNA，利用酶切方法鑑定出陽性克隆。
3.重組穀氨醯胺轉氨酶的提取將重組工程菌接種到LB液體培養基(含Amp，100mg/L)中，37℃培養過夜，按照1∶1000轉接到新鮮LB液體培養基中(含Amp 100mg/L)，37℃振蕩培養3-6h後，加1mol/L異丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)至終濃度0.1mmol/L，誘導培養10h～12h後，見附圖3，離心收集菌體，將獲得菌體用5mmol/L磷酸鹽緩衝液(PBS)(pH6.5)洗一次，再溶於1/10體積的PBS中，加1mmol/L蛋白酶抑制劑苯甲基磺醯氟(PMSF)至終濃度為1mmol/L，超聲波破碎(40％功率，破碎10min)。然後，10000r/min，4℃離心10min，上清液CM-纖維素層析後，進一步應用6xHis標籤和Ni-NTA樹脂純化後，其純度達90％以上。經過SDS-PAGE結果證明電泳的條帶為一條，分子量45KD左右，且表達量較高，見附圖4。穀氨醯胺轉氨酶的酶活測定方法參照Folk提出的hydroxylamine比色法進行，即1個穀氨醯胺轉氨酶酶活單位定義為pH6.0，37℃時，每分鐘催化底物生成1mol CBZ-Glu(Gly)γ-單氧肟酸產物所需的酶量。重組後的穀氨醯胺轉氨酶酶活性達到2.2U/ml，高於原始菌株2-3倍，且利用大腸桿菌搖瓶發酵生產該酶的工藝流程少，原料簡單且價格低廉。而在一些對酶純度要求不高的行業，諸如皮革製品、紡織品工業、飼料加工等行業，也可直接使用未經純化的粗酶，這將大大降低這些行業的生產成本。譬如若利用未經純化的重組谷胺醯胺轉胺酶對酪蛋白進行改性研究發現，粗酶也可很好的交聯酪蛋白，使之溶液粘度增加，乳化能力提高，發泡性下降；另外，通過重組的谷胺醯胺轉胺酶粘和小體型蝦，獲得了體積增大且經煎煮後也不易分離的重疊蝦，大輻度提高了小體型蝦的商品價值。總之，通過這一方法生產的重組谷胺醯胺轉胺酶同非重組谷胺醯胺轉胺酶一樣可以廣泛應用於化妝品行業、食品加工業等領域中。
重組微生物穀氨醯胺轉氨酶基因序列表重組微生物穀氨醯胺轉氨酶基因序列表110南京大學120重組微生物穀氨醯胺轉氨酶基因160121012111246bp212DNA213人工序列4001atgcgcatac gccggagagc tctcgtcttc gccactatga gtgcggtgtt atgcaccgcc 60ggattcatgc cgtcggccag gcgaggccgc cgccgacaat ggcgcggggg aaagagacga 120agtcctacgc cgaaacctac cgcctcacgg cggatgacgt cgcgaacatc aacgcgctca 180acgaaagcgc tccggccgct tcgagcgccg gcccgtcgtt ccgggccccc gactccgacg 240acagggtcac ccctcccgcc gagccgctcg acaggatgcc cgacccgtac cgtccctcgt 300acggcagggc cgagacggtc gtcaacaact acatacgcaa gtggcagcag gtctacagcc 360accgcgacgg caggaagcag cagatgaccg aggagcagcg ggagtggctg tcctacggct 420gcgtcggtgt cacctgggtc aattcgggtc agtacccgac gaacagactg gccttcgcgt 480ccttcgacga ggacaggttc aagaacgagc tgaagaacgg caggccccgg tccggcgaga 540cgcgggcgga gttcgagggc cgcgtcgcga aggagagctt cgacgaggag aagggcttcc 600agcgggcgcg tgaggtggcg tccgtcatga acagggccct ggagaacgcc cacgacgaga 660gcgcttacct cgacaacctc aagaaggaac tggcgaacgg caacgacgcc ctgcgcaacg 720aggacgcccg ttccccgttc tactcggcgc tgcggaacac gccgtccttc aaggagcgga 780acggaggcaa tcacgacccg tccaggatga aggccgtcat ctactcgaag cacttctgga 840gcggccagga ccggtcgagt tcggccgaca agaggaagta cggcgacccg gacgccttcc 900gctccgcccc gggcaccggt ctggtcgaca tgtcgaggga caggaacatt ccgcgcagcc 960ccaccagccc cggtgaggga ttcgtcaatt tcgactacgg ctggttcggc gcccagacgg 1020aagcggacgc cgacaagacc gtctggaccc acggaaatca ctatcacgcg cccaatggca 1080gcctggggtg ccatgcatgt ctcacgagag caagttccgc aactgggtcc gagggttact 1140cggacttcga ccgcggggag ccctatgtgg tatcaccctc tccatcccca agaatgctgg 1200aacaccgccc ccgacaaggt aaagcagggc tggcgtgatg tgagcg 124權利要求
1.一種重組微生物穀氨醯胺轉氨酶基因，長度1246，其特徵是1-180位的核苷酸為編碼穀氨醯胺轉氨酶基因前導肽的序列，該段序列與酶的跨膜運輸和正確摺疊有密切關係；420-422位的核苷酸為編碼酶活性中心cys的序列；穀氨醯胺轉氨酶全長基因序列為atgcgcatac gccggagagc tctcgtcttc gccactatga 40gtgcggtgtt atgcaccgcc ggattcatgc cgtcggccag 80gcgaggccgc cgccgacaat ggcgcggggg aaagagacga 120agtcctacgc cgaaacctac cgcctcacgg cggatgacgt 160cgcgaacatc aacgcgctca acgaaagcgc tccggccgct 200tcgagcgccg gcccgtcgtt ccgggccccc gactccgacg 240acagggtcac ccctcccgcc gagccgctcg acaggatgcc 280cgacccgtac cgtccctcgt acggcagggc cgagacggtc 320gtcaacaact acatacgcaa gtggcagcag gtctacagcc 360accgcgacgg caggaagcag cagatgaccg aggagcagcg 400ggagtggctg tcctacggct gcgtcggtgt cacctgggtc 440aattcgggtc agtacccgac gaacagactg gccttcgcgt 480ccttcgacga ggacaggttc aagaacgagc tgaagaacgg 520caggccccgg tccggcgaga cgcgggcgga gttcgagggc 560cgcgtcgcga aggagagctt cgacgaggag aagggcttcc 600agcgggcgcg tgaggtggcg tccgtcatga acagggccct 640ggagaacgcc cacgacgaga gcgcttacct cgacaacctc 680aagaaggaac tggcgaacgg caacgacgcc ctgcgcaacg 720aggacgcccg ttccccgttc tactcggcgc tgcggaacac 760gccgtccttc aaggagcgga acggaggcaa tcacgacccg 800tccaggatga aggccgtcat ctactcgaag cacttctgga 840gcggccagga ccggtcgagt tcggccgaca agaggaagta 880cggcgacccg gacgccttcc gctccgcccc gggcaccggt 920ctggtcgaca tgtcgaggga caggaacatt ccgcgcagcc 960ccaccagccc cggtgaggga ttcgtcaatt tcgactacgg 1000ctggttcggc gcccagacgg aagcggacgc cgacaagacc 1040gtctggaccc acggaaatca ctatcacgcg cccaatggca 1080gcctggggtg ccatgcatgt ctcacgagag caagttccgc 1120aactgggtcc gagggttact cggacttcga ccgcggggag 1160ccctatgtgg tatcaccctc tccatcccca agaatgctgg 1200aacaccgccc ccgacaaggt aaagcagggc tggcgtgatg 1240tgagcg 1246
2.根據權利要求1所述一種重組微生物穀氨醯胺轉氨酶的製備方法，其特徵是由以下步驟完成A微生物穀氨醯胺轉氨酶的分離和克隆；B穀氨醯胺轉氨酶基因原核表達載體構建；C穀氨醯胺轉氨酶在大腸桿菌中的表達。
3.根據權利要求2所述的生產重組微生物穀氨醯胺轉氨酶的方法，其特徵是獲取穀氨醯胺轉氨酶基因的具體步驟為(1)提取茂原鏈黴菌基因組DNA；(2)穀氨醯胺轉氨酶基因的PCR擴增；(3)PCR產物的回收純化；(4)穀氨醯胺轉氨酶基因的T/A克隆；(5)穀氨醯胺轉氨酶基因雙脫氧終止法雙向測序。
4.根據權利要求2所述的生產重組微生物穀氨醯胺轉氨酶的方法，其特徵是進行微生物穀氨醯胺轉氨酶基因在大腸桿菌中表達的具體步驟為(1)原核表達載體構建(2)重組穀氨醯胺轉氨酶的親和層析分離純化。
5.根據權利要求4所述的生產基因工程重組微生物穀氨醯胺轉氨酶表達載體構建方法，其特徵是將穀氨醯胺轉氨酶基因正向插入表達載體pQE30-xa標籤序列6-His之後，這樣便於後期融合蛋白的鑑定和分離純化。
6.根據權利要求4所述的生產重組微生物穀氨醯胺轉氨酶的純化方法，其特徵是異丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)誘導標的的終濃度為0.1mmol/L，誘導的時間為10h～12h小時後，收集菌體超聲破碎後，上清液先用CM-纖維素層析，再進一步利用6xHis標籤和Ni-NTA樹脂的特點，進行親和層析分離純化。
全文摘要
本發明屬於食品工業生物技術領域，主要是利用分子生物學和基因工程技術，將來自茂原鏈黴菌的穀氨醯胺轉氨酶基因克隆分離後，構建了含有該基因的重組原核表達載體pQE30xa－TGase，並在大腸桿菌JM109菌株中獲得了表達，表達產物經過親和層析分離純化後，可以得到純度為90％左右的重組穀氨醯胺轉氨酶，重組後的穀氨醯胺轉氨酶酶活性達到2.2U/ml，高於原始菌株2－3倍。利用該酶進行酪蛋白改性和重疊蝦的製作均取得良好效果。由於本發明利用大腸桿菌生產穀氨醯胺轉氨酶，操作簡單，產酶活性較高，生產成本低，表達的酶易於分離純化，可為今後穀氨醯胺轉氨酶的生產提供一條切實可行的途徑。
文檔編號C12N15/09GK1796561SQ20041006580
公開日2006年7月5日 申請日期2004年12月20日 優先權日2004年12月20日
發明者田興軍, 張智俊, 李亞玲 申請人:南京大學