動物TorqueTeno病毒環介導等溫擴增技術快速檢測試劑盒及檢測方法
2023-05-29 12:06:31 1
專利名稱:動物Torque Teno病毒環介導等溫擴增技術快速檢測試劑盒及檢測方法
技術領域：
本發明涉及動物TTV試劑盒，屬於動物疫病分子生物學檢測方法及檢測試劑領域，具體是一種用於動物TTV病毒的環介導等溫擴增技術(LAMP)檢測試劑盒。本發明還應用所述的試劑盒對動物TTV病毒進行等溫擴增檢測的生物學檢測方法。
背景技術：
TTV( Torque Teno virus)病毒是一種無囊膜的單鏈環狀球形DNA病毒,現歸類為圓環病毒科(Circoviridae)指環病毒屬(Anellovirus),包括兩種不同的血清型，即TTVl和TTV2。該病毒最早是1997年由日本學者Nishizawa等從I例輸血後非甲 非庚型肝炎病人血清中分離到的新型肝炎病毒，而以該病人的姓名縮寫(TT)而命名。又因TTV與輸血傳播病毒(transfusion transmitted virus, TTV)巧合，因此許多學者亦將其稱為輸血傳播病毒。我國於1998年6月，由中國軍事醫學科學院首次分離出中國株TTV。同年，湖南醫科大學附二院傳染科學者克隆出TTV部分基因序列。TTV在各類人群中感染比例都非常高，研究報導，在亞洲、非洲和南美洲的正常獻血者中感染率為30 % 100 %。除了人可感染TTV以外，現已經證實TTV感染宿主很廣，包括靈長類動物(黑猩猩、類人猿和猴)、家畜(豬、牛、羊、犬、貓、雞)和其它動物(老鼠、樹駒和駱駝)。目前，還沒有證實TTV可以引發某種具體的疾病，但許多學者認為TTV可能與人類肝炎和豬多系統衰竭症候群(PWMS)、豬繁殖與呼吸症候群(PRRSV)等疾病病原存在協同作用。有相關的研究顯示:TTV在豬繁殖和呼吸系統症候群、結核、人類肝炎等疾病中陽性檢出率相當高。因此，TTV在動物群中傳播對人類的生活和健康存在一定的潛在威脅。同時豬肉等肉制食品在人們的日常食用中非常普遍，攜帶該病毒的肉製品對人的健康存在威脅，因而該病毒的檢測在出入境和食品安全檢驗中起著重要的作用。
TTV在豬群中的感染呈世界性分布。全世界範圍內的感染分布很廣泛，但不同國家的感染率卻有較大的差異，感染率分布在24% 100%之間。同時，相同國家的不同城市不同豬場TTV的感染率也有很大差異。例如:對我國廣東等7省的258份豬血樣的檢測結果表明:TTV感染率在24.1% 100%之間。相關研究還表明:TTV的不同血清型可發生混合感染。目前的流行病學研究表明TTV在人群中主要經血液及其血液製品傳播。研究發現，唾液、糞便、膽汁、精液、乳汁、活組織甚至毛髮、皮膚中均能檢測到該病毒。且較多文獻報導，TTV除經血液途徑傳播外，還可經母嬰途徑、性交途徑、糞-口途徑傳播，飛沫及經胃腸道傳播。同時，相關的研究也表明，TTV還可通過胎盤和子宮垂直傳播。TTV在豬中的傳播方式可能有以下幾種:①通過口糞途徑傳播；②注射了被TTV汙染的疫苗或者是注射是的交叉感染；③垂直感染。
由於該病毒首先在人群中發現，因此，現有的研究主要針對人的TTV較多。主要的檢測方法有普通PCR法、巢式PCR法、螢光定量PCR法、原位雜交、酶聯免疫吸附法等。如1997年，日本學者Nishizawa等(1997)根據N22基因序列首次建立巢式PCR(nested PCR)用於檢測TTV。何忠平等(2003)運用Mullins等在HIV基因變異分型中建立的異源雙鏈泳動分析法(HMA)快速檢測TTV基因型。Catherine等(2000)建立了檢測TTV的免疫印跡法，隨後國內學者(邢培清，2002)以TTV ORF2蛋白為抗原，建立了檢測TTV的酶聯免疫吸附試驗(ELISA)。血清PCR檢測雖為主要檢測手段，但其擴增受實驗條件、費用高、假陽性率高等因素的限制，不宜廣泛推廣；而血清學試驗僅能反應是否感染，並不能檢測病毒含量和分型檢測。因此，發明一種可以同時鑑別檢測動物Torque Teno virus兩種不同血清型的檢測方法對研究我國豬群中動物Torque Teno virus感染情況具有重要意義。國內外在病原體的檢測方法，利用LAMP方法對多種動物疫病和微生物檢測已有很多報告，但在獸醫臨床診斷方法，尚未見有動物Torque Teno virus的LAMP診斷方法。
環介導等溫擴增基因技術(loop-mediatedisothermal amplication ,簡稱LAMP)(國際專利公開號WO 00/28082)是2000年Notomi等開發出的一種核酸擴增新技術，針對待測靶基因序列的6個區域設計一套兩對特異引物，利用鏈置換DNA聚合酶(Bst DNApolymerase)在65°C左右等溫條件下能夠特異性、高效、快速的進行核酸擴增,擴增結果可直接對擴增副產物焦磷酸鎂沉澱通過肉眼進行判斷或檢測其濁度，也可用結合雙鏈的螢光染料優選SYBR Green I染色，即可通過肉眼判定。由於LAMP技術擴增的兩對引物是針對靶基因的6個區段，因而具有比PCR更高的特異性，同時是等溫條件下即不需要PCR儀等特殊儀器，且樣品的前處理非常簡單、單位時間內擴增效率更高等優點，已引起人們的關注。
中國發明專利(申請號為:200710030435.0,200710030437.X,200710132320.2、200710026389.7,200810052321.0,200810015001.8,200810093986.6,200910041358.8、200910251055.9,200910090037.7,201010555073.9,201110339104.X 等)分別公開了採用環介導等溫擴增基因技術檢測病菌和動物疫病的方法。但是，目前尚無利用環介導等溫擴增基因技術檢測動物Torque Teno virus的試劑盒及檢測方法的報導。
發明內容
本發明的目的是提`供一種用於同步進行動物TTV的TTVl和TTV2兩種不同血清型的檢測和鑑別診斷的LAMP檢測試劑盒及檢測方法。
在本發明的LAMP擴增引物的設計上，遵循環介導等溫擴增技術的引物設計要求，設計針對動物TTVl和TTV2的特異性引物，且保證在等溫擴增的條件下均能獲得較好的擴增，且可同時鑑別兩種不同的血清型。因此，本發明採用的技術方案是，即一種動物TorqueTeno病毒LAMP檢測試劑盒，包括LAMP擴增反應液I管、LAMP擴增反應液II管、Calcein顯色劑管、陽性對照管、陰性對照管和滅菌去離子水管。其中:
所述LAMP擴增反應液I管管內由以下反應液組成:
序列為SEQ ID N0.1 的 60 mmol/L 的 TTVl 內引物上遊 1.0 μ L ；
序列為SEQ ID N0.2 的 60 mmol/L 的 TTVl 內引物下遊 1.0 μ L ；
序列為SEQ ID N0.3 的 5 mmol/L 的 TTVl 外引物上遊 1.0 μ L ；
序列為SEQ ID N0.4 的 5 mmol/L 的 TTVl 外引物下遊 1.0 μ L ；
10 X LAMP 緩衝液 12.5 μ L ;
5U/ μ L Bst DNA 聚合酶 0.8 μ L ;
滅菌去離子水3.7yL;[0017]合計21 μ L，為單次反應的用量。
所述LAMP擴增反應液II管管內由以下反應液組成:
序列為SEQ ID N0.5 的 60 mmol/L 的 TTV2 內引物上遊 1.0 μ L ；
序列為SEQ ID N0.6 的 60 mmol/L 的 TTV2 內引物下遊 1.0 μ L ；
序列為SEQ ID N0.7 的 5 mmol/L 的 TTV2 外引物上遊 1.0 μ L ；
序列為SEQ ID N0.8 的 5 mmol/L 的 TTV2 外引物下遊 1.0 μ L ；
10 X LAMP buffer 緩衝液 12.5 μ L ;
5U/ μ L Bst DNA 聚合酶 0.8 μ L ;
滅菌去離子水3.7yL;
合計21 μ L，為單次反應的用量。
所述陽性對照管 管內為TTVl和TTV2陽性重組質粒，比例為1:1，體積為20 μ L ;
TTVl陽性重組質粒為pMD19-T-G，其DNA序列為SEQ ID N0.9 ；
TTV2 陽性重組質粒為 pMD19-T-S，其 DNA 序列為 SEQ ID N0.10。
所述陰性對照管管內為豬Torque Teno病毒陰性的豬血清，體積約50 μ L。
所述Calcein顯色劑管管內體積約20yL。
所述滅菌去離子水管ImL 2mL。
動物Torque Teno病毒環介導等溫擴增技術快速檢測方法，包括如下步驟；
(I)樣品中核酸模板的提取:取200 μ L 300 μ L或200mg 300mg待檢樣品，可選用相應的市售商品化核酸提取試劑盒或實驗室常規使用的提取病毒核酸的方法提取樣品中的DNA，即為核酸模板。
(2)LAMP反應體系:取3 μ L核酸模板或陽性對照或陰性對照，分別加入LAMP擴增反應液I或LAMP擴增反應液II 21yL，Calcein顯色劑I μ L，反應體系的總體積為25 μ L。
(3) LAMP擴增條件:將步驟(2)配製好的反應體系的PCR管於65 °C恆溫反應60min，80°C終止反應。
(4)結果判定:通過LAMP Real Time Turbidimeter LA-320儀進行實時觀察:陽性擴增在30min內可見明顯的實時擴增曲線和濁度擴增曲線，陰性無任何擴增；或者，反應產物顯現綠色則為陽性，橙色則為陰性；或者，通過肉眼觀察鑑定，與陰性對照管比較顯示，檢測管出現明顯渾濁為陽性，未見渾濁為陰性。
本發明的優點是:1、本發明可以快速地對待檢樣品是否感染豬TTV進行鑑定和鑑另IJ，具有較高的靈敏度。在引物設計上，選擇TTVl (AY823990.1)和TTV2(AY823991.1)已知核酸序列，並通過文獻檢索、多重對比等方法對收集到的核酸序列進行了篩選。通過反覆試驗，排除了有非特異性擴增的引物，最後選定SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4 引物，SEQ ID N0.5,SEQ ID N0.6,SEQ ID N0.7 和 SEQ ID N0.8 引物分別作為TTVl和TTV2的鑑定引物。並通過優化LAMP反應條件等，可高靈敏度地對豬TTVl和TTV2進行鑑定。
2、本發明提供的擴增試劑均經試驗反覆驗證和優化，具有市場上同類LAMP等溫擴增檢測試劑盒相應優點。具有:(1)、不需要特殊試劑與設備；(2)、高特異性:應用六個區段，四條引物，根據是否擴增就能判斷靶標物質的存在與否，陽性率可達於99.9%，假陽性率小於0.1%; (3)、快速、高效擴增:檢測時間2小時左右；(4)、靈敏度高:擴增模板僅需100.0pg/mL或更少，血清樣本中DNA最低檢測極限達到50.0pg/mL ;標本的檢出率達到99% ; (5)、鑑定簡便:無需電泳等其他任何分析步驟，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應溶液中的Mg2+結合，產生副產物一一焦磷酸鎂乳白沉澱，與Calcein顯色劑結合，陽性結果顯示為綠色，陰性結果為橙色，結果明顯可靠，可通過肉眼觀察鑑定；(6)、用途廣:可廣泛用於動物TTV的安全快速檢測。
3、特異性好:本發明對圓環病毒屬其它病毒DNA無擴增，假陽性率低。
4、靈敏度高:本發明對豬血清樣本中TTVl和TTV2檢測的最低檢測量分別約為50.0pg/mL和 60.0pg/mL。
圖1豬TTVl LAMP擴增特異性試驗結果；
圖2豬TTVl LAMP擴增靈敏性試驗結果；
圖3陰陽性對照LAMP擴增結果；
圖中:A-實時擴增濁度曲線，B-實時擴增速率曲線，C-擴增柱型分析圖；
圖1中:1-豬TTVl病毒DNA，2-豬TTV2病毒DNA，3-豬細小病毒(CPV)，4-豬圓環病毒II型(PCV-1I)，5-豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌(APP)，6-豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)，7-豬繁殖與呼吸症候群病毒VR-2332株，8-陰性對照；
圖 2 中:1-0.5 X lO'g/mLTTVl DNA, 2-0.5 X l(T2ug/mLTTVl DNA, 3-0.5 X 10_3ug/mLTTVl DNA, 4-0.5 X 10_4ug/mLTTVl DNA, 5_0.5 X 10_5ug/mLTTVl DNA, 6_0.5 X 10_6ug/mLTTVl DNA，7、0.5Xl(T7ug/mLTTVl DNA，8-陰性對照;圖3中:D-豬TTVl陽性，E-豬TTV2陽性，F-陰性對照。
具體實施方式
下面提供具體實施例進一步闡述本發明的技術方下面提供具體實施例進一步闡述本發明的技術方案，但本發明技術的應用不限於實施例。
實施列1、動物Torque Teno病毒環介導等溫擴增技術快速檢測試劑盒包括LAMP擴增反應液I管、LAMP擴增反應液II管、Calcein顯色劑管、陽性對照管、陰性對照管和滅菌去離子水管，其中:
LAMP擴增反應液I管管內由以下反應液組成:序列為SEQ ID N0.1的5 mmol/L的TTVl內引物上遊LOyL ;序列為SEQ ID N0.2的5 mmol/L的TTVl內引物下遊1.0μ L ;序列為SEQ ID N0.3的60 mmol/L的TTVl外引物上遊LOyL ;序列為SEQ ID N0.4的 60 mmol/L 的 TTVl 外引物下遊 1.0 μ L ; 10 X LAMP 緩衝液 12.5μ L ；5U/y L Bst DNA 聚合酶0.8 μ L ;滅菌去離子水3.7 μ L ;合計21 μ L，為單次反應的用量。
LAMP擴增反應液II管管內由以下反應液組成:序列為SEQ ID N0.5的5 mmol/L的TTV2內引物上遊LOyL ;序列為SEQ ID N0.6的5 mmol/L的TTV2內引物下遊1.0μ L ;序列為SEQ ID N0.7的60 mmol/L的TTV2外引物上遊LOyL ;序列為SEQ ID N0.8的 60 mmol/L 的 TTV2 外引物下遊 1.0 μ L ； 10 X LAMP buffer 緩衝液 12.5μ L ；5U/y L BstDNA聚合酶0.8 μ L ;滅菌去離子水3.7 μ L ;合計21 μ L，為單次反應的用量。
其中10XLAMP buffer緩衝液由以下成分組成:40mmol/L三輕基甲基氨基甲燒鹽酸鹽；20 mmol/L氯化鉀；20 mmol/L硫酸胺;體積百分比濃度為1% Tritonx-100 ；0.8mol/L Betaine ；7.5mmol/L氯化鎂；1.2mmol/L dNTP。上述濃度為溶液終濃度。
陽性對照管管內為豬TTVl和豬TTV2陽性重組質粒，比例為1: 1，體積為20 μ L ;豬TTVl陽性重組質粒PMD19-T-G的DNA序列為SEQ ID N0.9 ;豬TTV2陽性重組質粒PMD19-T-S 的 DNA 序列為 SEQ ID N0.10。
陰性對照管管內為豬Torque Teno病毒陰性的豬血清，體積約50 μ L。
所述Calcein顯色劑管管內體積約20 μ L。
所述滅菌去離子水管ImL 2mL。
實施例2、本發明引物的設計及篩選
根據已知的TTVl (AY823990.1)和TTV2 (AY823991.1)核酸序列的基因組全長序列，利用應用ClustW軟體進行多重比對,用LAMP引物設計軟體Primer Explorer V4.0軟體設計特異性引物，分別標記為=SEQ ID N0.1……SEQ ID N08.。所有引物均由寶生物工程(大連)有限公司合成。用市售病毒核酸提取試劑盒提取TTV病毒DNA，擴增，排除有非特異性擴增的引物。獲得引物如下:
`
權利要求
1.動物TorqueTeno病毒環介導等溫擴增技術快速檢測試劑盒，其特徵在於:它包括LAMP擴增反應液I管、LAMP擴增反應液II管、Calcein顯色劑管、陽性對照管、陰性對照管和滅菌去離子水管，其中: 所述LAMP擴增反應液I管管內由以下反應液組成: 序列為SEQ ID N0.1的60 mmol/L的TTVl內引物上遊1.0 μ L ； 序列為SEQ ID N0.2的60 mmol/L的TTVl內引物下遊1.0 μ L ； 序列為SEQ ID N0.3的5 mmol/L的TTVl外引物上遊1.0 μ L ； 序列為SEQ ID N0.4的5 mmol/L的TTVl外引物下遊1.0 μ L ； 10XLAMP buffer 緩衝液 12.5μ L ；
5U/ μ L Bst DNA 聚合酶 0.8 μ L ; 滅菌去尚子水3.7 μ L ; 合計21 μ L,為單次反應的用量； 所述LAMP擴增反應液II管管內由以下反應液組成: 序列為SEQ ID N0.5的60 mmol/L的TTV2內引物上遊1.0 μ L ；` 序列為SEQ ID N0.6的60 mmol/L的TTV2內引物下遊1.0 μ L ； 序列為SEQ ID N0.7的5 mmol/L的TTV2外引物上遊1.0 μ L ； 序列為SEQ ID N0.8的5 mmol/L的TTV2外引物下遊1.0 μ L ； 10XLAMP 緩衝液 12.5μ L ；
5U/ μ L Bst DNA 聚合酶 0.8 μ L ; 滅菌去尚子水3.7 μ L ; 合計21 μ L,為單次反應的用量； 所述陽性對照管管內為TTVl和TTV2陽性重組質粒，比例為1: 1，體積為20 μ L ; TTVl陽性重組質粒為pMD19-T-G，其DNA序列為SEQ ID N0.9 ； TTV2陽性重組質粒為pMD19-T-S，其DNA序列為SEQ ID N0.10 ； 所述陰性對照管管內為豬Torque Teno病毒陰性的豬血清，體積約50 μ L ; 所述Calcein顯色劑管管內體積約20 μ L ; 所述滅菌去離子水管ImL 2mL。
2.根據權利要求
1所述動物TorqueTeno病毒環介導等溫擴增技術快速檢測試劑盒，其特徵在於:所述10XLAMP緩衝液由以下成分組成: 40mmol/L三輕基甲基氨基甲燒鹽酸鹽；20 mmol/L氯化鉀；20 mmol/L硫酸胺；體積百分比濃度為 1% Tritonx-100 ；0.8mol/L Betaine ;7.5mmol/L 氯化鎂;1.2mmol/L dNTP。
3.利用權利要求
1所述試劑盒進行動物TorqueTeno病毒環介導等溫擴增技術的非疾病診斷目的的快速檢測方法，包括如下步驟； (1)樣品中核酸模板的提取:取200μ L 300 μ L或200mg 300mg待檢樣品，可選用相應的市售商品化核酸提取試劑盒或實驗室常規使用的提取病毒核酸的方法提取樣品中的DNA，即為核酸模板； (2)LAMP反應體系:取3μ L核酸模板或陽性對照或陰性對照，分別加入LAMP擴增反應液I或LAMP擴增反應液II 21 μ L，Calcein顯色劑I μ L，反應體系的總體積為25 μ L; (3)LAMP擴增條件:將步驟(2)配製好的反應體系的PCR管於65°C恆溫反應60min，80°C終止反應；
(4)結果判定:通過LAMP Real Time Turbidimeter LA-320儀進行實時觀察:陽性擴增在30min內可見明顯的實時擴增曲線和濁度擴增曲線，陰性無任何擴增；或者，反應產物顯現綠色則為陽性，橙色則為陰性；或者，通過肉眼觀察鑑定，與陰性對照管比較顯示，檢測管出現明顯渾濁為陽性，未見渾濁為陰性。
專利摘要
本發明設涉及動物疫病分子生物學檢測方法及檢測試劑領域，具體涉及一種動物Torque Teno病毒環介導等溫擴增技術快速檢測用引物、試劑盒及其檢測方法。本發明根據動物Torque Teno病毒的兩種不同血清型基因序列，用ClustalW進行多重比對，分析序列的保守區，採用LAMP引物設計軟體，分別設計內引物和外引物，均可特異性的實現快速對TTV1和TTV2血清型的檢測與鑑別。本發明公開了一種快速、靈敏度高、特異性強、操作簡便、設備要求低、省時省力並且易於觀察結果的環介導等溫擴增技術對TorqueTeno病毒進行檢測的方法，沒有複雜的後處理，適用性廣。
文檔編號C12Q1/68GKCN102367493 B發布類型授權 專利申請號CN 201110375835
公開日2013年9月11日 申請日期2011年11月23日
發明者聶福平, 聶奎, 李應國, 王國民, 黃鶴, 楊俊 , 肖進文, 李賢良, 吳曉薇, 王昱, 向海洋 申請人:重慶出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心, 聶福平導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (3), 非專利引用 (4),