可重複使用的智能生物催化劑(包括固定化酶和應激載體)及其在有機合成中的應用的製作方法

2023-05-28 22:14:46

專利名稱：可重複使用的智能生物催化劑(包括固定化酶和應激載體)及其在有機合成中的應用的製作方法
技術領域：
本發明試劑使用載體將酶進行固定化後得到的智能催化劑的製備及其在重要化學品合成中的應用。
背景技術：
隨著對環境保護的日益關注，在合成化學品時，發展對環境友好的合成方法是非常迫切的。在此需求下，酶作為催化劑，由於其溫和的反應條件，優異的立體、區域、化學選擇性，使其成為合成重要的工業化學品時非常有效的方法。採用生物催化過程，能夠從根本上優化精細化學品如醫藥、農藥、香料和香水、食品添加劑及護理產品的合成路線。在酶的應用過程中，人們也注意到酶的某些不足，如酶的催化活性不高、酶的穩定性較差、不能重複使用、不易於分離純化。針對酶的上述不足，利用生物分子工程技術，可以有效的改善酶的PH穩定性、熱穩定性、催化活性等方面；利用酶固定化技術，可以有效的克服酶在使用中不易重複使用及分離的缺點，有效的降低了生產成本。固定化酶既保持了酶的催化活性，克服了游離酶的不足，非常容易的從體系中分離出來，對於連續生產而言，是非常有益的，某些實驗結果表明通過固定化，可以提高酶的催化效率、增加穩定性等。目前的方法，是將酶固定在不溶於水的載體上，反應在非均相體系中進行。非均相反應體系中存在某些不足的， 如由於酶與載體的結合時可能會影響酶的空間構象而降低酶的催化活性；由於酶與反應底物在非均相的體系中，不可避免的會使酶與底物之間的相互作用速度降低，從而影響了反應的速率及生產效率。

發明內容
針對上述現有酶固定化的不足，本發明介紹了將具有催化功能的酶與基於聚 N-異丙基-丙烯醯胺(PNIPAAm)聚合物及其它具有應激功能的聚合物作用得到智能生物催化劑，隨後將其應用於精細化學品合成的方法。在本發明中，酶催化劑固定在應激載體上。這些載體材料，在不同的外界刺激下， 可逆的實現在水中或是其他溶劑中的溶解與析出。載體固定化生物催化劑與載體在水中及其他溶劑中表現出了一致的溶解-析出的現象。當固定化催化劑在均相體系中完成反應後，可以通過適當改變反應體系的PH值、溫度、離子強度或者是加入某化學物質，使得固定化催化劑從體系中以沉澱形式析出，而產物則在溶液中，從而實現了產物與催化劑的分離。 回收的酶可以重新溶解在緩衝溶液中進行循環使用，實現了酶的回收再利用。使用上述的技術方法，可以有效結合均相催化與非均相催化的優點，有效地避免了各自的缺點，是一種極有應用價值的新方法。眾多的天然產物或是人工合成的聚合物，在溫度、PH值、離子強度改變時，其構象也會發生相應的改變，這些高分子聚合物作為智能材料在生物、醫藥方面都有廣泛的應用， 既應用於藥物傳遞系統、細胞粘附介質中，又可以應用在控制酶的功能及基因表達方面。在這些眾多的智能材料中，聚N-異丙基-丙烯醯胺(PNIPAAm)是一種在水相中熱可逆的溶解-析出的聚合物，其臨界共溶溫度較低為32°C。當加熱的溫度超過32°C時，該聚合物就會從水相中析出形成沉澱，當溫度低於32°C時，沉澱會重新溶解在水相中，並且這種析出-溶解的過程是完全徹底的。通過改變與N-異丙基-丙烯醯胺共聚物的種類可以調整這種聚合物的臨界共溶溫度。例如在四氫呋喃-甲苯的混合溶劑中以摩爾比40 I加入N-異丙基-丙烯醯胺與N-丙烯醯氧基-琥珀酸醯亞胺，加入偶氮二異丁腈(AIBN)誘發聚合反應。反應完畢後， 加入正己烷使聚合物析出，真空乾燥。得到的聚合物的臨界共溶溫度約為33°C，其結構中含有一個活化的酯基基團，該酯基基團的反應活性遠遠高於蛋白質分子中的一級胺。
具體實施例方式以下通過具體的實施例來進一步說明，但是這些實施例不構成對本發明的限制。實施例I羰基還原酶的固定化在憐酸緩衝溶液(IOOmM, pH 8.0)中，將來源於Sporobolomyces salmonicolor (SSCR)的羰基還原酶與聚合物室溫下作用2小時，加入NaCl溶液後，白色沉澱析出，得到的沉澱用相同濃度的NaCl溶液洗滌。如果不加入NaCl溶液，將反應溶液加熱至高於33°C (LCST)時，同樣有白色沉澱析出。分離出來的固定化酶以及在反應溶液中的酶的蛋白濃度及反應活性均進行了測定。蛋白質的結合產率是指被固定化蛋白質與初始加入的蛋白質的數量比。酶的結合產率是指被固定化酶的反應活性與初始加入的蛋白質反應活性比。相對反應活性是固定化酶的反應活性與游離酶的反應活性比。實驗表明蛋白質的結合產率為53%，固定化酶的相對反應活性為72%，酶的結合產率為38%。實施例2D_葡萄糖脫氫酶(⑶H)的固定化在磷酸緩衝溶液(lOOmM，pH 8. O)中，將⑶H(能夠將NADP+還原為NADPH，NADPH 是羰基還原酶輔因子)與聚NIPAAm室溫下作用2小時，加入NaCl緩衝溶液後，白色沉澱析出，得到的沉澱用相同濃度的NaCl溶液洗滌。如果不加入NaCl溶液，將反應溶液加熱至高於33°C (LCST)時，同樣有白色沉澱析出。分離出來的固定化酶及在反應溶液中的酶的蛋白濃度及反應活性均進行了測定。 蛋白質的結合產率是指被固定化蛋白質與初始加入的蛋白質的數量比。酶的結合產率是指被固定化酶的反應活性與初始加入的蛋白質反應活性比。相對反應活性是固定化酶的反應活性與游離酶的反應活性比。實驗結果表明蛋白質的結合產率為47%，固定化酶的相對反應活性為75%，酶的結合產率為35%。實施例3羰基還原酶與D-葡萄糖脫氫酶的共固定化在磷酸緩衝溶液(lOOmM, pH 8.0)中，加入來源於Sporobolomyces salmonicolor (SSCR)的羰基還原酶，D-葡萄糖脫氫酶,聚NIPAAm室溫下作用2小時,加入 NaCl緩衝溶液後，白色沉澱析出，得到的沉澱用相同濃度的NaCl溶液洗滌。如果不加入 NaCl溶液，將反應溶液加熱至高於33°C (LCST)時，同樣有白色沉澱析出。實施例4固定化羰基還原酶對酮的還原3，3- 二甲基-2-羰基丁酸乙酯作為底物檢測固定化酶的反應活性和對映選擇性。3，3- 二甲基-2-羰基丁酸乙酯與固定化的酶溶於磷酸鉀緩衝溶液中，輔因子NADPH通過 D-葡萄糖/D-葡萄糖脫氫酶體系再生。固定化的SSCR酶重複使用六次。每次反應，底物3， 3-二甲基-2-羰基丁酸乙酯在固定化酶的還原下，以100%的轉化率得到光學純的(R)-3， 3-二甲基-2-羥基丁酸乙酯。使用六次後，通過測定NADPH氧化後在340nm( ε = 6. 22mM^cm^)處的吸收光譜強度確定固定化SSCR酶的反應活性。結果表明，在使用六次後酶的活性為初始酶活性的 70%。上述結果證明固定化SSCR酶具有優異的對映選擇性，並且可以重複多次使用。實施例5固定化羰基還原酶與固定化D-葡萄糖脫氫酶對酮的還原3，3_ 二甲基-2-羰基丁酸乙酯作為底物檢測固定化SSCR酶與固定化葡萄糖脫氫酶的反應活性和對映選擇性。實驗步驟同上。固定化SSCR酶與固定化葡萄糖脫氫酶重複使用六次。每次反應，底物3，3- 二甲基-2-羰基丁酸乙酯在固定化SSCR酶與固定化葡萄糖脫氫酶的作用下，以100%的轉化率得到光學純的(R)-3，3-二甲基-2-羥基丁酸乙酯。由於⑶H的存在，無法通過測定NADPH氧化後在340nm處的吸收光譜強度確定固定化SSCR酶的反應活性。實施例6共固定化羰基還原酶與D-葡萄糖脫氫酶對酮的還原3，3-二甲基-2-羰基丁酸乙酯作為底物檢測SSCR酶與葡萄糖脫氫酶共固定化酶的反應活性和對映選擇性。實驗步驟同上。共固定化的SSCR酶與葡萄糖脫氫酶重複使用六次。每次反應，底物3，3-二甲基-2-羰基丁酸乙酯在固定化SSCR酶與固定化葡萄糖脫氫酶的作用下，以100%的轉化率得到光學純的(R)-3，3-二甲基-2-羥基丁酸乙酯。由於⑶H的存在，無法通過測定NADPH氧化後在340nm處的吸收光譜強度確定固定化SSCR酶的反應活性。總之，以聚合物為載體的生物催化劑在室溫下溶於水，當加熱至高於32°C時或者是加入鹽，如NaCl，從溶液中析出形成沉澱。與游離酶相比，固定化酶在還原底物3，3-二甲基-2-羰基丁酸乙酯時，同樣表現出了優秀的反應活性及對映選擇性。在循環使用六次後， 固定化酶在反應活性及對映選擇性方面沒有明顯的降低。實施例7腈基水解酶的固定化在憐酸緩衝溶液(lOOmM,pH 8. O)中，將來源於 Bradyrhizobium japonicum USDAl 10的腈基水解酶bll6402與聚合物室溫下作用2小時，加入NaCl溶液後，白色沉澱析出，得到的沉澱用相同濃度的NaCl溶液洗滌。如果不加入NaCl溶液，將反應溶液加熱至高於33°C (LCST)時，同樣有白色沉澱析出。分離出來的固定化酶及在反應溶液中的酶的蛋白濃度及反應活性均進行了測定。 蛋白質的結合產率是指被固定化蛋白質與初始加入的蛋白質的數量比。酶的結合產率是指被固定化酶的反應活性與初始加入的蛋白質反應活性比。相對反應活性是固定化酶的反應活性與自由酶的反應活性比。實驗結果表明蛋白質的結合產率為63%，固定化酶的相對反應活性為74%，酶的結合產率為47%。
權利要求
1.一類可以用於固定酶催化劑的應激載體上。這些載體材料，在不同的外界刺激下，可逆的實現在水中或是其他溶劑中的溶解與析出。
2.如權利要求I所述載體，將羰基還原酶與載體相互作用後生成的智能催化劑，通過改變離子強度或是溶液溫度，可以非常容易的以固體形式得到。
3.如權利要求I所述載體，將D-葡萄糖脫氫酶與載體相互作用後生成智能催化劑，通過改變離子強度或是溶液溫度，可以非常容易的以固體形式得到。
4.如權利要求I所述載體，將羰基還原酶與D-葡萄糖脫氫酶共同與載體相互作用後生成的智能催化劑，通過改變離子強度或是溶液溫度，可以非常容易的以固體形式得到。
5.如權利要求I所述載體，將腈基水解酶與載體相互作用後生成的智能催化劑，通過改變離子強度或是溶液溫度，可以非常容易的以固體形式得到。
6.如權利要求2所述智能催化劑，將其應用到3，3-二甲基-2-羰基丁酸乙酯的還原反應中。
7.如權利要求2、3所述智能催化劑，將其應用到3，3_二甲基-2-羰基丁酸乙酯的還原反應中。
8.如權利要求4所述智能催化劑，將其應用到3，3_二甲基-2-羰基丁酸乙酯的還原反應中。
全文摘要
本發明公布了一類固定酶催化劑的應激載體。這些載體材料，在不同的外界刺激下，可逆的實現在水中或是其他溶劑中的溶解與析出。載體固定化生物催化劑與載體在水中及其他溶劑中表現出了一致的溶解-析出的現象。當固定化催化劑在均相體系中完成反應後，可以通過適當改變反應體系的PH值、溫度、離子強度或者是加入某化學物質，使得固定化催化劑從體系中以沉澱形式析出，而產物則在溶液中，從而實現了產物與催化劑的分離。回收的酶可以重新溶解在緩衝溶液中進行循環使用，實現了酶的回收再利用。使用上述的技術方法，可以有效結合均相催化與非均相催化的優點，有效地避免了各自的缺點。
文檔編號C12N11/08GK102604923SQ201110026309
公開日2012年7月25日 申請日期2011年1月25日 優先權日2011年1月25日
發明者朱敦明 申請人:天津工業生物技術研究所