一種生物法生產α-環糊精的生產工藝的製作方法

2023-05-28 21:46:16 1

專利名稱：：一種生物法生產α-環糊精的生產工藝的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種生物法生產a-環糊精的生產工藝，屬於環糊精生產
技術領域：
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背景技術：
：環糊精(Cyclodextrins，通常簡稱為CD)，是一類由澱粉或多糖在環糊精葡萄糖基轉移酶作用下生成的由D-吡喃葡萄糖單元通過alpha-l，4-糖苷鍵首尾相連的環狀化合物的總稱，常見的有6、7和8個葡萄糖單元的分子，分別稱為a-、!3-和Y-環糊精。由於環糊精能與許多客體分子形成包合物，從而改變客體分子的物理和化學性質如溶解度、穩定性等，因此在食品、醫藥、農業、紡織、環保、化妝品、生物技術和分析化學等領域具有廣泛的應用。三種常用的環糊精中，由於e-環糊精水溶解度最小，易於通過分步結晶的方法製得，因此目前工業生產中大量製備和廣泛應用的是P-環糊精，但是P-環糊精由於溶解度小使其在對藥物包合作用方面的應用受到限制，目前科技工作者正致力於提高P-環糊精的溶解度，並且開發出了一系列高溶解度的P-環糊精衍生物(袁超，金徵宇，王晨光.改性環糊精及其應用，糧食與油脂，2006，(05))。a-環糊精空腔直徑略小於13-環糊精，其溶解度是13-環糊精溶解度的8倍，相比於P-環糊精，a-環糊精具有獨特的性質和特有的用途，更適於包合具有低分子量的分子，可以用於分子識別和納米材料，並且是一種非常好的膳食纖維，在食品、醫藥等領域已顯示出無可比擬的優勢。雖然市場已大量銷售a-環糊精產品，但由於a-環糊精生產成本較高，導致a-環糊精價格昂貴。生產a-環糊精的方法主要有化學法和生物法，化學法是將馬賽蘭氏澱粉與四氯乙烷反應，生成a-環糊精粗品，再經過濾和水蒸汽蒸餾後得到純度相對較高的a-環糊精(汪家銘；環狀糊精生產應用及市場前景，精細與專用化學品，1998(02)，19-20)。由於a-環糊精溶解度較大，所以化學法製備比較困難，而且會對環境造成較大汙染，生物法目前被認為是極具應用潛力的方法。然而，有關生物法製備e-環糊精的報導較多，關於生物法生產a-環糊精的報導則較少。陳龍然從土壤中分離出一株地衣芽孢桿菌，該菌發酵得到的環糊精葡萄糖基轉移酶(CGTase)作用於澱粉後，產物以a-環糊精為主，|3-環糊精次之，二者比例為2.47:1，環糊精總產率為29.8%(陳龍然，康培，馮明光，王雅芬，一株產環糊精葡萄糖基轉移酶的地衣芽孢桿菌的選育、產酶條件及酶學特性，微生物學報，2005(01))。目前生物法生產a-環糊精主要問題在於一、缺少優良菌種，市場上缺少高產率並且定向生產a-環糊精的環糊精葡萄糖基轉移酶(CGTase);二、缺少a-環糊精相應的生產工藝，針對a-環糊精在水中溶解度較高的問題，需要制定一套高效、經濟的分離提取方法。
發明內容本發明所解決的技術問題是提供了a-環糊精的生產成本。種生物法生產a-環糊精的工藝，降低了為解決上述問題，本發明技術方案為按照10%的濃度進行澱粉調漿，在50-9(TC條件下攪拌5-15分鐘；將溫度設定為30°C-6(TC，調pH5.0-6.0後，按照每克澱粉10-100個單位的量加入來源於軟化芽胞桿菌(Paenibacillusmacerans，中國典型微生物保藏中心，CCTCCM208063)a-CGTase，加入體積分數為5%的有機溶劑後，充分反應8-10小時；回收有機溶劑，採用結晶方法得到a_CGT。所述微生物發酵生產a-CGTase的方法為，在一定培養條件下，微生物發酵一定時間，得到含有a-CGTase的發酵液，發酵液經過粗過濾、精過濾、濃縮、乾燥等全部工藝或部分工藝後得到a-CGTase粉沫或者粗酶液。所述在50-9(TC條件下攪拌5-15分鐘澱粉調漿的目的在於使澱粉顆粒充分溶脹。所述a-CGTase的最適反應溫度為30°C_40°C，溫度通過影響酶對底物的催化效率，從而影響酶的活力，溫度過高或過低都會影響酶的作用效果。從降低生產成本考慮，應該將生產工藝的溫度設定在酶最適溫度附近，這樣大大降低加入的酶量，從而降低生產成本。所述a-CGTase的最適pH範圍為5.0-6.0，pH對a-CGTase活力的影響較大，從降低成本的角度考慮，應該將生產工藝的溫度設定在酶最適反應PH附近。a-CGTase活力的測定採用甲基分光光度法在pH1.4的酸性條件下，由於甲基橙和a-CGT形成包結複合物而使溶液吸光度下降，在一定濃度範圍內吸光度下降值(AA)與a-CGT濃度之間存在著線性關係。取1%(W/V)可溶性澱粉溶液lmL和50mmol/LNa2HP04_NaH2P04緩衝液(pH7.0)2mL，與0.lmL適當稀釋的粗酶液混勻，4(TC水浴中反應lOmin後，立即冰浴中止反應，再加入1.2mol/LHC1溶液0.lmL及0.035,1/L甲基橙溶液2mL，15。C靜置30min，在507nm下測定吸光度。一個酶活單位定義為在上述條件下每分鐘生成liimola-CGT所需的酶量。a-CGT、P-環糊精的分析採用高效液相色譜。色譜條件Waters600HPLC色譜儀，Waters自動進樣器，色譜柱ZORBAXNH2(4.6mmX150mm)，Waters2410示差檢測器；流動相(V/V)為70%乙腈水溶液，流速110mL/min;柱溫30°C。處理樣品時，粗酶液0.5mL與5.0%(W/V)澱粉溶液(50,1/LNa2HP04_NaH2P04，pH7.0)5mL混勻後在50。C反應24h後，4500r/min離心15min，棄沉澱，上清液中加入0.lmLa-澱粉酶液作用lh，O.45ym超濾膜過濾後取20iiL上機分析。所述有機溶劑可以為乙醇，異丙醇，正丁醇，正癸醇中任一一種，其中優選正癸醇。正癸醇不僅能與a-CGT特異性的形成包絡物沉澱從而提高澱粉總的轉化率，而且正癸醇可以通過水蒸氣蒸餾幾乎全部除去，極少殘留在最終的產品中，不影響a-CGT在食品和醫藥領域中的應用。另外，正葵醇也是國標許可使用的食品添加劑。所述回收有機溶劑，通過結晶手段得到a-CGT的具體方法為待反應結束後，將反應液直接過濾，濾餅用蒸餾水清洗2-3次，收集濾餅，其中包括有機溶劑與a-CGT形成的絡合物沉澱以及沒有反應的澱粉；將濾餅重新復溶，然後採用水蒸氣蒸餾除去有機溶劑，待蒸餾結束後，過濾蒸餾液除去沒有反應的澱粉，即可得到a-CGT的水溶液；將水溶液蒸發濃縮，低溫放置即可得到a-CGT的結晶。本發明的技術原理如下a-CGTase除了能發生環化反應生產a-CGT夕卜，還能發生水解、歧化和偶合反應，偶合反應是環化反應的逆反應，它可以將環糊精的環打開，然後轉移到直鏈低聚糖上。在一定濃度麥芽低聚糖或葡萄糖等小分子糖的存在下，a-CGTase的環化反應受到抑制，影響最終收率。本發明直接採用糊化的澱粉來生產環糊精，在中溫攪拌的條件下，澱粉顆粒充分溶脹，解除了葡萄糖等小分子糖對環化反應的抑制，提高了a-CGT的轉化率。由於a-CGT可以與多種有機物形成不溶於水的包絡物，添加一定比例的有機溶劑可以連續地從反應系統中去除環糊精，改變反應的平衡，使其向著環糊精的生成方向不斷進行，有利於環糊精生產，同時解除了環糊精本身的產物抑制作用。本發明是根據a-CGTase以及產物a-CGT的特點生產a-CGT的工藝，相對於現有技術，具有以下優點1)提供一種高轉化率、低成本的a-CGT的生產方法，填補了該
技術領域：
內的空白，為a-CGT大規模的生物法生產奠定了基礎；2)酶反應的溫度比較低，不需要進行大量的升溫降溫控制，低能耗，特別適合工業化生產；3)直接利用原澱粉作為底物，解除了葡萄糖、麥芽糖等小分子糖對a-CGT的生成的抑制作用，提高了a-CGT的轉化率；4)添加一定比例的有機溶劑，連續地從反應系統中去除環糊精，使其向著環糊精的生成方向不斷進行，提高了a-CGT的轉化率；5)本反應總的反應周期短，只需要8-10小時；6)有機溶劑去除過程方法簡單，得到的產品純度高，雜質少，可用於食品與醫藥等行業。總體來講，本發明具有生產成本低、原料轉化率高、產品純度高、工藝流程簡單、生產周期短等諸多優點。具體實施方式實施例1:原料預處理按照10%的濃度進行馬鈴薯澱粉調漿，在50-9(TC條件下攪拌5-15分鐘，使澱粉顆粒充分溶脹。酶法生產工藝預處理後將溫度設定為3(TC，調pH5.0後，按照每克澱粉10個單位的比例加入a-CGTase，然後加入反應體積5%的正葵醇後，充分反應8_10小時。a-CGT的提取工藝將反應液直接過濾，濾餅用蒸餾水清洗2-3次，收集濾餅，其中包括正癸醇與a-CGT形成的絡合物沉澱以及沒有反應的澱粉；將濾餅重新復溶，然後採用水蒸氣蒸餾除去正癸醇，待蒸餾結束後，過濾蒸餾液除去沒有反應的澱粉，即可得到a-CGT的水溶液；將水溶液蒸發濃縮，低溫放置即可得到a-CGT的結晶。結果見表1，澱粉的總轉化率高達71%，產品中a-CGT所佔比例為80%，P-CGT佔20%。表1不同實施例下a-CGT的生產情況tableseeoriginaldocumentpage6實施例2原料預處理同實施例1酶法生產工藝預處理後將溫度設定為4(TC，調pH5.0後，按照每克澱粉10個單位的比例加入a-CGTase，然後加入反應體積5%的正葵醇後，充分反應8_10小時。a-CGT的提取工藝同實施例1結果見表1，澱粉的總轉化率高達65%，產品中a-CGT所佔比例為75%，P-CGT佔25%。實施例3原料預處理同實施例1[OO48]酶法生產工藝預處理後將溫度設定為5(TC，調pH5.0後，按照每克澱粉IO個單位的比例加入a-CGTase，然後加入反應體積5%的正葵醇後，充分反應8_10小時。a-CGT的提取工藝同實施例1結果見表1，澱粉的總轉化率高達63%，產品中a-CGT所佔比例為72%，P-CGT佔28%。實施例4原料預處理同實施例1酶法生產工藝預處理後設置溫度6(TC，調pH5.0後，按照每克澱粉IO個單位的比例加入a-CGTase，然後加入反應體積5%的正葵醇後，充分反應8_10小時。a-CGT的提取工藝同實施例1結果見表l，澱粉的總轉化率高達60%，產品中a-CGT所佔比例為65%，P_CGT佔35%。實施例5原料預處理同實施例1酶法生產工藝預處理後設置溫度30°C，調pH5.0後，按照每克澱粉20個單位的比例加入a-CGTase，然後加入反應體積5%的正葵醇後，充分反應8_10小時。a-CGT的提取工藝同實施例1結果見表1，澱粉的總轉化率高達72%，產品中a-CGT所佔比例為81X，P-CGT佔19%。實施例6原料預處理同實施例1酶法生產工藝預處理後設置溫度30°C，調pH5.0後，按照每克澱粉100個單位的比例加入a-CGTase，然後加入反應體積5%的正葵醇後，充分反應8_10小時。a-CGT的提取工藝同實施例1結果見表1，澱粉的總轉化率高達72%，產品中a-CGT所佔比例為81X，P-CGT佔19%。實施例7原料預處理同實施例1酶法生產工藝預處理後設置溫度30°C，調p朋.0後，按照每克澱粉10個單位的比例加入a-CGTase，然後加入反應體積5%的正葵醇後，充分反應8_10小時。a-CGT的提取工藝同實施例1結果見表1，澱粉的總轉化率高達71%，產品中a-CGT所佔比例為80%，P_CGT佔20%。實施例8原料預處理同實施例1酶法生產工藝預處理後設置溫度30°C，調pH5.0後，按照每克澱粉10個單位的比例加入a-CGTase，然後加入反應體積5%的乙醇後，充分反應8_10小時。a-CGT的提取工藝將反應液直接過濾，濾餅用蒸餾水清洗2-3次，收集濾餅，其中包括乙醇與a-CGT形成的絡合物沉澱以及沒有反應的澱粉；將濾餅重新復溶，然後採用水蒸氣蒸餾除去乙醇，待蒸餾結束後，過濾蒸餾液除去沒有反應的澱粉，即可得到a-CGT的水溶液；將水溶液蒸發濃縮，低溫放置即可得到a-CGT的結晶。結果見表1，澱粉的總轉化率高達56%，產品中a-CGT所佔比例為60%，P-CGT佔40%。實施例9原料預處理同實施例1酶法生產工藝預處理後設置溫度30°C，調pH5.0後，按照每克澱粉10個單位的比例加入a-CGTase，然後加入反應體積5%的異丙醇後，充分反應8_10小時。a-CGT的提取工藝將反應液直接過濾，濾餅用蒸餾水清洗2-3次，收集濾餅，其中包括異丙醇與a-CGT形成的絡合物沉澱以及沒有反應的澱粉；將濾餅重新復溶，然後採用水蒸氣蒸餾除去異丙醇，待蒸餾結束後，過濾蒸餾液除去沒有反應的澱粉，即可得到a-CGT的水溶液；將水溶液蒸發濃縮，低溫放置即可得到a-CGT的結晶。結果見表1，澱粉的總轉化率高達57%，產品中a-CGT所佔比例為46X，P-CGT佔54%。實施例10原料預處理同實施例1酶法生產工藝預處理後設置溫度30°C，調pH5.0後，按照每克澱粉10個單位的比例加入a-CGTase，然後加入反應體積5%的正丁醇後，充分反應8_10小時。a-CGT的提取工藝將反應液直接過濾，濾餅用蒸餾水清洗2-3次，收集濾餅，其中包括正丁醇與a-CGT形成的絡合物沉澱以及沒有反應的澱粉；將濾餅重新復溶，然後採用水蒸氣蒸餾除去正丁醇，待蒸餾結束後，過濾蒸餾液除去沒有反應的澱粉，即可得到a-CGT的水溶液；將水溶液蒸發濃縮，低溫放置即可得到a-CGT的結晶。結果見表1，澱粉的總轉化率高達69%，產品中a-CGT所佔比例為74%，P_CGT佔26%。實施例11環糊精葡萄糖基轉移酶的製備3L發酵罐，培養基裝液量為1.5L，接入軟化芽胞桿菌(Paenibacillusmacerans，CCTCCM208063)，37t:條件下培養72h後下罐，將發酵液12000rpm離心15min除去菌體，得到上清液，即為環糊精葡萄糖基轉移酶酶液。發酵培養基組成為甘油10g;蛋白腖18g;酵母膏:20g;NH4C1:12g;KH2P04:2.31g;K2HP04_3H20:16.43;MgCl2:5,1。軟化芽孢桿菌(Paenibacillusmacerans，CCTCCM208063)固體粉末的製備將軟化芽胞桿菌發酵液經過微濾裝置過濾，收集透出液；將透出液經過截留分子量為3萬道爾頓的醋酸纖維超濾膜過濾，收集濃縮液；用真空冷凍乾燥機處理濃縮液得到粉末狀a-CGTase。權利要求一種生物法生產α-環糊精的生產工藝，其特徵在於，按照10％的濃度進行澱粉調漿，在50-90℃條件下攪拌5-15分鐘；設定溫度30℃-60℃，調pH5.0-6.0後，按照每克澱粉10-100個單位的量加入來源於軟化芽胞桿菌(Paenibacillusmacerans，中國典型微生物保藏中心，CCTCCM208063)α-環糊精葡萄糖基轉移酶，加入體積分數為5％的有機溶劑後，充分反應8-10小時；回收有機溶劑，採用結晶方法得到α-環糊精。2.根據權利要求1所述的生產工藝，其特徵在於所述回收有機溶劑、結晶方法為將反應液直接過濾，濾餅用蒸餾水清洗2-3次，收集濾餅，其中包括有機溶劑與a-環糊精形成的絡合物沉澱以及沒有反應的澱粉；將濾餅重新復溶，然後採用水蒸氣蒸餾除去有機溶劑，待蒸餾結束後，過濾蒸餾液除去沒有反應的澱粉，即可得到a-環糊精的水溶液；將水溶液蒸發濃縮，低溫放置即可得到a-環糊精的結晶。3.根據權利要求1或2所述的生產工藝，其特徵在於，所述的有機溶劑為乙醇，異丙醇，正丁醇，正癸醇中任一一種。全文摘要本發明公開了一種生物法生產α-環糊精(a-CGT)的生產工藝，屬於環糊精生產
技術領域：
。採用來源於軟化芽胞桿菌(Paenibacillusmacerans，中國典型微生物保藏中心，CCTCCM208063)的α-環糊精葡萄糖基轉移酶(α-CGTase)生產α-CGT。應用本工藝生產α-CGT，澱粉的總轉化率高達71％，產品中α-CGT所佔比例為80％，β-CGT佔20％。本發明具有流程簡單，生產周期短，轉化率高，得到的α-CGT純度高等優點。文檔編號C12R1/01GK101712972SQ20091026098公開日2010年5月26日申請日期2009年12月18日優先權日2009年12月18日發明者吳丹,吳敬,王寧,陳堅,陳晟申請人:江南大學