一種用於診斷乳腺癌的mri對比劑及其製備方法
2023-06-14 18:18:21
專利名稱：一種用於診斷乳腺癌的mri對比劑及其製備方法
技術領域：
本發屬於生物醫學工程領域，具體涉及一種用於診斷乳腺癌的MRI對比劑及其製備方法。
背景技術：
全世界每年約有120萬婦女患乳腺癌，每年有50萬婦女死於乳腺癌，每年以2% 3 %的速度遞增，居我國女性惡性腫瘤發病率的第一位，早期診斷是降低乳腺癌死亡率的關鍵。X線攝影等乳腺常規影像學檢查的敏感性及特異性較低，對一些早期浸潤性乳腺癌、乳腺原位癌等的診斷有一定的漏診率，而且在發現乳腺小病灶、多灶性、多中心性、位於乳腺深部病灶以及評估腫瘤對周圍組織的侵犯方面存在很大的局限性。磁共振成像(MRI)具有良好的乳腺等軟組織解析度及空間解析度，無放射線損傷，對發現乳腺癌具有很高的
敏感性，大大提高了乳腺癌的早期檢出率和診斷符合率，但其特異性仍需提高。乳腺癌早期腫瘤的病灶尺寸微小，容易發生漏診，迫切需要敏感性和特異性更好的MRI技術。提高MRI識別效果的一個最有效途徑是應用具有腫瘤靶向富集功能的特異性MRI對比劑。目前國內臨床上所使用MRI對比劑基本上都是進口產品，極個別的仿製產品也效果較差，缺乏自主創新的技術和產品。從文獻報導及市場上MRI對比劑產品來看，低分子量的釓噴酸葡胺(Gd-DTPA)螯合物是目前應用最多的一種Tl對比劑，特點是它們易被腎臟排洩清除，血液半衰期短，作為「血池劑」(blood pool agent)使用時，效果較好。將Gd-DTPA附著在納米粒子表面，對於延長對比劑的血液半衰期及獲得靶向傳輸有一定的效果，一種途徑是將Gd-DTPA連接到納米樹狀高分子上，常用的是聚醯胺-胺型樹枝狀高分子(PAMAM)，而PAMAM的生物相容性較差而且不能生物降解，使用後無法通過代謝途徑排出體外，影響這類MRI對比劑作為診斷試劑應用。與低分子量順磁螯合物Gd-DTPA相比，超順磁性鐵氧化物納米粒子(SPIO)是一種T2陰性造影劑。SPIO試劑是由分子式為Fe23+03M2+0氧化鐵微晶組成，當M2+為亞鐵離子(Fe2+)時，SPIO具有磁性。在不存在外加磁場的情況下，SPIO內部的磁場無規取向，淨磁場為零；而在外加磁場存在時，磁偶極子發生取向，從而使淨磁矩急劇提高，大大縮短周圍質子的Tl、T2/T2*弛豫時間，使SPIO所處局部在MR圖像中與周邊部位產生顯著的對比，SPIO的這種MR信號對比增強作用取決於粒子的成分、粒徑、材料本身的飽和磁化、在單位成像體積內粒子的濃度以及採集MRI數據時所用的物理參數。在各種基於SPIO的T2對比劑中，葡聚糖包裹親水SPIO的溶液(商品名=Feridex，美國)是一種成熟的T2對比劑，其粒徑為80 150nm, T2和Tl弛豫度分為98. 3和23. 9 Fe πιΜ ，在注射後數分鐘內，即在肝和脾高度聚集(分別約佔注入量的80%和5-10%)，它的血液半衰期只有6分鐘左右，所以Feridex只能用作肝、脾部位的顯像。整聯蛋白受體只在新生血管中有高水平的表達，是乳腺癌等腫瘤新生血管成像的一個重要分子靶點；乳腺癌細胞表面的原癌基因人類表皮生長因子受體2 (HER-2)蛋白水平較周圍正常乳腺上皮細胞高出數十倍乃至數百倍，是公認的重要腫瘤分子標誌之一。
發明內容
為了克服現有技術中診斷乳腺癌的MRI對比劑存在敏感度和特異性低的問題，本發明針對整聯蛋白受體和原癌基因人類表皮生長因子受體2 (HER-2)提供了一種敏感度和特異性高的用於診斷乳腺癌的MRI對比劑的製備方法。本發明所要解決的另一技術問題在於，提供一種用於診斷乳腺癌的MRI對比劑。一種用於診斷乳腺癌的MRI對比劑的製備方法，包括如下步驟
Cl)以疏水型超順磁性鐵氧化物納米粒子即疏水型SPIO納米粒子(製備方法參見H.Ai, C. Flask, B. Weinberg, X. Shuai, M. D. Pagel et al, 「Magnetite- loadedpolymeric micelles as novel magnetic resonance probe，，， Adv. Mater. , 2005, 17，1949-1952.)和馬來醯亞氨基聚乙二醇-聚己內酯即mal-PEG-PCL為原料，製備負載疏水型SPIO納米粒子的mal-PEG-PCL納米膠束即mal-PEG-PCL-SPIO納米膠束；
(2)在mal-PEG-PCL-SPIO納米膠束表面引入環狀五肽cRGD或/和單鏈抗體 scFv-ErbB (單鏈抗體 scFv-ErbB 的製備方法參見 Siyi Hu, et. al. Codonoptimization, expression, and characterization of an internalizing anti_ErbB2single-chain antibody in Pichia pastoris. Protein Expression andPurification, 2006, 47:249-257)，其引入方法包括如下步驟將環狀五肽cRGD或/和單鏈抗體scFv-ErbB與mal-PEG-PCL-SPIO按照比例混合，放置過夜，即在mal-PEG-PCL-SPIO納米膠束表面引入單鏈抗體scFv-Erb或/和單鏈抗體scFv-ErbB,製得用於診斷乳腺癌的MRI對比劑即雙靶向cRGD/scFv-ErbB-PEG-PCL-SPIO納米膠束。所述的環狀五肽cRGD是指含精氨酸一甘氨酸一天冬氨酸的環狀五肽。作為一種優選方案,所述的環狀五肽cRGD為環-(Arg-Gly-Asp-Phe-Lys)。所述環狀五肽cRGD和單鏈抗體scFv-ErbB可按任意體積比、質量比或摩爾比混
入
口 ο作為一種優選方案，所述的環狀五肽cRGD、單鏈抗體scFv-ErbB和mal-PEG-PCL-SPIO 的重量比為 0 1000 μ g :(Γ 000μ g : IiTlOOmg。作為一種更優選方案，所述的環狀五肽cRGD、單鏈抗體SCFv-ErbB和mal-PEG-PCL-SPIO 的重量比為 100 300 μ g :300 600 μ g :30 70mg。作為一種最選方案，所述的環狀五肽cRGD、單鏈抗體scFv-ErbB和mal-PEG-PCL-SPIO 的重量比為 200 μ g 500 μ g :50mg。作為一種優選方案步驟(I)中所述的馬來醯亞氨基聚乙二醇-聚己內酯中的聚乙二醇一聚己內酯為兩嵌段共聚物，其中聚乙二醇一聚己內酯段的數均分子量分別為2KD和IKD (PEG2k-PCLlk);步驟(2)中所述的放置過夜，是指在4°C下放置過夜。所述的mal-PEG-PCL-SPIO納米膠束是通過如下步驟製備得到
(1)將疏水型SPIO納米粒子和mal-PEG-PCL混合溶於有機溶劑中，超聲下緩慢滴加到去離子水中，室溫下攪拌至有機溶劑揮發完全；
(2)將上述溶液在室溫下4000 6000rpm離心20 40 min,除去下層大的聚集體；將上層溶液再用1000(Tl5000rpm離心2 4h，棄去上層液體，將下層沉澱用去離子水洗滌除去空膠束後，在超聲下加去離子水將樣品重新分散，過濾即得；
其中，步驟(I)中疏水型SPIO納米粒子、mal-PEG-PCL、有機溶劑和去離子水的用量比為，O. 5 I. 5mg :20 40mg :0· 5 I. 5ml :5 20ml。作為一種優選方案所述的mal-PEG-PCL-SPIO納米膠束是通過如下步驟製備得到
(1)將疏水型SPIO納米粒子和mal-PEG-PCL混合溶於四氫呋喃中，超聲下緩慢滴加到去離子水中，室溫下攪拌至四氫呋喃揮發完全；
(2)將上述溶液室溫下5000rpm離心30 min,除去下層大的聚集體；將上層溶液再用12000rpm離心3h，棄去上層液體，將下層沉澱用去離子水洗滌除去空膠束後，在超聲下加去離子水將樣品重新分散，用220nm水相濾頭過濾即得；
其中，步驟(I)中疏水型SPIO納米粒子、mal-PEG-PCL、四氫呋喃和去離子水的用量比 為，Img 30mg :1ml : IOml0作為一種優選方案所述的環狀五肽cRGD在與mal-PEG-PCL-SPIO混合前經過如下步驟處理將環狀五肽CR⑶溶解在含EDTA的HEPES緩衝液中，再向裡面加入羥胺；其中環狀五肽、HEPES緩衝液和羥胺的體積用量比為4飛Γ6 :1 2。作為一種優選方案所述的環狀五肽cRGD在與mal-PEG-PCL-SPIO混合前經過如下步驟處理將環狀五肽cRGD溶解在O. 5ml含10質量96EDTA的HEPES緩衝液中，再向裡面加入羥胺；其中環狀五肽、HEPES緩衝液和羥胺的體積用量比為5 5 :2。所述的單鏈抗體scFv-ErbB在與mal-PEG-PCL-SPIO混合前經過如下步驟處理1)將單鏈抗體scFv-Erb用EDTA溶液預處理l(T20min ；2)把巰基乙胺溶解在含EDTA的磷酸鹽緩衝液中，在(T8°C孵育l(T20min ;然後加入到步驟I)的溶液中，在3(T40°C孵育，超濾離心；其中步驟I)中單鏈抗體scFv-Erb和EDTA的用量比為Img :1 3μ ，其中步驟2)中巰基乙胺和磷酸鹽緩衝液的用量比為Ig :4飛ml。作為一種優選方案所述的單鏈抗體scFv-ErbB在與mal-PEG-PCL-SPIO混合前經過如下步驟處理I)將單鏈抗體scFv-Erb用0. 5 M的EDTA溶液預處理15 min ；2)把巰基乙胺溶解在含10μ 0.5 M EDTA的磷酸鹽緩衝液中，在4°C孵育15 min ;然後加入到步驟
I)的溶液中，在37°C孵育90 min，然後超濾離心3次；其中步驟I)中單鏈抗體scFv-Erb和EDTA的用量比為Img :2μ ，其中步驟2)中巰基乙胺和磷酸鹽緩衝液的用量比為Ig :5ml。一種利用本發明所述的製備方法製備得到的用於診斷乳腺癌的MRI對比劑即雙靶向 cRGD/scFv-ErbB-PEG-PCL-SPIO 納米膠束。所述環狀五肽cRGD和單鏈抗體scFv-ErbB可按任意體積比、質量比或摩爾比混
入
口 ο步驟(I)中所述的原料mal-PEG-PCL，由如下步驟合成採用活性陰離子聚合、以醇化鉀為引發劑合成烯丙基封端的聚乙二醇(AlIy 1-PEG-0H)，然後AlIy 1-PEG-0H變NH2-PEG-0H，這步反應是由雙鍵與2-氨基硫醇鹽酸鹽的自由基加成反應來完成；H2N-PEG-OH ( Mn = 2000 Da)溶解到飽和碳酸氫鈉水溶液中，冷卻到(TC，在強烈攪拌下加AN-甲氧基羰基馬來醯亞胺至上述溶液得到mal-PEG-ΟΗ ;用辛酸亞錫作為引發劑，引發己內酯開環，得到mal-PEG-PCL。本發明可通過優化納米膠束表面的環狀五肽cRGD與單鏈抗體scFv-ErbB兩種靶向配體的比例，製得100%環狀五肽cRGD、100%單鏈抗體ScFv-ErbB靶向、或50%環狀五肽cRGD和50%單鏈抗體scFv-ErbB靶向的MRI對比劑。負載疏水型SPIO納米粒子的PEG-PCL納米膠束(PEG-PCL-SPIO納米膠束)是通過如下步驟製備得到
(1)將疏水型SPIO納米粒子Img和PEG-PCL (即聚乙二醇-聚己內酯)30mg的混合物溶於I mL有機溶劑中，超聲下緩慢滴加到10 mL的去離子水中，室溫下攪拌至有機溶劑 車發完全；
(2)將上述溶液室溫下5000rpm離心30 min,除去下層大的聚集體；將上層溶液再用12000rpm離心3h，棄去上層液體，將下層沉澱用去離子水洗滌除去空膠束後，在超聲下加去離子水將樣品重新分散，過濾即得。—種利用本發明所述的製備方法製備得到的用於診斷乳腺癌的MRI對比劑即雙 靶向 cRGD/scFv-ErbB-PEG-PCL-SPIO 納米膠束。本發明具有如下有益效果
(I)本發明通過可生物降解的PEG-PCL納米膠束負載超順磁性鐵氧化物，用於製備高度靈敏和高特異性的磁共振顯像納米探針，聚乙二醇(PEG)與聚已內酯(PCL)等聚酯合成嵌段共聚物，形成膠束負載SPIO粒子，在PEG鏈端引入反應官能團馬來醯亞氨基團(mal-)，用於連接靶向癌細胞的特異配體，通過優化共聚物性質和組成，調控膠束尺寸和SPIO裝載效率，提高納米粒子的體內傳輸效果和安全性。(2)本發明在PEG-PCL-SPI0納米膠束表面引入環狀五肽cRGD或/和單鏈抗體scFv-ErbB，獲得對乳腺癌細胞及腫瘤新生血管內皮細胞的雙靶向功能(即分別針對整聯蛋白受體和HER-2兩個靶點)，通過發揮雙靶向功能分子1+1>2的效應，在腫瘤細胞及腫瘤新生血管部位獲得很高的局部膠束濃度，顯著提高腫瘤的MR顯影效果，提高特異性，實現乳腺癌的早期診斷。完成優化的MRI對比劑的臨床前安全性評價研究；
(3)本發明以可降解聚合物(PEG-PCL)膠束負載表面疏水的SPI0，可以使膠束成為一種高敏感性的MRI T2對比劑，通過結構控制，本發明所述的MRI對比劑的MRI敏感性顯著高於目前市場上的T2對比劑，聚合物膠束具有體內循環時間長的突出特點，合理的膠束結構設計可以減少膠束非特異性網狀內皮系統(例如肝、脾等)的吸收；而且通過在膠束表面引入祀向效果明確的環狀五肽cRGD和單鏈抗體scFv-ErbB,可以使聚合物膠束對腫瘤及其新生血管內皮細胞具有高度靶向傳輸功能，上述措施的共同作用使得膠束在腫瘤部位高濃度富集而提高顯像效果，促進對乳腺癌的早期診斷和治療，是一種用於乳腺癌早期診斷的新型高效靶向MRI對比劑。
圖I cRGD/scFv-ErbB-PEG-PCL-SPIO納米膠束的粒徑動態光散射分布 圖2負載疏水型SPIO納米粒子的PEG-PCL納米膠束透射電鏡形貌 圖3負載疏水型SPIO納米粒子的PEG-PCL納米膠束在血清中的穩定性 圖4負載疏水型SPIO納米粒子的PEG-PCL納米膠束磁滯回線 圖5負載疏水型SPIO納米粒子的PEG-PCL納米膠束與負載親水型SPIO納米粒子的PEG-PCL 納米膠束 MRI T2 Mapping 圖；圖6負載疏水型SPIO納米粒子的PEG-PCL納米膠束與負載親水型SPIO納米粒子的PEG-PCL納米膠束弛豫率回歸分析 圖7負載疏水型SPIO納米粒子的PEG-PCL納米膠束與負載親水型SPIO納米粒子的PEG-PCL納米膠束弛豫率回歸分析 圖 8cRGD/scFv-ErbB-PEG-PCL-SPI0 納米膠束動物實驗 MRI T2* 圖 9 cRGD/scFv-ErbB-PEG-PCL-SPIO 納米膠束圖。
具體實施例方式以下結合具體實施例來進一步解釋本發明，但實施例對發明不做任何形式的限
定。 實施例I mal-PEG-PCL-SPIO納米膠束的製備
(1)將疏水型SPIO納米粒子Img和mal-PEG-PCL 30mg的混合物溶於I mL四氫呋喃中，超聲下緩慢滴加到10 mL的去離子水中，室溫下攪拌至有機溶劑揮發完全；
(2)將上述溶液室溫下5000rpm離心30 min,除去下層大的聚集體；將上層溶液再用12000rpm離心3h，棄去上層液體，將下層沉澱用去離子水洗滌除去空膠束後，在超聲下加去離子水將樣品重新分散，用220nm水相濾頭過濾過濾即得。實施例2 cRGD-PEG-PCL-SPIO納米膠束的製備
(I)取O. 5mg環狀五肽cRGD溶解在O. 5ml含10%質量分數EDTA的HEPES緩衝液中，再向裡面加入O. 2ml羥胺，備用；(2) mal-PEG-PCL-SPIO納米膠束與經步驟(I)處理過的環狀五肽cRGD複合過夜，再超速離心除去游離的環狀五肽cRGD，用220nm水相濾頭過濾，製得cRGD-PEG-PCL-SPIO納米膠束。本實施例所用的環狀五肽cRGD英文名稱為cyclo (Arg-Gly-Asp-Phe-Lys),生產廠家為美國 Creative Peptides,分子式為 C27H41N9O7,規格為5mg。實施例3 scFv-ErbB-PEG-PCL-SPIO納米膠束的製備
(I)單鏈抗體 scFv-Erb 5mg 用 10 μ 0. 5 M 的 EDTA 溶液預處理 15 min;(2)把 O.lg巰基乙胺溶解在0. 5 mL含ΙΟμ Ο. 5 M EDTA的磷酸鹽緩衝液(PBS)中，在4°C孵育15 min ；然後加入到步驟(I)的溶液中，在37°C孵育90 min，然後超濾離心3次(用PBS洗滌含EDTA)，除掉過量的巰基乙胺；(3)經步驟I和2處理過的單鏈抗體scFv-Erb立即按照比例與mal-PEG-PCL-SPIO混合，在4°C放置過夜，即在mal-PEG-PCL-SPIO納米膠束表面引入單鏈抗體 scFv-Erb,製得 scFv-ErbB-PEG-PCL-SPIO 納米膠束。實施例4 cRGD/scFv-ErbB-PEG-PCL-SPIO 納米膠束的製備
(1)取0.5mg環狀五肽cRGD溶解在0. 5ml含10%質量分數EDTA的HEPES緩衝液中，再向裡面加入0. 2ml羥胺，備用；
(2)將單鏈抗體scFv-Erb5mg用10 μ 0. 5 M的EDTA溶液預處理15 min ;然後把0. Ig巰基乙胺溶解在0. 5 mL含 ομ ο. 5 M EDTA的磷酸鹽緩衝液(PBS)中，在4°C孵育15min ;再將上述處理過的單鏈抗體scFv-Erb和巰基乙胺混合,在37°C孵育90 min,然後超濾離心3次(用PBS洗滌含EDTA)，除掉過量的巰基乙胺；
(3)將經步驟(I)處理過的環狀五肽cRGD和經步驟(2)處理過的單鏈抗體scFv-Erb按體積比I :1混合，在4°C放置過夜，即製得cRGD/scFv-ErbB-PEG-PCL-SPIO納米膠束。本實施例所用的環狀五肽cRGD英文名稱為cyclo (Arg-Gly-Asp-Phe-Lys),生產廠家為美國Creative Peptides,分子式為 C27H41N9O7,規格為 5mg。實施例5負載疏水型SPIO納米粒子的PEG-PCL納米膠束(PEG-PCL-SPIO納米膠束)的製備
(1)將疏水型SPIO納米粒子Img和PEG-PCL 30mg的混合物溶於I mL有機溶劑中，超聲下緩慢滴加到10 mL的去離子水中，室溫下攪拌至有機溶劑揮發完全；
(2)將上述溶液室溫下5000rpm離心30 min,除去下層大的聚集體；將上層溶液再用12000rpm離心3h，棄去上層液體，將下層沉澱用去離子水洗滌除去空膠束後，在超聲下加去離子水將樣品重新分散，過濾即得。實施例6 cRGD/scFv-ErbB-PEG-PCL-SPIO納米膠束的粒徑動態光散射分布
用粒度測定儀檢測負載疏水型SPIO納米粒子的PEG-PCL納米膠束樣品的粒徑，入射激 光波長λ = 532 nm，入射角Θ = 90°，溫度為25°C ;粒徑值取三次測量值的平均值。粒徑對納米膠束在動物體內的循環時間也有影響，粒徑小，容易透過血腦屏障，不易被肝臟血竇吸收，所以循環時間相對較長，我們選用小粒徑納米膠束用來連接靶向分子做動物實驗體內循環顯像，製備出雙靶向cRGD/scFv-ErbB-PEG-PCL-SPIO納米膠束，粒徑數據為 39. 9 ±2. 3nm。實施例7負載疏水型SPIO納米粒子的PEG-PCL納米膠束透射電鏡形貌
膠束樣品的形貌用透射電鏡進行表徵，將製備好的膠束樣品稀溶液取一滴滴在純碳膜的銅網上，在室溫下放入乾燥器中乾燥。用型號為JEOL JEM-2010HR的透射電鏡下觀察，找樣品均勻濃度合適的區域拍照。從圖2可以看出，通過我們製備的窄分布的嵌段共聚物的樣品，製備膠束後，未經任何其它特殊處理得到的膠束粒徑在35nm左右分布比較均勻，這為我們製備較小粒徑的功能型納米顆粒提供了比較好的基礎。SPIO負載後的膠束粒徑略有增大，粒徑要增大5 10nm，但都保持了均勻分布，我們甚至能夠清晰的分辨出疏水內核中單個的SPIO納米粒子。聚合物連接靶向分子後，膠束粒徑與基本形貌沒有太大變化，驗證體系穩定性。實施例8負載疏水型SPIO納米粒子的PEG-PCL納米膠束在血清中的穩定性 膠束穩定性可以通過其在血清中粒徑變化來測量，納米膠束在血清中粒徑測試方法為
取lmg/ml濃度的樣品Iml,加入到IOml的10%胎牛血清中，分別間隔12h測一次粒徑變化，從圖3中可以看到，負載疏水型SPIO納米粒子的PEG-PCL納米膠束的粒徑變化不大，故再次驗證膠束穩定性很好。實施例9負載疏水型SPIO納米粒子的PEG-PCL納米膠束的磁滯回線
為了產生理想的MRI信號強度對比，所用的MRI造影劑應該具備在外加磁場撤出時能迅速將磁矩釋放。因此，SPIO被PEG-PCL膠束負載後能不能保留超順磁性是一個非常重要的參數。疏水型SPIO和兩個PEG-PCL-SPIO樣品的磁滯回線，測試溫度為10 K和300K。在10 K下,三個樣品都表現出鐵磁性(ferromagnetic),疏水型6 nm SPIO的矯頑磁力為240 Oe,小粒徑PEG-PCLlk-SPION和大粒徑PEG-PCL7k_SPI0Ns兩樣品的矯頑磁力分別為220 Oe和230 Oe0在室溫下，三個樣品都表現為超順磁性，零矯頑力和零淨磁化強度。疏水型6 nm SPIO的飽和磁化強度64. 7 Fe emu g_l，小粒徑PEG-PCLlk-SPION和大粒徑PEG-PCL7k-SPI0Ns兩樣品的飽和磁化強度分別為65. 6和64. 4 Fe emu g-1,10 K和300 K下的矯頑力和飽和磁化強度數據說明負載疏水型SPIO納米粒子的PEG-PCL納米膠束的磁化性能沒有改變。實施例10負載疏水型SPIO納米粒子的PEG-PCL納米膠束與負載水溶性SPIO納米粒子的PEG-PCL納米膠束磁共振成像(MRI) T2 Mapping及弛豫率回歸分析。通過測試含有膠束樣品的水溶液中質子的橫向和縱向弛豫時間(Tl和T2)考察了PEG-PCL聚合物膠束負載SPIO磁納米粒子做為MRI顯像試劑的靈敏度。MRI成像的基本原理是，水中質子沿著外加磁場的橫向和縱向的自旋弛豫動力學的局部差異產生圖像對比度差異。因此縮短質子縱向(自旋-晶格)弛豫時間(Tl)使在含造影劑的部位Tl加權信號變亮或縮短質子橫向(自旋-自旋)弛豫時間(T2)使在含造影劑的部位T2加權信號變暗可以增強正常組織很病變組織的明暗強度差異，改善圖片質量，提高病變的有效檢出率。MRI造影劑也根據作用在縱向弛豫度rl或橫向弛豫度r2的不同而分成兩種，一種是Tl造影劑，另一種是T2造影劑，其中rl影響縱向弛豫時間Tl，r2影響橫向弛豫時間T2。T2造影劑是
中負性MRI顯影劑，可以是組織的信號變暗。T2造影劑的r2和r2/ rl越高，其成像效果越好。我們用小分子表面活性劑把疏水型SPIO表面改性製備成水溶型的WSPIO用做對照樣品OPEG-PCL膠束負載的SPIO的r2均有所增強，而rl都有所減弱。水溶性鐵納米粒子(WSPIO)的 r2 為 40 Fe mM-ls-1、rl 為 3. 2 Fe mM-ls-1,小粒徑 PEG-PCLlk-SPION 的r2 為 108. I Fe mM-ls-1、rl 為 I. 7 Fe mM-ls-1，大粒徑 PEG-PCL7k_SPI0Ns 的 r2 為 221. 2Fe mM-ls-1、rl 為 2· I Fe mM-ls-1。這都導致了 PEG-PCL 膠束負載的 SPIO 的 r2/rl 值顯著增加，這暗示了 PEG-PCL負載的SPIO作為T2造影劑的靈敏度會顯著增強。實施例11 cRGD/scFv-ErbB-PEG-PCL-SPIO納米膠束的動物實驗
採用雌性裸鼠(體重25±3 g)做乳腺癌動物模型，10%水合氯醛麻醉狀態下注射200 μ L無血清ΒΤ474細胞培養液(含腫瘤細胞I X 107個)構建皮下移植腫瘤模型，移植瘤長到直徑為3-5_時用於MRI顯像。樣品調成O. 9%NaCl的溶液，通過尾靜脈注射進入裸鼠體內，應用劑量為10 mg Fe/kg0 MRI掃描儀為荷蘭產的Philips Inter，磁場強度為I. 5T，測試用上海晨光醫療科技有限公司生產的246 mmX106mmX131mm老鼠用線性極化鳥籠射頻核磁共振線圈。尾靜脈注射樣品後用場回波-梯度回波(FFE-GRE)梯度回波T2加權成像，參數設置如下TR/TE, 200/14. 7 ms ;翻轉角度，25度，FOV，80 mm ;矩陣，256 X 256，切片厚度，I mm，記錄不同時間點裸鼠腫瘤MRI信號強度值。腫瘤內MRI成像T2弛豫時間測試採用單區域多自旋迴波(2000/144)方法，梯度回波時間，八梯共18-144 ms ;回波間距，18ms ； F0V, 80 mm;矩陣，256X256，切片厚度I mm。由廠家提供的軟體用最小二乘回歸的方法計算出T2 maps，觀察雙靶向組腫瘤內的信號強度。膠束樣品注射前Oh到注射後5h內後老鼠乳腺癌病灶部位T2-加權圖像均變暗，說明膠束在腫瘤內持續性累積，更重要是老鼠T2-加權圖像強烈的證明了小粒徑的雙靶向樣品cRGD/scFv-ErbB-PEG-PCL-SPIO納米膠束(圖8信號值從Oh的I. 59降低至5h的O. 48)樣品的腫瘤內的吸收增強，而靶向腫瘤內的吸收增強，同時靶向樣品信號降低程度明顯降低程度強，與非靶向造影劑相比，靶向特異性膠束能夠更早地檢測到腫瘤的生成充分驗證了聚合物發揮雙靶向分子的協同增效作用，提高MRI對比劑的敏感度和特異性，從而促進MRI在乳腺癌早期診斷中的應用。
實施例12 cRGD/scFv-ErbB-PEG-PCL-SPIO納米膠束血液半衰期實驗
本研究用原子吸收分光光度法測定血液中鐵含量變化並計算負載疏水型SPIO納米粒子的PEG-PCL納米膠束的tl/2。血液樣品用10%HCL溶解5d，通過原子吸收分光光度計測
鐵含量。超小型超順磁氧化鐵粒子(USPIO)的體內半衰期為200min，而我們所製備的對比劑由於將粒徑控制在40nm以下，而且經PEG-PCL包裹，使體內半衰期延長至300min小時以上，不僅有利於將更多的磁性粒子輸送到腫瘤部位，進行腫瘤的早期診斷，而且也是一種極佳的血池型對比劑。在不同的磁場內，該對比劑信噪比(signal noise ratio, SNR)及對比噪聲比(contrast noise ratio, cNR)在平衡期均下降緩慢,形成一個較長的平臺期,這一特點可明顯提高平臺期的SNR和CNR，有利於進行高分辨成像，所以本研究合成的納米膠束是一種性能優良的MRI對比劑，該納米膠束經過單鏈抗體scFv-ErbB表面修飾後，血液半衰期大大延長，具有潛在應用價值。具體數據見表I。
表 I cRUD KcFv-ErbB-PEG-PCL-SPIi 納米膠束的ifiift豐衰期 ￥K 兩+ I * iff/S 含■ c itg/nil.)
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I3:4431,6實施例13負載疏水型SPIO納米粒子的PEG-PCL納米膠束溶血實驗
血細胞懸液的配製取兔血5ml，加入潔淨乾燥的小燒杯中，用玻棒輕輕攪拌除去纖維蛋白原。加入0.9%氯化鈉溶液約10倍量,搖勻，離心15分鐘(1500r/min)、傾去上清液，反覆3次至上清液呈無色為止。量取血球0. 7ml，加生理鹽水稀釋至35ml，成2%的混懸液供試驗用。本實驗採用採用新鮮兔血作為研究對象。液溶血試驗觀察取試管7支，按下列順序加入各種溶液，第I到第5管為受試物管，納米膠束濃度為10mg/ml，l-6號管依次為0. ImUO. 2ml,0. 3ml,0. 4ml,0. 5ml，7號管為陰性(生理鹽水)對照管，8號管為(蒸餾水)陽性對照管。依次加入2%紅細胞懸液、生理鹽水和蒸餾水後輕輕搖勻，立即置37°C恆溫箱中進行溫育。觀察並記錄0min、15min、30min、45min、lh、2h、3h 的結果。如溶液變清並染紅色，即表示溶血，必要時可用顯微鏡觀查紅細胞是否破裂。如候選藥物0. 3ml，在0. 5h內引起溶血者即不宜作注射用。最好是候選藥物在0. 3ml，3h內不引起溶血。溫育15min後，受試物的8號試管中(陽性對照)溶液皆呈較澄明紅色，管底有少許紅細胞殘渣，表明有溶血發生。至3h時，受試物管與陰性對照管均未見溶血現象。顯微鏡下觀察1_6 號(0.2 mg/ml>0. 4 mg/ml、0.6 mg/ml、0.8 mg/ml、1.0 mg/ml>5 mg/ml)受:試物管內溶液紅細胞形態未見異常；6號管(生理鹽水管)內溶液紅細胞形態未見異常。7號管(蒸餾水管)可見少量紅細胞，但視野內大多為變形紅細胞及碎片，未見不能分散沉澱。通過試驗結果表明7號陽性對照管有溶血發生。7號陰性對照管無溶血發生。1-6號受試物管中無溶血現象以及凝聚發生。受試物管中的溶液在3小時內未發生溶血。吸取上清液，置分光光度計比色皿中，於545 nm處測量吸光度，也未見明顯變化。因此，據實驗結果認為 5 mg/ml納米膠束濃度不會引起溶血反應。
權利要求
1.一種用於診斷乳腺癌的MRI對比劑的製備方法，其特徵在於包括如下步驟 Cl)以疏水型超順磁性鐵氧化物納米粒子即疏水型SPIO納米粒子和馬來醯亞氨基聚乙二醇-聚己內酯即mal-PEG-PCL為原料，製備負載疏水型SPIO納米粒子的mal-PEG-PCL納米膠束即mal-PEG-PCL-SPIO納米膠束； (2)在mal-PEG-PCL-SPIO納米膠束表面引入環狀五肽cRGD或/和單鏈抗體scFv-ErbB,其引入方法包括如下步驟將環狀五肽cRGD或/和單鏈抗體scFv-ErbB與mal-PEG-PCL-SPIO混合，放置過夜，即在mal-PEG-PCL-SPIO納米膠束表面弓I入單鏈抗體scFv-Erb或/和單鏈抗體scFv-ErbB,製得用於診斷乳腺癌的MRI對比劑即雙祀向cRGD/scFv-ErbB-PEG-PCL-SP IO 納米膠束。
2.根據權利要求I所述的製備方法，其特徵在於步驟(I)中所述的馬來醯亞氨基聚乙二醇-聚己內酯中的聚乙二醇一聚己內酯為兩嵌段共聚物，其中聚乙二醇一聚己內酯段的數均分子量分別為2KD和IKD ;步驟(2)中所述的放置過夜，是指在4°C下放置過夜。
3.根據權利要求I所述的製備方法，其特徵在於所述的mal-PEG-PCL-SPIO納米膠束是通過如下步驟製備得到 (1)將疏水型SPIO納米粒子和mal-PEG-PCL混合溶於有機溶劑中，超聲下緩慢滴加到去離子水中，室溫下攪拌至有機溶劑揮發完全； (2)將上述溶液在室溫下4000 6000rpm離心20 40 min,除去下層大的聚集體；將上層溶液再用1000(Tl5000rpm離心2 4h，棄去上層液體，將下層沉澱用去離子水洗滌除去空膠束後，在超聲下加去離子水將樣品重新分散，過濾即得； 其中，步驟(I)中疏水型SPIO納米粒子、mal-PEG-PCL、有機溶劑和去離子水的用量比為，O. 5 I. 5mg :20 40mg :0· 5 I. 5ml :5 20ml。
4.根據權利要求3所述的製備方法，其特徵在於所述的mal-PEG-PCL-SPIO納米膠束是通過如下步驟製備得到 (1)將疏水型SPIO納米粒子和mal-PEG-PCL混合溶於四氫呋喃中，超聲下緩慢滴加到去離子水中，室溫下攪拌至四氫呋喃發完全； (2)將上述溶液室溫下5000rpm離心30 min,除去下層大的聚集體；將上層溶液再用12000rpm離心3h，棄去上層液體，將下層沉澱用去離子水洗滌除去空膠束後，在超聲下加去離子水將樣品重新分散，用220nm水相濾頭過濾即得； 其中，步驟(I)中疏水型SPIO納米粒子、mal-PEG-PCL、四氫呋喃和去離子水的用量比為，Img 30mg Iml : IOml0
5.根據權利要求I所述的製備方法，其特徵在於所述的環狀五肽cRGD在與mal-PEG-PCL-SPIO混合前經過如下步驟處理將環狀五肽cRGD溶解在含EDTA的HEPES緩衝液中，再向裡面加入羥胺；其中環狀五肽、HEPES緩衝液和羥胺的體積用量比為4飛Γ6 I 2。
6.根據權利要求5所述的製備方法，其特徵在於所述的環狀五肽CR⑶在與mal-PEG-PCL-SPIO混合前經過如下步驟處理將環狀五肽cRGD溶解在0. 5ml含10%質量分數EDTA的HEPES緩衝液中，再向裡面加入羥胺；其中環狀五肽、HEPES緩衝液和羥胺的體積用量比為5 5 :2。
7.根據權利要求I所述的製備方法，其特徵在於所述的單鏈抗體scFv-ErbB在與mal-PEG-PCL-SPIO混合前經過如下步驟處理1)將單鏈抗體scFv_Erb用EDTA溶液預處理l(T20min ；2)把巰基乙胺溶解在含EDTA的磷酸鹽緩衝液中，在0 8°C孵育l(T20min ;然後加入到步驟I)的溶液中，在3(T40°C孵育，超濾離心；其中步驟I)中單鏈抗體scFv-Erb和EDTA的用量比為lmg:l^^L，其中步驟2)中巰基乙胺和磷酸鹽緩衝液的用量比為lg 4 6ml。
8.根據權利要求7所述的製備方法,其特徵在於所述的單鏈抗體scFv-ErbB在與mal-PEG-PCL-SPIO混合前經過如下步驟處理1)將單鏈抗體scFv-Erb用O. 5 M的EDTA溶液預處理15 min ；2)把巰基乙胺溶解在含ΙΟμ O. 5 M EDTA的磷酸鹽緩衝液中 ，在4°C孵育15 min ;然後加入到步驟I)的溶液中,在37°C孵育90 min，然後超濾離心3次；其中步驟I)中單鏈抗體scFv-Erb和EDTA的用量比為Img :2μ ，其中步驟2)中巰基乙胺和磷酸鹽緩衝液的用量比為Ig飛ml。
9.權利要求Γ8任一項所述的製備方法製備得到的用於診斷乳腺癌的MRI對比劑即雙靶向 cRGD/scFv-ErbB-PEG-PCL-SPIO 納米膠束。
全文摘要
本發明公開了一種用於診斷乳腺癌的MRI對比劑及其製備方法。其製備方法，包括如下步驟(1)以疏水型SPIO納米粒子和mal-PEG-PCL為原料，製備mal-PEG-PCL-SPIO納米膠束；(2)在mal-PEG-PCL-SPIO納米膠束表面引入環狀五肽cRGD或/和單鏈抗體scFv-ErbB。製備得到的用於診斷乳腺癌的MRI對比劑在敏感度和特異性上均高於現有的MRI對比劑。
文檔編號A61K49/18GK102935241SQ201210474720
公開日2013年2月20日 申請日期2012年11月21日 優先權日2012年11月21日
發明者帥心濤, 鞏發明, 章作銓, 程度, 於行素 申請人:中山大學