一種人鼻咽癌腫瘤幹細胞系建立方法
2023-06-14 13:45:06 1
專利名稱：一種人鼻咽癌腫瘤幹細胞系建立方法
技術領域：
本發明涉及生物及醫學領域，具體地，本發明涉及一種人鼻咽癌腫瘤幹細胞系建立方法。
背景技術：
鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是指鼻咽腔表面的上皮或鼻咽隱窩上皮發生的上皮性惡性腫瘤。鼻咽癌發病具有地方性特點，我國是世界上鼻咽癌發病率最高的國家，而華南地區，尤其是廣東及其臨近地區如廣西、香港等地是高發病區，發病率比其它大部分國家地區高100倍以上，因此也有「廣東瘤」之稱。目前鼻咽癌的發病機理尚不明確，有待進一步深入研究。幹細胞(stem cell)是存在於動物和人的一種特殊功能細胞，具有多種分化能力和自我更新能力。幹細胞生物學特性包括(I)全能性或多功能性，幹細胞具有分化為多種類型細胞的潛能；(2)自我更新能力，幹細胞一旦形成，在機體終生都具有自我更新能力，通過不均一分裂進行自我更新和產生分化祖細胞，維持機體組織器官的穩定性；(3)高度增殖能力，對於維持機體正常功能有著重要的作用。腫瘤幹細胞(tumor stem cells，TSC)，也稱為癌幹細胞，為一種特殊類型的幹細胞，TSC因為在各種致瘤因素的作用下，在基因水平失去對其生長的正常調控，而表現出無限增殖、轉移、異質性等特點。腫瘤幹細胞與幹細胞有很多相似的特徵(I)都具有無限增殖和分化的特點；(2)存在相似的調節自我更新的信號傳導途徑；(3)都具有不同表型，異質性；(4)都具有端粒酶活性，都能轉移到各種不同的組織且有相似的歸巢和轉移途徑。當然，TSC還具有不同於幹細胞的特點(I)自我更新信號轉導途徑的負反饋機制已被破壞；
(2)缺乏分化成熟能力；(3)傾向於累積複製的錯誤，而幹細胞能夠防止複製錯誤的發展
坐寸o從腫瘤幹細胞角度入手，對於鼻咽癌發病機理，診斷治療方案等都可帶來積極的推動作用。而目前對於鼻咽癌腫瘤幹細胞系的建立及相關理論研究並不多見。
發明內容
針對目前鼻咽癌發病率高的問題，本發明提供一種建立人鼻咽癌腫瘤幹細胞系的方法，以對鼻咽癌的診斷治療起到推動和促進作用。本發明的目的通過以下技術手段得以實現
一種人鼻咽癌腫瘤幹細胞系的建立方法，包括以下步驟
(1)獲得單細胞狀態的人鼻咽癌細胞；
(2)將步驟(I)得到的單細胞狀態的人鼻咽癌細胞加入含表皮生長因子和鹼性成纖維細胞生長因子的無血清幹細胞培養基中，得單細胞懸液；
(3)將步驟(2)中的單細胞懸液濃度調整至900 1100/ml；
(4)將步驟(3)得到的單細胞懸液接種於細胞培養板中，再加入等體積幹細胞培養基進行培養72 96h ；
(5)收集步驟(4)所得細胞，胰酶消化至單個細胞並進行傳代培養。
本發明提供的鼻咽癌幹細胞系建立方法，操作簡便，得到的鼻咽幹癌細胞系具有較強的克隆形成能力，具有較強的藥物耐受性，較高的乾性因子表達量，且對裸鼠有較強的致瘤能力，可用於鼻咽癌幹細胞的發病機理和診斷治療方面的研究。
圖I為本發明實施例中使用不同鼻咽癌細胞CNE-2、SUNE-1、H0NE_1得到的球形成率；
圖2顯示了本發明實施例中使用的鼻咽癌細胞CNE-2與CNE-2s的細胞形態；
圖3為本發明實施例中鼻咽癌細胞CNE-2與CNE-2s的克隆形成率比較；
圖4為本發明實施例中鼻咽癌細胞CNE-2與CNE-2s對吉西他濱的耐受性比較；
圖5為本發明實施例中鼻咽癌細胞CNE-2與CNE-2s表達乾性因子的RT-PCR檢測結果，其中柱狀圖中左側為CNE-2，右側為CNE-2s ；
圖6為本發明實施例中鼻咽癌細胞CNE-2與CNE-2s對於裸鼠致瘤能力的比較。
具體實施例方式以下將結合附圖通過具體實施例對本發明進行詳述，應理解此處所述實施例僅出於解釋本發明的目的而非對其進行限制。本發明提供一種人鼻咽癌腫瘤幹細胞系的建立方法，包括以下步驟
(1)獲得單細胞狀態的人鼻咽癌細胞；
(2)將步驟(I)得到的單細胞狀態的人鼻咽癌細胞加入含表皮生長因子和鹼性成纖維細胞生長因子的無血清幹細胞培養基中，得單細胞懸液；
(3)將步驟(2)中的單細胞懸液濃度調整至900 1100/ml；
(4)將步驟(3)得到的單細胞懸液接種於細胞培養板中，再加入等體積幹細胞培養基進行培養72 96h ；
(5)收集步驟(4)所得細胞，胰酶消化至單個細胞並進行傳代培養。本發明實施例中使用的人鼻咽癌細胞優選為對數生長期的細胞，對數生長期是指細胞在培養環境下經過了短暫的適應期，進而快速生長的時期，此時期營養充足，細胞處於最佳生長狀態。在本發明實施例的培養選取及後來的檢測鑑定中均選取對數生長期的細胞。更優選地，本發明實施例中使用的鼻咽癌細胞為CNE-2、SUNE-1或H0NE-1，更優選為CNE-2。其中CNE-2、SUNE-I或H0NE-1為低分化的鼻咽癌細胞，即惡性程度較高的鼻咽癌細胞，而在此三種鼻咽癌細胞中CNE-2的惡化程度最高。優選地，本發明實施例腫瘤幹細胞篩選過程中使用的無血清幹細胞培養基為DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle’s Medium/ Nutrient Mixture F12)。該 DMEM/F12培養基由DMEM和F12按I: I的體積比混合而成，該培養基能夠在很多無血清培養體系中完美地支持細胞生長。該培養基可從市場購得。優選地，本發明實施例中使用的無血清幹細胞培養基中含有表皮生長因子(EGF)和鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)。表皮生長因子(EGF)是一種廣泛存在於人或其它動物體內的小分子多肽，極微量即能強烈刺激細胞生長、抑制衰老基因的出現，延緩表皮細胞衰老。表皮生長因子可激活多種下遊信號路徑，產生多種生物學效應，ras-raf-MEK-erk/MAPK途徑與增殖的激活有關，P13K-PKC-IKK途徑與細胞移動性的增強有關。鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)是含155個胺基酸的促有絲分裂的陽離子多肽，分子量為16 18. 5 KD。bFGF的生物學作用極其廣泛，它在血管形成、促進創傷癒合與組織修復、促進組織再生和神經組織生長發育過程中起著十分重要的作用。本發明實施例中使用的無血清幹細胞培養基中兩者的濃度均為10 30ng/ml,最優選的濃度為20ng/ml。優選地，本發明實施例步驟(3)中調整細胞濃度通過血球計數板進行計數，調整後細胞濃度優選為1000/ml。細胞培養過程中，接種濃度過高會導致細胞生長一段時間後生長空間減少，最後細胞接觸產生抑制細胞活性，不利於細胞達到最佳狀態，而接種濃度過低會導致生長周期過長，延長了實驗時間。優選地，本發明實施例步驟(4)中使用的細胞培養板為六孔板，向每孔中加入的單 細胞懸液的量為I 2ml/孔，優選濃度為Iml/孔。優選地,本發明實施例步驟(5)中使用的胰酶濃度為0. 2 0. 3%，胰酶的最優選濃度為0. 25%。實施例一鼻咽癌球形成細胞的獲得
1.將鼻咽癌細胞CNE-2、SUNE-UH0NE-1以含10% FBS(胎牛血清，Gibco)加雙抗的DMEM/F12 (Gibco)培養基置於37°C，5%C02 培養箱內培養；
2.分別選取對數生長期的鼻咽癌細胞CNE-2、SUNE-1、H0NE-1，用質量體積百分比濃度為0. 25%的胰酶消化為單細胞懸液，加適量含血清培養基終止胰酶消化作用，IOOOrpm離心5min，棄上清液，加入Iml的含表皮生長因子EGF和鹼性成纖維細胞生長因子bFGF的無血清幹細胞培養基，混勻，該培養基為DMEM/F12，其中EGF和bFGF的終濃度均為20ng/ml ；
3.細胞計數取20ul與20ul臺盼藍取混合後，取細胞計數板衝池，並計數四個大方格的細胞總數，細胞濃度為細胞數/ml=(四個大個細胞總數/4)2X 104，計數後將細胞濃度調整為1000/ml ；
4.取低黏附性六孔平板，將單細胞懸液以Iml/孔接種，再向每孔中加入Iml無血清幹細胞培養基，37°C，5% CO2培養箱內培養2周，在顯微鏡下計數球形成細胞數量；
5.收集步驟4得到的球形成細胞，2000rpm離心5min,加入2ml磷酸緩衝液PBS清洗球形成細胞一次，加入Iml 0. 25%胰酶，得到絮狀物，此時用槍頭吹打為混懸液，放入37°C，5% CO2細胞培養箱內繼續孵育5min，取出繼續吹打幾次，顯微鏡下觀察為單個細胞懸液時，用含血清培養基終止消化，2000rpm 離心5min，棄上清液，加入Iml的幹細胞培養基混懸細胞，並計數，計數方法同步驟3。6.將步驟5得到的細胞濃度調節為1000/ml，以2ml/孔接種於低粘附性六孔板於37°C, 5% CO2培養箱內培養14天，普通光學顯微鏡下計數各孔球形成細胞數量。結果如圖I所示，得到的球形成細胞分別標記為CNE-2s、SUNE-Is、HONE-1 s，CNE2與CNE_2s細胞形態如圖2所示(其餘兩種對比圖未顯示)。結果如圖I所示,鼻咽癌細胞CNE-2中含有最高比例的球形成細胞,之後依次為H0NE-1和SUNE-1，因此本發明實施例中將從鼻咽癌細胞CNE-2、H0NE-1和SUNE-I中分選出鼻咽癌球形成細胞CNE-2s，並以CNE-2為對照，對CNE-2s進行腫瘤幹細胞各項指標的檢測，實驗步驟及相應結果見實施例二至實施例五。實施例二鼻咽癌球形成細胞克隆形成能力檢測
I.配製I. 2%和0. 6%瓊脂溶液，高壓滅菌，自然冷卻至約450C。2.將含PBS (0. 01M)和雙抗(青黴素的工作濃度為100U/ml，鏈黴素的工作濃度為 0.lmg/ml)的DMEM/F12培養基放入37°C水浴箱，溫浴至37°C ；
3.分別取對數生長期鼻咽癌球形成細胞鼻咽癌球形成細胞CNE-2s、HONE-Is和SUNE-Is,以及用作參照的鼻咽癌細胞CNE-2、H0NE-1和SUNE-1，分別用0. 25%胰蛋白酶消化並輕輕吹打，使之成為單細胞，作細胞計數，用含20%胎牛血清的DMEM/F12培養基調整細胞密度至I X IO6細胞/mL。然後作梯度倍比稀釋為104/mL ；
4.按I:I比例使I. 2%的瓊脂糖和2 X DMEM培養基(含有2 X抗生素和20%的胎牛血清)混合後，以2mL/孔混合液注入六孔平板內，冷卻凝固，置37°C，5% CO2培養箱中備用。5.按I: I比例將0. 6%的瓊脂糖和2 X DMEM培養基在無菌試管中混勻4. 2mL，再向管中分別加入0. 3mL步驟3中獲得的104/mL細胞懸液，充分混勻，分別將懸液以約1000個/孔注入步驟4中獲得的六孔平板內形成雙瓊脂層，待上層瓊脂凝固後，置入37°C 5%C02培養箱中培養21天；
6.把平皿放置在倒置顯微鏡下，觀察細胞克隆數。按下式計算克隆形成率，實驗結果取三次實驗平均值。
克隆形成率=(克隆形成數/接種細胞數)X100%
結果 與CNE-2相比，實施例一獲得的CNE-2S具有較強的克隆形成能力，如圖3所示。實施例三鼻咽癌球形成細胞對抗腫瘤藥物吉西他濱的耐藥性
1.配製100iimol/mL吉西他濱溶液
吉西他濱分子量為299. 66，即29.966 mg/mL = 0. lmol/L，因此稱取0. 2997g吉西他濱溶解於10ml DMEM/F12培養基中，過濾除菌，4°C保存備用；
2.分別收集對數生長期鼻咽癌球形成細胞CNE-2s、H0NE-ls和SUNE-ls，以及用作參照的鼻咽癌細胞CNE-2、H0NE-1和SUNE-1，並消化為單細胞懸液，對細胞計數，計數步驟同實施例一中步驟3，將細胞濃度調整為3X 104/mL ；
3.MTT檢測兩類細胞對吉西他濱的敏感性
(1)取對數生長期鼻咽癌球形成細胞CNE-2s、HONE-Is和SUNE-ls，以及鼻咽癌細胞CNE-2、H0NE-1和SUNE-1，各IOOul加入96孔培養板，分別加入以下濃度吉西他濱100 u I :0. Immol/L、0. 2 mmol /1,.0. 39 mmol /1,.0. 78 mmol/L> I. 56 mmol/L>3. 13 mmol /I,、
6.25 mmol/L、12.5 mmol/L、25 mmol/L、50 mmol/L,37 °C, 5% CO2，孵育 24 72h ;
(2)加入20ill MTT，繼續孵育4h，IOOOrpm離心5min，棄上清液，加入150 yl DMS0，搖床混勻lOmin，酶標儀測定吸光度，以檢查細胞存活率；
結果與CNE-2相比，實施例一獲得的CNE-2s具有較強的吉西他濱藥物耐受性，如圖4所示。實施例四RT-PCR法檢測乾性因子表達 I.按下表I進行引物設計
表I
權利要求
1.一種人鼻咽癌腫瘤幹細胞系的建立方法，包括以下步驟 (1)獲得單細胞狀態的人鼻咽癌細胞； (2)將步驟(I)得到的單細胞狀態的人鼻咽癌細胞加入含表皮生長因子和鹼性成纖維細胞生長因子的無血清幹細胞培養基中，得單細胞懸液； (3)將步驟(2)中的單細胞懸液濃度調整至900 1100個/ml； (4)將步驟(3)得到的單細胞懸液接種於細胞培養板中，再加入等體積幹細胞培養基進行培養72 96h ； (5)收集步驟(4)所得細胞，胰酶消化至單個細胞並進行傳代培養。
2.如權利要求I所述的人鼻咽癌腫瘤幹細胞系的建立方法，其特徵在於，所述步驟(I)中使用的人鼻咽癌細胞為對數期人鼻咽癌細胞。
3.如權利要求I所述的人鼻咽癌腫瘤幹細胞系的建立方法，其特徵在於，所述步驟(I)中使用的人鼻咽癌細胞為CNE-2、SUNE-I或HONE-I。
4.如權利要求I或3所述的人鼻咽癌腫瘤幹細胞系的建立方法，其特徵在於，所述步驟(I)中使用的人鼻咽癌細胞為CNE-2。
5.如權利要求I所述的人鼻咽癌腫瘤幹細胞系的建立方法，其特徵在於，所述無血清幹細胞培養基為DMEM/F12。
6.如權利要求I所述的人鼻咽癌腫瘤幹細胞系的建立方法，其特徵在於，所述含表皮生長因子和鹼性成纖維細胞生長因子的無血清幹細胞培養基中表皮生長因子和鹼性成纖維細胞生長因子的濃度均為10 30 ng/ml。
7.如權利要求I所述的人鼻咽癌腫瘤幹細胞系的建立方法，其特徵在於，所述步驟(4)中的所述細胞培養板為六孔板。
8.如權利要求7所述的人鼻咽癌腫瘤幹細胞系的建立方法，其特徵在於，向所述六孔板中加入的單細胞懸液的量為I 2ml/孔。
9.如權利要求I所述的人鼻咽癌腫瘤幹細胞系的建立方法，其特徵在於，所述步驟(5)中的所述胰酶的質量體積百分比濃度為0. 25%。
全文摘要
本發明提供一種人鼻咽癌腫瘤幹細胞系的建立方法，包括(1)獲得單細胞狀態的人鼻咽癌細胞；(2)將步驟(1)得到的單細胞狀態的人鼻咽癌細胞加入含表皮生長因子和鹼性成纖維細胞生長因子的無血清幹細胞培養基中，得單細胞懸液；(3)將步驟(2)中的單細胞懸液濃度調整至900～1100個單細胞/ml；(4)將步驟(3)得到的單細胞懸液1ml接種於細胞培養板六孔板單孔中，再加入等體積幹細胞培養基進行培養72～96h；(5)收集步驟(4)所得細胞，胰酶消化至單個細胞並進行傳代培養。本發明提供的鼻咽癌幹細胞系建立方法，操作簡便，得到的鼻咽幹癌細胞系的幹細胞特徵明顯。
文檔編號C12N5/095GK102732484SQ201210238190
公開日2012年10月17日 申請日期2012年7月10日 優先權日2012年7月10日
發明者冀天星, 周克元, 張鑫, 李彩虹, 李濤, 林碧華, 黃穎 申請人:廣東醫學院