人源蛋白hCINAP及其基因在抗癌藥物研發中的應用的製作方法

2023-06-14 08:23:01

人源蛋白hCINAP及其基因在抗癌藥物研發中的應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了人源蛋白hCINAP及其基因在抗癌藥物研發中的應用。本發明的研究成果揭示了hCINAP在核糖體18S?rRNA加工中的重要作用，同時在個體水平上發現hCINAP參與腫瘤的形成，降低該基因的表達將抑制腫瘤的生長，因此，hCINAP蛋白及其基因可以作為篩選抗癌藥物的靶標，以hCINAP為藥物靶標，通過靶向性治療的手段可以抑制癌細胞的生長和增殖，從而延長癌症患者的壽命。
【專利說明】人源蛋白hC I NAP及其基因在抗癌藥物研發中的應用

【技術領域】
[0001]本發明涉及生物醫藥領域，具體來說是人源蛋白hCINAP(全稱human coilininteracting nuclear ATPase protein)在抗癌藥物研發中的應用。

【背景技術】
[0002]癌症是威脅人類健康的一大殺手。目前，由於生活習慣、飲食和生存環境等諸多因素的影響，人類癌症發病率和死亡率仍成上升趨勢。很多患者因得不到有效的救治而死亡。因此，開展對癌症的科學研究，尋找靶向性藥物，已成為關係國計民生的重大問題，刻不容緩！
[0003]癌症研究一直是生命科學研究領域的重點和熱點。而對抑癌基因p53的研究更是重中之重，原因是該蛋白與細胞周期、細胞凋亡密切相關。而癌細胞多數已失去了正常細胞的特性，能多無限的增值，因此，抑制癌細胞的增值、促進其凋亡已成為抑制腫瘤生長的關鍵，而P53是實現這一目標的重要靶點。
[0004]尋找能夠增強p53穩定性的蛋白是一條有效的途徑。目前，大量文獻表明，核糖體蛋白不僅能夠參與核糖體的組裝，某些核糖體亞基蛋白可以通過RP-Mdm2-p53通路來調節P53蛋白的水平和細胞的生長。當細胞受到一定的脅迫刺激時，核糖體的正常組裝受阻，某些核糖體亞基蛋白，包括核糖體大亞基蛋白RPL11、RPL5、RPL23、RPL26及核糖體小亞基蛋白RPS7會由核仁進入核質和胞質中，與p53發生泛素化降解的E3HDM2發生相互作用，進而抑制HDM2對p53的泛素化降解，增強p53穩定性和活性，最終阻滯細胞周期進程並促進細胞凋亡。由此可見，核糖體蛋白在增強P53穩定性方面發揮著重要的作用，那麼，是否還有更多的核糖體蛋白同樣具有此類功能，同時，哪些分子可以調控核糖體蛋白，進而影響P53蛋白的穩定性和活性也是一個極為重要的問題。
[0005]hCINAP，是一個新鑑定的、既具有腺苷酸激酶活性又具有ATPase活性的人源蛋白，它廣泛存在於真核生物基因組中，但有關其功能報導的文獻卻很少。發明人所在實驗室在前期工作的基礎上，發現該蛋白可以通過調控核糖體蛋白RPS14的亞細胞定位，影響RPS14與HDM2的結合，進而影響p53的穩定性和活性。進一步，發明人發現hCINAP在核糖體18SrRNA的剪接中也發揮著重要作用，降低hCINAP的表達會抑制18S rRNA的剪接和40S小亞基的組裝，最終導致80S核糖體和多聚核糖體數目的減少。裸鼠成瘤實驗表明，當利用RNAi幹涉敲低hCINAP的表達水平時，裸鼠將不再成瘤。
[0006]基於發明人的一系列研究成果，發現hCINAP是一個非常重要的抑癌標靶，在抗癌藥物設計上具有較好的應用前景，因此提出申請。


【發明內容】

[0007]本發明的目的在於提供hCINAP (Access1n N0.NP_057367)及其基因在抗癌藥物中的應用前景。本發明的前期工作對hCINAP以及它在果蠅、擬南芥、線蟲的同源蛋白的腺苷酸激酶的特性、亞細胞定位、生物學功能等進行了初步研究，發現hCINAP在細胞核和細胞質中均有分布。更為重要的是，在酵母中，敲除hCINAP後將導致酵母致死，利用RNAi方法敲低人的hCINAP蛋白和它在線蟲中的同源蛋白的表達時，細胞生存率明顯降低，並且線蟲生長緩慢，表明hCINAP在細胞和線蟲的生長中起著重要的作用。
[0008]本發明的前期工作發現，hCINAP的過表達可以降低p53穩定性。首先用hCINAP的抗體在HEK 293T細胞裂解液中進行免疫沉澱，並對特異性條帶進行質譜分析，識別了可能與hCINAP相互作用的RPS14等核糖體亞基蛋白，並通過免疫共沉澱和體外pull down實驗驗證了 hCINAP與RPS14之間的相互作用。同時，發明人還發現RPS14也能夠與HDM2相互作用，並抑制HDM2調控的p53的降解，從而增強p53蛋白穩定性。
[0009]目前，已有研究報導類泛素分子NEDD8能夠通過調節RPLll的Neddylat1n (類泛素化修飾)水平來影響其定位和穩定性，進而調控P53蛋白的活性。在本發明中，發明人發現RPS14同RPLll —樣也可以被多聚NEDD8修飾。RPS14的Neddylat1n對其定位在核仁內是必需的。發明人發現，過表達hCINAP將導致RPS14 Neddylat1n減弱，亞細胞定位實驗結果表明，過表達hCINAP將會使RPS14在核仁內的定位消失。該結果說明，hCINAP可以通過影響RPS14 Neddyalat1n來調控RPS14的亞細胞定位和穩定性。
[0010]在此基礎上，發明人進一步研究了 hCINAP是如何影響RPS14 Neddyla1n的。發明人首先推測hCINAP可能是一個去Neddylat1n酶,但將對hCINAP可能的酶活必需的胺基酸進行突變後並沒有檢測到RPS14 Neddylat1n的改變，說明hCINAP本身不是一個去Neddylat1n酶。基於此，發明人進一步推斷hCINAP可能通過招募一個去多聚NEDD8修飾的酶來降低RPS14的Neddylat1n，根據已有文獻報導，NEDPl是目前報導最多的去Neddylat1n酶，發明人發現在過表達hCINAP時，可以檢測到RPS14與NEDPl的相互作用，而不過表達hCINAP時未檢測到兩者的相互作用，該結果說明hCINAP可以作為一個中間接頭分子介導RPS14與NEDPl的相互作用。這在一定程度上解釋了 hCINAP降低RPS14Neddylat1n的分子機制。
[0011]通過上述研究，發明人發現hCINAP可以通過調控RPS14 Neddylat1n改變其亞細胞定位，進而影響RPS14與HDM2的結合，並最終影響p53蛋白的穩定性和活性。
[0012]在上述研究工作基礎上，本發明進一步發現，除RPS14外，hCINAP還可以與一些核糖體前體RNA剪接因子相互作用，結合已有文獻報導，酵母中hCINAP的同源基因Fap7對20S前體rRNA的切割和40S亞基的裝配是必需的。基於此，發明人推斷在人類，hCINAP極有可能也是一個參與核糖體RNA剪接的重要因子。為了證明這個推斷，發明人通過免疫共沉澱和RT-PCR的實驗方法，發現在hCINAP複合體中含有18S和28S rRNA。為了更進一步闡明hCINAP的確參與18S和28S的加工，發明人用[5，6_3H]尿嘧啶標記對照組細胞和RNAihCINAP細胞的RNA，放射自顯影后發現在實驗組細胞中，將hCINAP的表達降低後，18SrRNA將顯著減少，然而，與對照組相比，28S rRNA並無明顯變化。同時，為了充分說明hCINAP參與18S rRNA的剪接，發明人還開展了 Northern blot的實驗,研究結果進一步肯定了上述結論。基於前期的研究hCINAP可以和RPS14相互作用，而已有研究結果表明，RPS14對18S rRNA的加工是必需的。因此，發明人推斷hCINAP可能與RPS14協同參與18SrRNA的加工。對此，發明人利用RNAi的手段，分別降低RPS14和hCINAP的表達，發現當同時降低兩者的表達時，與單獨降低其中一個蛋白的表達相比，18S rRNA的加工將受到更嚴重的抑制。該結果表明，hCINAP和RPS14協同參與18S rRNA的加工。通過以上研究，發明人發現了一個未曾報導的參與核糖體RNA剪切的重要調控因子。進一步研究發現hCINAP在核糖體小亞基的生成中具有重要的作用。
[0013]綜合以上研究結果，hCINAP不僅可以通過影響RPS14 Neddylat1n調控RPS14的亞細胞定位和穩定性，從而影響RPS14與HDM2的結合，最終影響p53蛋白的穩定性和活性，而且，hCINAP可以與RPS14協同參與核糖體18S rRNA的加工，並因此而影響核糖體小亞基和核糖體的生成，這在一定程度上揭示了未知蛋白hCINAP的功能。
[0014]基於已有的分子機制研究，為了更充分闡明hCINAP的生理功能，發明人進一步在細胞水平上檢測了 hCINAP對細胞周期和細胞凋亡的影響。結果發現，當過表達hCINAP時，G2/M期細胞數目增多，細胞凋亡減少，細胞生長加快。而當降低hCINAP的表達時，G2/M期細胞數目減少，細胞凋亡增多，細胞生長減慢，並且hCINAP對細胞周期和凋亡的調控是依賴於P53的。該結果與前期發現hCINAP可以調控p53及參與核糖體18S rRNA的加工是一致的。
[0015]根據目前已有報導，酵母中hCINAP的同源基因Fap7可以拮抗砒霜誘導的白細胞凋亡，發明人推測hCINAP也參與了癌症的發生發展。對此，發明人首先比較了 hCINAP在乳腺癌、結腸癌和癌旁樣本中的mRNA的表達，發現在癌組織中hCINAP表達上調，在83.33 %乳腺癌病人和70.00%的結腸癌病人中hCINAP高表達。並且在對80個結腸癌病人的跟蹤中發現，hCINAP高表達的病人存活時間縮短。這在一定程度上表明hCINAP在癌症的發生發展過程中具有重要的作用，可以作為一個臨床的重要監測指標。
[0016]在此基礎上，為了更好地揭示hCINAP在癌症發生發展中的作用，發明人進行了體外成瘤實驗和裸鼠成瘤實驗。體外成瘤實驗結果表明，當hCINAP表達被RNAi敲低時，腫瘤細胞的數量明顯減少，而當hCINAP過表達時，與對照相比，腫瘤細胞的數量增多。同樣地，裸鼠成瘤實驗結果表明，與對照組相比，當利用RNAi方法將hCINAP的表達降低時，裸鼠不再成瘤！這一結果，極有力地說明了 hCINAP是參與腫瘤形成的一個關鍵因子，它通過影響核糖體小亞基的生成進而影響核糖體的量，並進一步調控包括P53在內的多個腫瘤發生發展相關蛋白的表達，從來調控腫瘤細胞的生長，最終影響腫瘤的發生，因此，hCINAP非常有潛力成為一個抑癌祀點。
[0017]根據上述研究成果，本發明提出hCINAP蛋白可以作為抗癌藥物的藥物靶標，通過靶向性治療手段抑制癌細胞的生長和增殖。這樣的藥物例如hCINAP蛋白的特異性抗體，通過特異性抗體中和hCINAP蛋白，降低腫瘤細胞中hCINAP蛋白的量，從而抑制腫瘤細胞的生長。
[0018]hCINAP蛋白還可以作為靶標用以篩選抗癌藥物。
[0019]所述hCINAP蛋白的序列如序列表中SEQ ID No:1所不(Access1n Number:Q9Y3D8)。
[0020]hCINAP蛋白的基因序列包括其cDNA序列和基因組DNA序列，例如序列表中SEQ IDNO:2 所不的 cDNA 序列(Access1n Number:6880)。
[0021]hCINAP基因也可以作為抗癌藥物的靶標，例如可以通過RNAi敲低hCINAP基因的表達，從而抑制癌細胞的生長和增殖。
[0022]綜上所述，發明人的研究成果揭示了 hCINAP在調控p53信號通路及核糖體18SrRNA加工中的重要作用，同時在個體水平上發現hCINAP參與腫瘤的形成，降低該基因的表達將抑制腫瘤的生長，因此，結合基因工程手段，例如利用單克隆抗體中和hCINAP蛋白，可以降低腫瘤細胞內hCINAP蛋白的量，從而抑制腫瘤細胞的生長，也就是說，hCINAP可以通過靶向性治療的手段抑制癌細胞的生長和增殖，延長癌症患者的壽命。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1A受hCINAP過表達轉錄調控基因的功能分類；B基因本體論分析顯示hCINAP所調控的基因。
[0024]圖2顯示了 hCINAP與RPS14存在相互作用，其中:A是通過hCINAP抗體與抗原免疫沉澱的方法尋找與hCINAP相互作用蛋白的實驗結果，其中箭頭所指經質譜經分析為RPS14的特異性條帶；B是通過體內的免疫共沉澱驗證hCINAP與RPS14存在相互作用的實驗結果；C是通過體外的pull-down驗證hCINAP與RPS14存在相互作用的實驗結果；D是利用hCINAP與RPS14的特異性抗體檢測內源hCINAP與RPS14的相互作用的實驗結果。
[0025]圖3顯示了 hCINAP對於18S rRNA剪切是必需的，其中:A.免疫沉澱和RT-PCR分析結果顯示hCINAP與含有18S rRNA和28S rRNA的複合物結合在一起；B.用[5,6-?]尿嘧啶分別標記對照組細胞和RNAi幹涉的hCINAP細胞的RNA，並進行放射自顯影分析的結果，對28S和18S rRNA的溴化乙啶染色在該圖底部顯示；C.哺乳動物中rRNA前體剪接示意圖；
D.通過RNAi幹涉hCINAP和/或RPS14的表達並提取總RNA，利用18S探針，通過northernblot分析檢測18S rRNA水平的結果。
[0026]圖4是利用蔗糖密度梯度離心技術檢測hCINAP對核糖體小亞基及核糖體組裝的影響的實驗結果。
[0027]圖5顯示RPS14表達的降低抑制了 hCINAP與18S rRNA的作用。
[0028]圖6顯示hCINAP在人類癌症中高表達，其中:A.利用hCINAP特異性抗體，通過Western blot檢測在乳腺癌細胞和正常乳腺細胞中hCINAP蛋白的表達；B.RT-PCR方法檢測hCINAP mRNA在乳腺癌組織和癌旁組織中的表達水平，actin mRNA被用作對照；C.免疫組化實驗結果表明，與對照相比，hCINAP在乳腺癌組織中表達量高(DAB染色)；D.為免疫組化實驗結果表明，與對照相比，hCINAP在和結腸癌組織中表達量高(DAB染色)(80個結腸癌病人及癌旁組織)；E.根據免疫組化實驗，對hCINAP在乳腺癌和結腸癌組織中表達量進行定量分析，顯示了 hCINAP高表達(high)和低表達(low)在所檢測樣品中的百分比，P值(Student’s t-test)**p < 0.01，—p < 0.001 ；F.hCINAP 在結腸癌組織中的高表達與結腸癌病人短存活時間相關。
[0029]圖7(A_D)顯示了 RNAi hCINAP對細胞增殖、細胞周期和細胞凋亡的影響，其中:A.用對照-shRNA 或 hCINAP-shRNA 分別轉染 HCTl 16 細胞，通過 RT-PCR 和 western blot 驗證hCINAP 的 mRNA和蛋白表達受到抑制；B.通過MTT(3_(4.5-dimethythiazol-2-yl)-2.5-diphenyltetrazolium bromide)分析hCINAP表達的降低抑制HCT116細胞的增殖，該實驗獨立重複三次(數據顯示平均值土SD) ；C.通過流式細胞術分析hCINAP表達的降低對細胞周期的影響，在每個細胞周期不同階段的細胞的百分比用柱狀圖表示；D.經PI染色後通過流式細胞術分析hCINAP表達的降低對細胞凋亡的影響，數據為三次獨立實驗的平均值(P=0.0llvs.對照)ο
[0030]圖7 (E-G)顯示了過表達hCINAP對細胞增殖、細胞周期和細胞凋亡的影響，其中:E.用Flag-hCINAP和空載體轉染HCT116細胞，然後通過MTT實驗檢測hCINAP的過表達對細胞增殖的影響，該實驗獨立重複三次(數據顯示mean土SD)，結果顯示hCINAP的過表達促進了細胞增殖；F.通過流式細胞術分析hCINAP的過表達對細胞周期的影響，在每個細胞周期不同階段的細胞的百分比用柱狀圖表示；G.經PI染色後通過流式細胞術分析hCINAP的過表達對細胞凋亡的影響，數據為三次獨立實驗的平均值(P = 0.012vs.對照)。
[0031]圖8顯示了 hCINAP在體外細胞成瘤中的作用，其中:A.穩定表達hCINAP-shRNA或對照-shRNA的HCT116腫瘤細胞克隆的軟瓊脂集落形成實驗結果，顯示hCINAP表達的降低抑制體外細胞成瘤，右圖數據顯示的是三次獨立實驗的平均(平均值土SD) (*p < 0.05vs.對照)穩定過表達Flag-hCINAP或GFP空載體的HCTl 16細胞接種到軟瓊脂中，7天後觀察到的克隆形成情況，顯示hCINAP的過表達促進體外細胞成瘤，數據顯示的是三次獨立實驗的平均(平均值土 SD) (*p < 0.05vs.對照)。
[0032]圖9顯示了 hCINAP對裸鼠成瘤的影響，其中:A.驗證shRNA_l幹涉hCINAP表達的效果的Western blot實驗結果圖；B.裸鼠成瘤實驗結果,利用穩定表達hCINAP-shRNA的HCT116細胞(2X106)分別注射10隻裸鼠，與對照組(10隻)相比，裸鼠不再成瘤。

【具體實施方式】
[0033]以下實施方案進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬於本發明的範圍。
[0034]若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。
[0035]實施例1 hCINAP所調控的基因
[0036]為了研究hCINAP的調控作用，我們篩選獲得hCINAP穩定表達的HCTl 16細胞(見實驗具體方法)，提取 mRNA,通過 Illumina Solexa ultrasequencing 進行 RNA-seq 分析。最終發現與對照相比，在hCINAP過表達細胞中，有11，329種mRNA的表達變化明顯。進一步通過基因本體論分析發現發生明顯變化的基因主要參與以下生理過程:RNA代謝過程，翻譯調控，細胞成分的組成和生物合成，以及基因表達(圖1A)。而且，基因本體論分析顯示hCINAP的高表達引起基因表達的變化大多與RNA代謝和翻譯相關，這些基因與細胞的轉化和腫瘤生成密切相關(圖1B)。
[0037]實施例2 hCINAP與rRNA剪切因子RPS14相互作用
[0038]我們利用hCINAP的抗體(製備方法見實驗具體方法)在人類細胞系HEK 293T細胞裂解液中進行免疫沉澱，然後將免疫沉澱複合物進行SDS-PAGE電泳分析來尋找能與hCINAP發生相互作用的蛋白。結果如圖2A所示，和對照IgG相比，在hCINAP抗體免疫沉澱複合物內能檢測到一些特異性條帶，我們分別切下特異性條帶進行質譜分析，找到一些可能與hCINAP相互作用的靶蛋白，包括核糖體亞基蛋白如RPS14、RPL6等，核糖體RNA結合蛋白或到接因子，或是癌症相關蛋白。
[0039]由於RPS14最近被證明是人類第五條染色體長臂末端缺失綜合症(5qiyndrome)的一個關鍵基因，核糖體亞基蛋白參與P53活性的調節，而且相關研究證明p53通路與5q-Syndr0me疾病也有很大的關聯。三是RPS14在核糖體RNA的剪接中具有重要作用，並且，越來越多的文獻報導核糖體亞基蛋白也與細胞凋亡以及癌症密切相關。所以我們選擇RPS14進行深入研究。
[0040]為了進一步驗證hCINAP與RPS14存在相互作用，我們首先通過免疫共沉澱的方法進行驗證。Flag-hCINAP和HA-RPS14共轉染HEK 293T細胞，48小時後，收穫細胞並裂解，然後分別用Control IgG、Flag和HA抗體進行免疫沉澱，將免疫沉澱複合物進行蛋白質印記分析。在過表達Flag-hCINAP和HA-RPS14的HEK 293T細胞裂解液中，無論是用hCINAP的標籤抗體Flag還是用RPS14的標籤抗體HA進行免疫沉澱,在免疫沉澱複合物內都能檢測到另外一個蛋白的存在，這說明兩者確實存在相互作用(圖2B)。
[0041]接著，通過體外pull-down的方法，進一步研究兩者是否是直接的相互作用。我們首先通過大腸桿菌表達、超聲波裂解、親和純化和分子篩的方法，得到純度很高的、帶有His標籤的hCINAP、GST標籤的RPS14和GST標籤蛋白。通過結合GST柱料，能檢測到GST-RPS14與His-hCINAP的相互作用，而不能檢測到對照GST標籤蛋白與His-hCINAP的相互作用。反之，通過結合His的柱料，也能檢測到His-hCINAP與GST-RPS14存在相互作用(圖2C)。
[0042]我們還利用hCINAP與RPS14的抗體對兩個蛋白的內源相互作用進行了檢測，進一步證明兩個蛋白在生理條件下在細胞內具有相互作用(圖2D)。
[0043]上述實驗結果可以說明hCINAP與RPS14在體內和體外都存在特異性的相互作用，而且兩者之間的相互作用直接的。這些研究結果表明RPS14是hCINAP的相互作用蛋白。
[0044]實施例3 hCINAP是18S rRNA剪切所必需的
[0045]由於RPS14是rRNA的剪接因子，它與hCINAP具有相互作用。為了研究hCINAP在rRNA剪接和核糖體組裝中的作用，我們首先通過免疫沉澱和RT-PCR分析檢測了 hCINAP是否與rRNAs相互作用。如圖3A所示，用圖中所示不同質粒的HEK 293T轉染細胞，利用對照IgG、ant1-hCINAP或anti_RPS14對細胞裂解液進行免疫沉澱分析，並提取RNA，利用18SrRNA或28S rRNA的特異性引物進行RT-PCR分析，結果發現，與RPS14相類似，hCINAP與含有18SrRNA和28S rRNA的複合物相互作用，表明hCINAP很可能參與18S或28S rRNA的剪接。
[0046]為了進一步闡明hCINAP在18S rRNA或28S rRNA成熟中的作用，我們用[5，6-?]尿嘧啶標記對照組細胞和RNAi幹涉的hCINAP細胞的RNA，具體是用對照shRNA(5』-UUCUCCGAACGU(；UCACGU-3』，SEQ ID No:3)和 hCINAP-shRNA-l(5，-CAGAGUAGUUGAUGAGUUA-3』，SEQ ID No:4)轉染HeLa細胞72小時，然後用[5,6-?]尿嘧啶脈衝標記對照組細胞和RNAi幹涉的hCINAP細胞的RNA，提取細胞總RNA，放射自顯影后發現:在實驗組細胞中，降低hCINAP的表達後，18S rRNA將顯著減少，一致地，30S rRNA的積累明顯增多。然而，與對照組相比，28S rRNA並無明顯變化(圖3B)。這些結果說明hCINAP在18S rRNA的剪接成熟中，而不是在28S rRNA的剪接中發揮作用。
[0047]為了充分說明hCINAP對於18S rRNA的剪接是必需的，發明人通過RNAi幹涉hCINAP和/或RPS14的表達，然後提取總RNA，利用地高辛DIG標記能夠特異性地與18SrRNA序列互補的探針進行了 Northern blot實驗,檢測18S rRNA的水平。研究結果進一步證明了上述結論，如圖3D所示，hCINAP表達的降低導致18S rRNA明顯減少，同時用RNAi幹涉hCINAP和RPS14的表達時，18S rRNA的減少更為明顯。這些數據證明hCINAP是一個新的rRNA剪接因子，對於人類細胞18S rRNA的加工是必需的。
[0048]實施例4 hCINAP對核糖體40S小亞基的生成至關重要
[0049]由於hCINAP在18S rRNA剪接中發揮重要的作用，所以發明人通過蔗糖密度梯度離心技術進一步檢測了 hCINAP對核糖體小亞基及核糖體組裝的影響(圖4)。利用hCINAP-shRNA和?011廿01-8111?嫩分別轉染!1(:1'116細胞，獲得穩定細胞株，對細胞進行裂解，提取細胞質組分，然後通過蔗糖密度梯度離心以及在A254nm下分析檢測核糖體小亞基、大亞基以及核糖體等不同大小的組分，結果如圖4所示。結果發現hCINAP表達的缺失嚴重抑制40S核糖體小亞基的生成，並且80S核糖體以及多聚核糖體的量也明顯下降(圖4A)。利用ant1-hCINAP抗體,通過Western blot對不同組分中hCINAP的水平進行了檢測,發現hCINAP主要存在於核糖體小亞基中，在完整核糖體以及多聚核糖體中沒有檢測到該蛋白，說明hCINAP並不是核糖體的組分，只是在核糖體亞基的生成中發揮重要的作用。同樣地，在細胞中過表達hCINAP或空載體，然後通過蔗糖密度梯度離心分析過表達hCINAP對核糖體生成的影響，結果發現過表達hCINAP促進了核糖體的生成(圖4B)。
[0050]實施例5 hCINAP通過與RPS14結合作用到18S rRNA上
[0051]在實施例3中，發明人發現hCINAP與RPS14的表達被同時降低時，與單獨降低hCINAP表達相比，其所引起的18S rRNA的降低更為明顯。為了進一步研究hCINAP與RPS14在18SrRNA剪接中作用關係，發明人利用RPS14_shRNA轉染A549細胞96小時，利用ant1-hCINAP抗體對細胞裂解液進行免疫沉澱分析，然後提取RNA，利用18S rRNA特異性引物進行RT-PCR分析，結果發現RPS14表達的降低導致免疫沉澱物中18S rRNA的量明顯減弱(圖5)。對hCINAP晶體結構的分析發現，該蛋白的表面富含負電荷，不可能與RNA直接結合。這些結果表明hCINAP通過與RPS14結合作用到18S rRNA上。
[0052]實施例6 hCINAP在癌症組織中高表達
[0053]核糖體的生物合成對於維持細胞的生長和增殖，對於腫瘤的生成也是至關重要的。由於hCINAP在核糖體的生物合成中具有重要的作用。為了研究hCINAP與腫瘤的相關性，發明人首先在不同的乳腺癌細胞和正常乳腺細胞中檢測比較了 hCINAP的表達水平，結果發現，與相比，hCINAP在乳腺癌中表達量明顯高於正常乳腺細胞(圖6A)。接著，收集了20個乳腺癌病人組織及癌旁對照組織，提取RNA，通過RT-PCR方法檢測hCINAP在乳腺癌組織和癌旁組織中mRNA的表達水平，如圖6B所示，在大多數乳腺癌組織中hCINAP的mRNA水平都明顯高於癌旁組織。進一步，利用hCINAP特異性抗體，通過免疫組化實驗，對hCINAP在乳腺癌和結腸癌病人組織中的蛋白表達水平進行了檢測。與對照癌旁組織相比，hCINAP在乳腺癌和結腸癌組織中表達量高(圖6C-E)。發明人對80個結腸癌病人的生存時間與hCINAP高表達的相關性進行了分析，結果發現hCINAP的高表達(病人癌組織的高陽性染色)與術後病人的較短生存時間有顯著的相關性(圖6F)，表明hCINAP在臨床癌症診斷中可以作為有用的生物標記。這些結果表明hCINAP在癌症組織中高表達，很可能與腫瘤的發生發展密切相關。
[0054]實施例7 hCINAP調控細胞增殖、細胞周期和細胞凋亡。
[0055]為了研究hCINAP在腫瘤細胞增殖中的調控作用和機制，發明人進一步檢測了hCINAP 對細胞增殖的影響。利用表達 hCINAP-shRNA-Ι (5』 -CAGAGUAGUUGAUGAGUUA, SEQ IDNo:4)，或hCINAP-shRNA-2(5』-GAGAGAAGGUGGAGUUAUU，SEQ ID No:5)的慢病毒轉染 HCT116細胞，幹涉hCINAP的表達，並通過RT-PCR以及Western blot驗證了 RNA幹涉的效率，表明hCINAP的表達的確受到抑制(圖7A)。接著，篩選穩定表達hCINAP-shRNA-Ι的細胞並檢測hCINAP表達的降低對細胞增殖的影響。結果顯示，與對照相比，hCINAP表達降低的HCT116細胞的生長明顯變慢(圖7B)。與該結果相一致，過表達hCINAP促進細胞的增殖(圖7E)。我們進一步通過FACS實驗檢測了 hCINAP是否通過影響細胞周期和凋亡的來調節腫瘤細胞的增殖。結果如圖7C和7D所示，與對照相比，hCINAP表達的降低使得G2/M期分布的細胞明顯減少(圖7C)，並且促進細胞凋亡(圖7D)。相一致地，hCINAP的過表達能夠增加在G2/M期分布的細胞，並明顯抑制細胞凋亡(圖7F，圖7G)。
[0056]實施例8 hCINAP在體外細胞成瘤中的作用
[0057]由於細胞增殖、細胞周期和細胞凋亡中發揮重要的調控作用，發明人進一步檢測了 hCINAP在體外細胞成瘤中的作用。穩定表達hCINAP和hCINAP-shRNA的HCTl 16細胞分別利用軟瓊脂集落形成(soft agar colony-format1n)實驗來檢測hCINAP的過表達和表達降低對細胞成瘤的影響。結果如圖8所示，與對照相比，在hCINAP表達敲低的HCT116細胞中，形成的細胞克隆數目明顯減少(圖8A)，而在hCINAP過表達的細胞中，細胞克隆明顯增大，數目明顯增多(圖SB)。這些數據表明hCINAP在體外細胞成瘤中發揮重要的調節作用。
[0058]實施例9 hCINAP在裸鼠體內成瘤中的作用
[0059]為了進一步證明hCINAP在腫瘤形成中的作用，發明人對hCINAP在裸鼠成瘤中的作用進行了研究。首先利用穩定表達hCINAP-shRNA-Ι或對照shRNA慢病毒侵染HCT116細胞，篩選獲得穩定表達hCINAP-shRNA的細胞，通過Western blot驗證了 hCINAP表達的降低(圖9A)。然後將hCINAP低表達的細胞和對照細胞分別各注射10隻裸鼠的右側腹部，3周後比較裸鼠成瘤的情況。結果發現，注射對照shRNA的細胞在7天後就觀察到了腫瘤的形成，注射hCINAP-shRNA細胞的小鼠未觀察到腫瘤的形成。3周後，對照組小鼠的腫瘤變大至103mm3(圖9B，上)；相反地，hCINAP表達被幹涉的HCT116細胞沒有引起任何腫瘤的形成(圖9B，下)。這些結果與【具體實施方式】八中的體外成瘤實驗結果一致，表明hCINAP在體內腫瘤形成中是必需的。
[0060]上述實施例中所涉及的各種實驗的具體方法如下:
[0061]hCINAP穩定細胞系的篩選
[0062]實驗前一天，接種細胞並保持細胞處於良好的生長狀態。以小皿為例(1cm2)，在
1.5mlEP管中加入Iml含10%胎牛血清的培養基，向其中加入20 μ I病毒(Μ0Ι = 10)，並加入1μ 1(1000倍稀釋)polybrane輔助病毒入侵細胞，用槍頭反覆吹打幾下混勻。將上述含有病毒的培養基加入到培養皿中繼續培養。24小時後，更換新鮮的培養基，以保證細胞較好的生長狀態。當病毒侵染時間達到72小時時，加入嘌呤黴素(2 μ g/ml),此時,沒有被病毒侵染的細胞由於不具有對該抗生素的抵抗能力而被殺死，存活下來的細胞即為被病毒成功侵染的細胞，繼續培養，即為hCINAP的穩定表達細胞系。
[0063]hCINAP抗體的製備
[0064]構建帶有his標籤的hCINAP原核表達載體，轉化大腸桿菌DH_5 α，次日挑單克隆搖菌，加入IPTG誘導蛋白表達，裂解菌液，離心收集蛋白上清，將上清過鎳柱純化蛋白，將純化後的蛋白免疫兔子，一個月後收集兔子的血清，即可得到hCINAP的抗體，為了提高抗體的特異性，將含有抗體的血清進行抗原抗體親和層析，可進一步獲得效價更好，特異性更高的抗體，用作後續Western blot以及免疫組化等實驗。
[0065]Western Blo 實驗
[0066]蛋白質從SDS-PAGE凝膠轉移至硝纖維膜，常規配置轉移緩衝液(5.8g Tris, 2.9gGly,0.375g SDS, 200ml甲醇)，冰浴下150mA轉移2h (膠衝陰極，膜衝陽極)；將轉移成功的硝纖膜置於TBS T緩衝液(1.21g Tris，4g NaCl，1/1000體積的吐溫-20)中衝洗2-3次，轉入1ml封閉緩衝液(0.5g脫脂奶粉，Iml 10 X TBS, 10 μ I吐溫-20)室溫封閉Ih或4°C過夜；加入抗體稀釋液(0.5g BSA, Iml 10 X TBS, 10 μ I吐溫-20)稀釋至工作濃度的一抗溶液，室溫孵育2h，TBST洗三次，5min/次；接著加入抗體稀釋液稀釋至工作濃度的二抗溶液，室溫孵育50min，TBST洗2次，5min/次，藉助儀器Odyssey掃膜。
[0067]免疫螢光實驗
[0068]以檢測NEDPl對RPS14亞細胞定位的影響為例，說明具體的實施過程。
[0069]在HeLa中同時轉染兩種質粒,36h後棄掉培養基,PBS洗三次,每次5min ;加入Iml預冷的無水甲醇，_20°C放置1min (切不可劇烈)冰上操作；預冷的PBS洗3次，每次加2ml,冰上5min,輕搖。
[0070]在載玻片上加一層Parafilm膜，將60 μ I I % BSA點加到上面，然後將蓋玻片放到膜上，一定要分清細胞面的方向，37°C放置30min，放在溼盒裡。封閉完後，用預冷的PBS洗2次,每次5min,放置於冰上。I % BSA稀釋一抗(100 X),方法與封閉一樣,放置溼盒子裡，37°Clh。PBS洗3次，每次5min，冰上。加二抗，將含有二抗的BSA 60μ1點加到載玻片上，放置溼盒子裡，37°C Ih0 二抗結束後，PBS洗3次，每次5min，2ml，洗的過程中注意避光。封片:取20 μ I混合液點加到新的載玻片上，將洗乾淨的蓋玻片蓋在上面，放在室溫下讓蓋玻片充分凝固(混合液中含有指甲油、DAPI染料等組分)。
[0071]免疫共沉澱實驗
[0072]以鑑定RPS14與HDM2的相互作用為例，說明具體的實施方法。
[0073]在HCT116細胞中同時過表達Pffl-HA-RPS14和Paiy-Myc_HDM2，轉染48h後收集細胞，將培養基棄掉，加入8ml預冷的PBS將細胞吹起，轉移到15ml的離心管中，4°C，3000rpm離心5min。離心後，將上清去掉，加入Iml PBS將細胞沉澱吹起，轉移到1.5ml EP管中，4°C，3000rpm離心5min收集細胞。將上清去除後，加入Iml細胞裂解液，同時加入200X蛋白酶抑制劑。在4°C旋轉混合儀上裂解2h。裂解後，4°C，13800rpm離心15min，將上清轉移到另一支新的EP管中，加入80 μ I Protein G預清除40min。結束後,4°C, 3000rpm離心5min,取上清轉移到另一支新管中，先取25 μ I作為input,其餘上清加入相應抗體，4°C旋轉混合儀上混合過夜。次日9時,每管加入80μ I Protein G,混勻4h左右。此後,取出EP管,現在冰上靜置5min,然後4°C, 3000rpm離心5min,將上清去掉，向沉澱下來的珠子中加入Iml細胞裂解液，並將珠子充分散開，以達到洗滌的目的，4°C，3000rpm離心5min，去掉上清液，如此重複2次。最後一次離心後，將珠子中的液體充分吸淨，加入25 μ I loading buffer,96°C煮樣 lOmin。準備做 Western Blot。
[0074]從乳腺癌樣本中提取hCINAP mRNA進行RT-PCR
[0075]實驗中用到的研缽、研缽棒、藥匙、鑷子都要用自來水及蒸餾水衝洗乾淨，200°C烘烤2h。樣品一般可以保存在_80°C或者液氮中，把所用用品準備好後，取出樣品，放在冰上。
[0076]取出研缽(烘烤時用錫箔紙包著)和研缽棒，加入液氮預冷，然後用藥匙從樣品管中將樣品取出，先用研缽棒將大的組織塊碾碎，然後將繼續將組織顆粒研磨到肉眼不可見即可，待液氮揮發完後，加入Trizol Iml/小皿，然後用研缽棒捻幾下，放在冰上。此時研碎後的樣品呈固體狀，待完全融化為液體後將其轉移到1.5ml EP管中。
[0077]加入200 μ I三氯甲烷，上下混勻15s，放置2min，12000g 4°C離心15min。離心後，分為3層,無色水相、中間層和黃色有機相(RNA在水相中)，取約450 μ I上層水相於另一個EP管中，加入等體積的異丙醇,上下混勻10次,室溫靜置lOmin, 12000rpm 4°C離心lOmin。離心後，將上層清液吸掉，儘量把雜質吸淨，RNA沉到管底，很少量呈凝膠狀，將其在60°C水浴中溶解再吹打幾次。
[0078]加入預冷的Iml 70%的乙醇(用DEPC處理)，此時RNA會被吹起，7500rpm 4°C離心5min，離心後，將上清吸淨。將離心管放置在EP管架上靜置約2min 30s,加入RNase freewater將沉澱反覆吹打幾下(約10次)，60°C水浴1min,用槍頭反覆吹打幾下,放在冰上，測定濃度和純度。做PCR需要的RNA約I μ g，根據所測的濃度，計算加入RNA的體積，進行RT-PCR。
[0079]免疫沉澱和免疫印記
[0080]轉染前一天將293T或HCT116細胞以合適的密度(一般按1: 4傳代)接種於培養皿中，在37°C含有5% CO2的培養箱中培養過夜後，其細胞匯合率達到70-80%左右，用Mega Tranl.0轉染試劑共轉染所要表達的真核質粒；轉染48或72小時後在4°C, 3000rpm離心5分鐘收集細胞，並用預冷的PBS洗兩次之後，一個培養皿的細胞量加入Iml的NP-40細胞裂解液，並在4°C混合器上裂解2小時；之後，在4°C，13000rpm離心15分鐘，取上清，加入60 μ I protein G進行預清除,在4°C混勻器上孵I小時；然後,在4°C, 2000rpm離心5分鐘，將上清轉移至新的1.5ml離心管中，加入相應的抗體與抗原進行免疫沉澱，其最終濃度到達5 μ g/ml，在另一離心管中加入等量的免疫前IgG作為陰性對照，並在4°C混勻器上孵育過夜；第二天早上每管分別加入75 μ I protein G，在4°C孵育3_5小時；然後，在4°C，2000rpm離心5分鐘，棄上清；沉澱用細胞裂解液洗2_3次，並儘可能將上清去除乾淨,加入30 μ 12 X loading buffer混勻後95°C煮樣10-15分鐘；在13000rpm離心15分鐘之後取上清進行SDS變性聚丙烯醯胺凝膠電泳，然後用蛋白質免疫印記實驗檢測其相互作用情況。
[0081]把SDD-PAGE上的蛋白質通過轉膜儀轉到硝酸纖維素膜上，首先用5%牛奶進行封閉I小時，然後加入相應的一抗室溫反應2小時，用PBST洗兩次之後，加入相應的二抗，室溫反應I小時之後，再用PBST洗兩次之後，用L1-COR Odyssey進行掃描。
[0082]體外的pull-down分析
[0083]為了驗證兩個蛋白質是否存在直接的相互作用，如hCINAP與RPS14，我們分別用原核表達並純化了帶有His標籤的hCINAP蛋白和GST標籤的RPS14蛋白，然後用體外pull-down方法驗證它們是否存在直接的相互作用。本實驗首先以His-hCINAP誘館蛋白，GST-RPS14為捕獲蛋白，兩個蛋白都是在E.coli BL21(DE3)表達並純化，具體的實驗步驟如下:首先取100 μ I介質N1-NTA agarose於1.5ml的離心管中，然後用緩衝液(與誘餌蛋白的緩衝液一致)洗3次，500 μ I/次；在4°〇，2000印111離心I分鐘，棄上清；加入300 μ I預冷的結合緩衝液PBS，然後加入50 μ g的誘餌蛋白His-hCINAP，並在4°C混勻器上孵育I小時；用緩衝液洗3次，洗去與介質沒有結合上去以及結合不牢固的誘餌蛋白，並在4°C，2000rpm離心I分鐘，棄上清；並加入300 μ I預冷的結合緩衝液PBS，然後加入50 μ g的捕獲蛋白GST-RPS14，在4°C混勻器上孵育3-5小時；用含有30mM咪唑的緩衝液洗3次，洗去沒有結合上的或與柱料非特異結合的捕獲蛋白質，在4°C，2000rpm離心I分鐘，棄上清；用50 μ I含有300mM咪唑的緩衝液洗脫誘餌與捕獲蛋白複合物，充分渦旋後，在4°C，2000rpm離心I分鐘，將上清分別轉移到新的1.5ml離心管中；加入等體積的2X loading buffer,並在95°C煮樣10-15分鐘；在13000rpm離心15分鐘後，取上清進行SDS-PAGE電泳和蛋白質免疫印記的方法分析其相互在作用。
【權利要求】
1.hCINAP蛋白的應用，其特徵在於，以hCINAP蛋白作為抗癌藥物的靶標。
2.hCINAP蛋白的應用，其特徵在於，以hCINAP蛋白作為靶標篩選抗癌藥物。
3.如權利要求1或2所述的應用，其特徵在於，所述hCINAP蛋白的序列如序列表中SEQID No:1 所示。
4.hCINAP蛋白基因的應用，其特徵在於，以hCINAP蛋白基因作為抗癌藥物的靶標。
5.hCINAP蛋白基因的應用，其特徵在於，以hCINAP蛋白基因作為靶標篩選抗癌藥物。
6.如權利要求4或5所述的應用，其特徵在於，所述hCINAP蛋白基因的序列如序列表中 SEQ ID No:2 所示。
7.一種抗癌藥物，其特徵在於，所述藥物以hCINAP蛋白或其基因作為藥物靶標。
8.如權利要求7所述的抗癌藥物，其特徵在於，所述藥物是hCINAP蛋白的特異性抗體，或者是hCINAP蛋白基因的幹擾RNA。
9.如權利要求8所述的抗癌藥物，其特徵在於，所述幹擾RNA的序列如序列表中SEQIDNo:4 或 SEQ ID No:5 所示。
10.如權利要求7所述的抗癌藥物，其特徵在於，所述hCINAP蛋白的序列如序列表中SEQ ID No:I所不；所述hCINAP蛋白基因的序列如序列表中SEQ ID No:2所不。
【文檔編號】A61P35/00GK104174020SQ201310189029
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2013年5月21日 優先權日:2013年5月21日
【發明者】鄭曉峰, 白冬梅, 張金方 申請人:北京大學