超高效液相色譜和質譜聯用篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑的方法

2023-06-14 08:29:51

專利名稱：超高效液相色譜和質譜聯用篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑的方法
技術領域：
本發明屬於分析化學領域，涉及超高效液相色譜和質譜聯用篩選黃嘌呤氧化酶抑 製劑的方法，具體而言，涉及天然產物提取物或單體對黃嘌呤氧化酶體外抑制率以及黃嘌 呤氧化酶催化活性的超高效液相色譜和質譜聯用的方法。
背景技術：
黃嘌呤氧化酶是生物體內廣泛存在的一種黃素蛋白酶，它屬於鉬蛋白酶家族，是 體內核酸代謝途徑的關鍵酶。黃嘌呤氧化酶催化底物黃嘌呤和次黃嘌呤氧化成尿酸，並產 生超氧陰離子(0_2·)和過氧化氫(H2O2)。尿酸濃度過高會導致高尿酸血症，並且隨著尿酸 在關節處的沉積結晶可引起痛風發作。超氧陰離子自由基則與炎症，癌變和衰老相關。近 幾年的研究還發現黃嘌呤氧化酶在缺血再灌注組織和血管損傷，炎症疾病和慢性心力衰竭 中也起著重要的作用。而作為臨床應用的黃嘌呤氧化酶抑制劑藥物只有上世紀60年代上 市的別嘌呤醇，但是它有很多副作用，應用後病人可有發熱、過敏性皮疹、腹痛、腹瀉、白細 胞及血小板減少，甚至有肝功能損害等副作用。所以尋找黃嘌呤氧化酶抑制劑和研究黃嘌 呤氧化酶抑制劑在臨床中的應用對於開發新藥有著非常重要的意義。黃嘌呤氧化酶抑制劑的篩選一般使用光譜法，其不足之處在於光譜法易受到 背景幹擾，可能得到假陽性或假陰性結果(Akihiko Nagao, Michiko Sehi, Hidetaka Kobayashi, Biosci.Biotechnol. Biochem63(1999) 1787-1790 ；Chunmao Lin, Chienshu Chen, Chientsu Chen, Yuchih Liang, and Jenkun Lina, Biochemical and Biophysical ResearchCommunications 294(2002) 167-172)；也曾有人為了克服光譜法中的缺點而採 用液相色譜法進行黃嘌呤氧化酶抑制劑的篩選，但是液相色譜方法所需的樣品用量大，耗 費的時間長(Akihiko Nagao, MichikoSehi, Hidetaka Kobayashi, Biosci. Biotechnol. Biochem 63(1999) 1787-1790)。質譜方法最大的優勢在於它的檢測本質是基於一個分子 的質荷比。現代質譜儀的高精確度和靈敏度為我們提供了不受幹擾的分子指紋圖譜，串聯 質譜高度特異性和精確性揭示待分析化合物的結構信息，且質譜方法可以同時檢測和定量 多禾中組分(Gejing Deng, Gautam S anyal. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 40(2006)528-538)。酶促反應緩衝液中往往含有不揮發的鹽和為保持酶活性穩 定的添加物，鹽和添加物可能會汙染質譜儀的離子源並導致離子化抑制，樣品進入質譜前 使用高效液相色譜進行分離可以避免反應體系中的鹽和添加物對檢測的影響(Arjen R. de Boer, Thomas Letzel, Danny A. van Elswijk, Henk Lingeman, Wilfried Μ. A. Niessen, andHubertus Irth. Anal. Chem. 2004，76，3155-3161)。

發明內容
本發明的目的是提供超高效液相色譜和質譜聯用篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑的方 法。本發明可用於分析天然產物提取物或單體對黃嘌呤氧化酶體外抑制率以及黃嘌呤氧化酶催化活性的超高效液相色譜和質譜聯用的方法。本發明所述的天然產物提取物或單體對黃嘌呤氧化酶的體外抑制是指天然產物 提取物或單體抑制黃嘌呤氧化酶的活性從而導致酶促反應底物黃嘌呤的剩餘量增加，產物 尿酸的量減少；本發明所述的黃嘌呤氧化酶催化活性是指在37°C，黃嘌呤氧化酶催化底物生成尿 酸的量，也可以用底物黃嘌呤減少的量來表示。本發明包括以下內容以黃嘌呤為底物，黃嘌呤氧化酶在37°C催化底物生成尿 酸，用超高效液相色譜和質譜聯用對黃嘌呤進行定量，通過計算底物黃嘌呤含量的變化得 到黃嘌呤氧化酶的活性，進一步計算出黃嘌呤氧化酶抑制劑對黃嘌呤氧化酶的抑制率。本發明提供的超高效液相色譜和質譜聯用篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑的方法，其包 括以下步驟所述的超高效液相色譜，與高效液相色譜相比具有超高分離度，超高速度和超高 靈敏度；所述的黃嘌呤氧化酶抑制劑是天然產物提取物或單體；本發明優選別嘌呤醇、異 鼠李素、染料木素或銀杏水提物；(1)酶促反應緩衝液的配製酶促反應緩衝液包括50毫摩爾/升三羥甲基氨基甲烷，7毫摩爾/升鹽酸，1毫摩 爾/升乙二胺四乙酸二鈉鹽，PH值為8.9 ；(2)標準品的配製用2摩爾/升的氨水溶液將標準品分別配成濃度為1微摩爾/升、2微摩爾/升、 5微摩爾/升、10微摩爾/升、15微摩爾/升或20微摩爾/升的標準溶液，且每個濃度的標 準品溶液均含1微摩爾/升的牛磺熊去氧膽酸鈉作為內標；所述的標準品為黃嘌呤；黃嘌 呤是黃嘌呤氧化酶的底物；(3)對照品、空白樣品和樣品的酶促反應對照品的配製反應總體積200微升，終濃度100納摩爾/升的黃嘌呤氧化酶，在 37°C孵育30分鐘，加入終濃度100微摩爾/升的底物黃嘌呤，37°C反應5分鐘後，加入800 微升的甲醇終止反應，加入終濃度為1微摩爾/升的內標牛磺熊去氧膽酸鈉，作為對照品； 供超高效液相色譜和質譜聯用測定；空白樣品的配製反應總體積200微升，不加黃嘌呤氧化酶，加入終濃度100微摩 爾/升的底物黃嘌呤，37°C反應5分鐘後，加入800微升的甲醇終止反應，加入終濃度為1 微摩爾/升的內標牛磺熊去氧膽酸鈉，作為空白樣品；供超高效液相色譜和質譜聯用測定；樣品的配製反應總體積200微升，終濃度100納摩爾/升的黃嘌呤氧化酶與終濃 度為20微摩爾/升的黃嘌呤氧化酶抑制劑於37°C孵育30分鐘，加入終濃度100微摩爾/ 升的底物黃嘌呤，37°C反應5分鐘後，加入800微升的甲醇終止反應，加入終濃度為1微摩 爾/升的內標牛磺熊去氧膽酸鈉，作為樣品；供超高效液相色譜和質譜聯用測定；(4)標準品、對照品、空白樣品和樣品的檢測對標準品檢測採用牛磺熊去氧膽酸鈉為內標，以內標法定量，對步驟O)的系列 標準品溶液進行超高效液相色譜和質譜檢測，從總離子流圖中提取黃嘌呤和牛磺熊去氧膽 酸鈉的色譜圖，分別積分求峰面積，以所述的標準品濃度為橫坐標，以黃嘌呤與牛磺熊去氧膽酸鈉峰面積比值為縱坐標，在所述的標準品濃度為1微摩爾/升至20微摩爾/升範圍內， 用微軟公司(Microsoft)的Excel軟體得到黃嘌呤的線性方程y = ax+b式中，y為所述的標準品黃嘌呤與內標牛磺熊去氧膽酸鈉峰面積比值；χ為標準 品的濃度，量綱為微摩爾/升；a、b為軟體計算得到的常數；同時該軟體計算得到相關係數 R2;①超高效液相色譜的檢測條件超高效液相色譜儀Waters ACQUITY ；色譜柱=WatersACQUITY UPLC BEH C18 (2. 1 X 50 毫米，1. 7 微米)；流動相甲醇㈧和水⑶；梯度洗脫程序0 1分鐘，20% A 60% A ;1 2分鐘，60% A 100% A ;2 3分鐘，100% A 20% A ;3 5分鐘，20% A ；所指的百分比均為體積百分比；流速0. 2毫升/分鐘；進樣量5微升；②質譜條件質譜儀Waters Xevo TQ ；離子源電噴霧(ESI)電離源負離子模式；毛細管電壓2000伏特；去溶劑氣氮氣溫度350攝氏度；去溶劑氣氮氣流速800升/小時；錐孔氣氮氣流速50升/小時；碰撞氣氬氣流速0. 15升/小時；第一個四極杆的低端解析度為3. 0 ；高端解析度為15. 0 ；離子能量為0. 5 ；第二個四極杆的低端解析度為3. 0 ；高端解析度為13. 5 ；離子能量為0. 5 ；以上所述質譜條件在檢測黃嘌呤和內標牛磺熊去氧膽酸鈉時是相同的；錐孔電壓在檢測黃嘌呤和內標牛磺熊去氧膽酸鈉時是不同的檢測黃嘌呤時錐孔 電壓是觀伏特；檢測內標牛磺熊去氧膽酸鈉時錐孔電壓是30伏特；碎裂能量和選擇的碎片離子在檢測黃嘌呤和內標牛磺熊去氧膽酸鈉時也是不同 的檢測黃嘌呤時碎裂能量是20，碎片離子是107. 98 ；檢測內標牛磺熊去氧膽酸鈉時碎裂 能量是30，碎片離子是124. 08 ；對照品，空白樣品和樣品檢測均按上述的超高效液相色譜和質譜條件分別進行檢 測；(5)黃嘌呤氧化酶抑制劑對黃嘌呤氧化酶的抑制率黃嘌呤氧化酶抑制劑天然產物提取物或單體抑制黃嘌呤氧化酶的活性從而導致 酶促反應底物黃嘌呤的剩餘量增加，產物尿酸的量減少；所以抑制劑對黃嘌呤氧化酶的抑 制率可以通過底物黃嘌呤含量或者產物尿酸含量的變化進行評價；本發明是利用底物黃嘌 呤含量的變化進行計算的；分別根據對對照品、空白樣品和樣品測得的峰面積比值在線性方程中求得對照 品、空白樣品和樣品中黃嘌呤濃度，黃嘌呤氧化酶抑制劑對黃嘌呤氧化酶的抑制率按照以下公式計算I樣品=(C樣品-C對照)/(C空白-C對照)X100%式中，I為黃嘌呤氧化酶抑制劑對黃嘌呤氧化酶的抑制率；C#s為根據線性方程求得的樣品中黃嘌呤濃度，量綱為微摩爾/升；Cw為根據線性方程求得的對照品中黃嘌呤的濃度，量綱為微摩爾/升；Cse為根據線性方程求得的空白樣品中黃嘌呤濃度，量綱為微摩爾/升。有益效果本發明提供了超高效液相色譜和質譜聯用篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑的 方法，所述的黃嘌呤氧化酶抑制劑是天然產物提取物或單體。本發明用超高效液相色譜和 質譜聯用的方法，用於分析天然產物提取物或單體對黃嘌呤氧化酶體外抑制率以及黃嘌呤 氧化酶催化活性。本發明將超高效液相色譜和質譜聯用方法應用到酶抑制劑篩選中，樣品 檢測快速、準確，線性方程相關係數高於0. 998，質譜針對化合物質量電荷比進行檢測，精確 度高，特異性好，避免了光譜法篩選中的假陽性和假陰性結果，可用於黃嘌呤氧化酶抑制劑 的篩選，並且可用於黃嘌呤氧化酶的動力學研究。


圖1為實施例1中10微摩爾/升的標準品黃嘌呤(峰1)和1微摩爾/升的內 標牛磺熊去氧膽酸鈉(峰2)的多反應檢測負離子模式的總離子流色譜圖，信號強度為 1. 41X105。圖2為實施例1中1微摩爾/升的內標牛磺熊去氧膽酸鈉的多反應檢測負離 子模式的提取色譜圖，提取所用離子對為母離子498. 08和碎片離子124. 08，信號強度為
1. IOXlO5O圖3為實施例1中10微摩爾/升的標準品黃嘌呤的多反應檢測負離子模式的提 取色譜圖，提取所用離子對為母離子150. 85和碎片離子107. 98，信號強度為1. 41X 105。圖4為實施例1中不同濃度黃嘌呤標準品的標準曲線及線性公式。圖5為實施例1中對照品中1微摩爾/升的內標牛磺熊去氧膽酸鈉的多反應檢測 負離子模式的提取色譜圖，提取所用離子對為母離子498. 08和碎片離子124. 08，信號強度 為 1. OlXlO5O圖6為實施例1中對照品中黃嘌呤的多反應檢測負離子模式的提取色譜圖，提取 所用離子對為母離子150. 85和碎片離子107. 98，信號強度為7. 84X 103。圖7為實施例1中空白樣品中1微摩爾/升的內標牛磺熊去氧膽酸鈉的多反應檢 測負離子模式的提取色譜圖，提取所用離子對為母離子498. 08和碎片離子124. 08，信號強 度為 1. 03X 105。圖8為實施例1中空白樣品中黃嘌呤的多反應檢測負離子模式的提取色譜圖，提 取所用離子對為母離子150. 85和碎片離子107. 98，信號強度為1. 20X 106。圖9為實施例1中樣品中1微摩爾/升的內標牛磺熊去氧膽酸鈉的多反應檢測負 離子模式的提取色譜圖，提取所用離子對為母離子498. 08和碎片離子124. 08，信號強度為 1. 05X 105。圖10為實施例1中樣品中黃嘌呤的多反應檢測負離子模式的提取色譜圖，提取所 用離子對為母離子150. 85和碎片離子107. 98，信號強度為7. 82X 105。
圖11為實施例2中樣品中1微摩爾/升的內標牛磺熊去氧膽酸鈉的多反應檢測 負離子模式的提取色譜圖，提取所用離子對為母離子498. 08和碎片離子124. 08，信號強度 為 1. 04X 105。圖12為實施例2中樣品中黃嘌呤的多反應檢測負離子模式的提取色譜圖，提取所 用離子對為母離子150. 85和碎片離子107. 98，信號強度為7. 76X 105。圖13為實施例3中樣品中1微摩爾/升的內標牛磺熊去氧膽酸鈉的多反應檢測 負離子模式的提取色譜圖，提取所用離子對為母離子498. 08和碎片離子124. 08，信號強度 為 1. 22X 105。圖14為實施例3中樣品黃嘌呤的多反應檢測負離子模式的提取色譜圖，提取所用 離子對為母離子150. 85和碎片離子107. 98，信號強度為4. 84X 105。圖15為實施例4中樣品中1微摩爾/升的內標牛磺熊去氧膽酸鈉的多反應檢測 負離子模式的提取色譜圖，提取所用離子對為母離子498. 08和碎片離子124. 08，信號強度 為 1. 16X105。圖16為實施例4中樣品中黃嘌呤的多反應檢測負離子模式的提取色譜圖，提取所 用離子對為母離子150. 85和碎片離子107. 98，信號強度為1. 12X105。
具體實施例方式以下將通過具體的實施例來描述發明。另外，實施例中所使用的材料除有特別說 明外，均可通過商業途徑從市場上購買。實施例1本發明提供的超高效液相色譜和質譜聯用篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑的方法，其包 括以下步驟(1)酶促反應緩衝液的配製酶促反應緩衝液包括50毫摩爾/升三羥甲基氨基甲烷，7毫摩爾/升鹽酸，1毫摩 爾/升乙二胺四乙酸二鈉鹽，PH值為8.9 ；(3)標準品的配製用2摩爾/升的氨水溶液將標準品分別配成濃度為1微摩爾/升、2微摩爾/升、 5微摩爾/升、10微摩爾/升、15微摩爾/升或20微摩爾/升的標準溶液，且每個濃度的標 準品溶液均含1微摩爾/升的牛磺熊去氧膽酸鈉作為內標；所述的標準品為黃嘌呤；黃嘌 呤是黃嘌呤氧化酶的底物；(3)對照品、空白樣品和樣品的酶促反應對照品的配製反應總體積200微升，終濃度100納摩爾/升的黃嘌呤氧化酶，在 37°C孵育30分鐘，加入終濃度100微摩爾/升的底物黃嘌呤，37°C反應5分鐘後，加入800 微升的甲醇終止反應，加入終濃度為1微摩爾/升的內標牛磺熊去氧膽酸鈉，作為對照品； 供超高效液相色譜和質譜聯用測定；空白樣品的配製反應總體積200微升，不加黃嘌呤氧化酶，加入終濃度100微摩 爾/升的底物黃嘌呤，37°C反應5分鐘後，加入800微升的甲醇終止反應，加入終濃度為1 微摩爾/升的內標牛磺熊去氧膽酸鈉，作為空白樣品；供超高效液相色譜和質譜聯用測定；樣品的配製反應總體積200微升，終濃度100納摩爾/升的黃嘌呤氧化酶與終濃度為20微摩爾/升的黃嘌呤氧化酶抑制劑別嘌呤醇於37°C孵育30分鐘，加入終濃度100 微摩爾/升的底物黃嘌呤，37°C反應5分鐘後，加入800微升的甲醇終止反應，加入終濃度 為1微摩爾/升的內標牛磺熊去氧膽酸鈉，作為樣品；供超高效液相色譜和質譜聯用測定；(4)標準品、對照品、空白樣品和樣品的檢測對標準品檢測採用牛磺熊去氧膽酸鈉為內標，以內標法定量，對步驟O)的系列 標準品溶液進行超高效液相色譜和質譜檢測，從總離子流圖中提取黃嘌呤和牛磺熊去氧膽 酸鈉的色譜圖，分別積分求峰面積，以所述的標準品濃度為橫坐標，以黃嘌呤與牛磺熊去氧 膽酸鈉峰面積比值為縱坐標，在所述的標準品濃度為1微摩爾/升至20微摩爾/升範圍內， 用微軟公司(Microsoft)的Excel軟體得到黃嘌呤的線性方程y = ax+b式中，y為所述的標準品A黃嘌呤與內標牛磺熊去氧膽酸鈉峰面積比值；χ為標準 品的濃度，量綱為微摩爾/升；a、b為軟體計算得到的常數；同時該軟體計算得到相關係數 R2;①超高效液相色譜的檢測條件超高效液相色譜儀Waters ACQUITY ；色譜柱=WatersACQUITYUPLC BEH C18 (2. 1 X 50 毫米，1. 7 微米)；流動相甲醇㈧和水⑶；梯度洗脫程序0 1分鐘，20% A 60% A ;1 2分鐘，60% A 100% A ;2 3分鐘，100% A 20% A ;3 5分鐘，20% A ；所指的百分比均為體積百分比；流速:0. 2毫升/分鐘；進樣量5微升；②質譜條件質譜儀=Waters Xevo TQ ；離子源電噴霧(ESI)電離源負離子模式；毛細管電壓2000伏特；去溶劑氣氮氣溫度350攝氏度；去溶劑氣氮氣流速800升/小時；錐孔氣氮氣流速50升/小時；碰撞氣氬氣流速0. 15升/小時；第一個四極杆的低端解析度為3. 0 ；高端解析度為15. 0 ；離子能量為0. 5 ；第二個四極杆的低端解析度為3. 0 ；高端解析度為13. 5 ；離子能量為0. 5 ；以上所述質譜條件在檢測黃嘌呤和內標牛磺熊去氧膽酸鈉時是相同的；錐孔電壓在檢測黃嘌呤和內標牛磺熊去氧膽酸鈉時是不同的檢測黃嘌呤時錐孔 電壓是觀伏特；檢測內標牛磺熊去氧膽酸鈉時錐孔電壓是30伏特；碎裂能量和碎片離子在檢測黃嘌呤和內標牛磺熊去氧膽酸鈉時也是不同的檢測 黃嘌呤時碎裂能量是20，碎片離子是107. 98 ；檢測內標牛磺熊去氧膽酸鈉時碎裂能量是 30，碎片離子是124. 08 ；對照品，空白樣品和樣品檢測均按上述的超高效液相色譜和質譜條件分別進行檢 測；
(5)數據處理分別根據對對照品，空白樣品和樣品測得的峰面積比值在線性方程中求得對照 品，空白樣品和樣品中黃嘌呤濃度，黃嘌呤氧化酶抑制劑對黃嘌呤氧化酶的抑制率按照以 下公式計算I樣品=(C樣品-C對照)/(C空白-C對照)X100%式中，I為黃嘌呤氧化酶抑制劑對黃嘌呤氧化酶的抑制率；C#s為根據線性方程求得的樣品中黃嘌呤濃度，量綱為微摩爾/升；Cw為根據線性方程求得的對照品中黃嘌呤的濃度，量綱為微摩爾/升；Cse為根據線性方程求得的空白樣品中黃嘌呤濃度，量綱為微摩爾/升。經計算得到20微摩爾/升別嘌呤醇對黃嘌呤氧化酶的抑制率I為80 %。結果參 見圖1到圖10。實施例2所述的樣品如下反應總體積200微升，終濃度100納摩爾/升的黃嘌呤氧化酶與 終濃度為20微摩爾/升的異鼠李素於37°C孵育30分鐘，加入終濃度100微摩爾/升的底 物黃嘌呤，37°C反應5分鐘後，加入800微升的甲醇終止反應，加入終濃度為1微摩爾/升 的內標牛磺熊去氧膽酸鈉，作為樣品；供超高效液相色譜和質譜聯用測定；其餘的同實施例1;按照實施例1的檢測步驟檢測並計算得到20微摩爾/升異鼠李素標準品對黃嘌 呤氧化酶的抑制率為73%。圖11和圖12為實施例2中樣品的提取色譜圖。實施例3所述的樣品如下反應總體積200微升，終濃度100納摩爾/升的黃嘌呤氧化酶與 終濃度為20微摩爾/升的染料木素於37°C孵育30分鐘，加入終濃度100微摩爾/升的底 物黃嘌呤，37°C反應5分鐘後，加入800微升的甲醇終止反應，加入終濃度為1微摩爾/升 的內標牛磺熊去氧膽酸鈉，作為樣品；供超高效液相色譜和質譜聯用測定；其餘的同實施例1;按照實施例1的檢測步驟檢測並計算得到20微摩爾/升染料木素標準品對黃嘌 呤氧化酶的抑制率為50%。圖13和圖14為實施例3中樣品的提取色譜圖。實施例4所述的樣品如下反應總體積200微升，終濃度100納摩爾/升的黃嘌呤氧化酶與 終濃度為0. 1毫克/毫升的銀杏水提物於37°C孵育30分鐘，加入終濃度100微摩爾/升 的底物黃嘌呤，37°C反應5分鐘後，加入800微升的甲醇終止反應，加入終濃度為1微摩爾 /升的內標牛磺熊去氧膽酸鈉，作為樣品；供超高效液相色譜和質譜聯用測定；其餘的同實施例1 ；按照實施例1的檢測步驟檢測並計算得到0. 1毫克/毫升的銀杏水提物對黃嘌呤 氧化酶的抑制率為27%。圖15和圖16為實施例4中樣品的提取色譜圖。
權利要求
1.超高效液相色譜和質譜聯用篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑的方法，其包括以下步驟 所述的超高效液相色譜，與高效液相色譜相比具有超高分離度，超高速度和超高靈敏度；所述的黃嘌呤氧化酶抑制劑是天然產物提取物或單體；(1)酶促反應緩衝液的配製酶促反應緩衝液包括50毫摩爾/升三羥甲基氨基甲烷，7毫摩爾/升鹽酸，1毫摩爾/ 升乙二胺四乙酸二鈉鹽，pH值為8. 9 ；(2)標準品的配製用2摩爾/升的氨水溶液將標準品分別配成濃度為1微摩爾/升、2微摩爾/升、5微 摩爾/升、10微摩爾/升、15微摩爾/升或20微摩爾/升的標準溶液，且每個濃度的標準 品溶液均含1微摩爾/升的牛磺熊去氧膽酸鈉作為內標；所述的標準品為黃嘌呤；黃嘌呤 是黃嘌呤氧化酶的底物；(3)對照品、空白樣品和樣品的酶促反應對照品的配製反應總體積200微升，終濃度100納摩爾/升的黃嘌呤氧化酶，在37°C 孵育30分鐘，加入終濃度100微摩爾/升的底物黃嘌呤，37°C反應5分鐘後，加入800微升 的甲醇終止反應，加入終濃度為1微摩爾/升的內標牛磺熊去氧膽酸鈉，作為對照品；供超 高效液相色譜和質譜聯用測定；空白樣品的配製反應總體積200微升，不加黃嘌呤氧化酶，加入終濃度100微摩爾/ 升的底物黃嘌呤，37°C反應5分鐘後，加入800微升的甲醇終止反應，加入終濃度為1微摩 爾/升的內標牛磺熊去氧膽酸鈉，作為空白樣品；供超高效液相色譜和質譜聯用測定；樣品的配製反應總體積200微升，終濃度100納摩爾/升的黃嘌呤氧化酶與終濃度為 20微摩爾/升的黃嘌呤氧化酶抑制劑於37°C孵育30分鐘，加入終濃度100微摩爾/升的 底物黃嘌呤，37°C反應5分鐘後，加入800微升的甲醇終止反應，加入終濃度為1微摩爾/ 升的內標牛磺熊去氧膽酸鈉，作為樣品；供超高效液相色譜和質譜聯用測定；(4)標準品、對照品、空白樣品和樣品的檢測對標準品檢測採用牛磺熊去氧膽酸鈉為內標，以內標法定量，對步驟O)的系列標準 品溶液進行超高效液相色譜和質譜檢測，從總離子流圖中提取黃嘌呤和牛磺熊去氧膽酸鈉 的色譜圖，分別積分求峰面積，以所述的標準品濃度為橫坐標，以黃嘌呤與牛磺熊去氧膽酸 鈉峰面積比值為縱坐標，在所述的標準品濃度為1微摩爾/升至20微摩爾/升範圍內，用 微軟公司(Microsoft)的Excel軟體得到黃嘌呤的線性方程 y = ax+b式中，y為所述的標準品黃嘌呤與內標牛磺熊去氧膽酸鈉峰面積比值；χ為標準品的濃 度，量綱為微摩爾/升；a、b為軟體計算得到的常數；同時該軟體計算得到相關係數R2 ； ①超高效液相色譜的檢測條件 超高效液相色譜儀Waters ACQUITY ；色譜柱:ffaters ACQUITY UPLC BEH C18 (2. 1 X 50 毫米，1. 7 微米)； 流動相甲醇㈧和水⑶；梯度洗脫程序0 1分鐘，20% A 60% A ;1 2分鐘，60% A 100% A ;2 3分 鍾，100% A 20% A ;3 5分鐘，20% A ；所指的百分比均為體積百分比；流速0. 2毫升/分鐘； 進樣量5微升； ②質譜條件質譜儀Waters Xevo TQ ；離子源電噴霧(ESI)電離源負離子模式；毛細管電壓2000伏特；去溶劑氣氮氣溫度350攝氏度；去溶劑氣氮氣流速800升/小時；錐孔氣氮氣流速50升/小時；碰撞氣氬氣流速0. 15升/小時；第一個四極杆的低端解析度為3. 0 ；高端解析度為15. 0 ；離子能量為0. 5 ； 第二個四極杆的低端解析度為3. 0 ；高端解析度為13. 5 ；離子能量為0. 5 ； 以上所述質譜條件在檢測黃嘌呤和內標牛磺熊去氧膽酸鈉時是相同的； 錐孔電壓在檢測黃嘌呤和內標牛磺熊去氧膽酸鈉時是不同的檢測黃嘌呤時錐孔電壓 是觀伏特；檢測內標牛磺熊去氧膽酸鈉時錐孔電壓是30伏特；碎裂能量和選擇的碎片離子在檢測黃嘌呤和內標牛磺熊去氧膽酸鈉時也是不同的檢 測黃嘌呤時碎裂能量是20，碎片離子是107. 98 ；檢測內標牛磺熊去氧膽酸鈉時碎裂能量是 30，碎片離子是124. 08 ；對照品，空白樣品和樣品檢測均按上述的超高效液相色譜和質譜條件分別進行檢測； (5)黃嘌呤氧化酶抑制劑對黃嘌呤氧化酶的抑制率黃嘌呤氧化酶抑制劑天然產物提取物或單體抑制黃嘌呤氧化酶的活性從而導致酶促 反應底物黃嘌呤的剩餘量增加，產物尿酸的量減少；所以抑制劑對黃嘌呤氧化酶的抑制率 可以通過底物黃嘌呤含量或者產物尿酸含量的變化進行評價；本發明是利用底物黃嘌呤含 量的變化進行計算的；分別根據對對照品、空白樣品和樣品測得的峰面積比值在線性方程中求得對照品、空 白樣品和樣品中黃嘌呤濃度，黃嘌呤氧化酶抑制劑對黃嘌呤氧化酶的抑制率按照以下公式 計算ι樣品=(C樣品-C對照)/(C空白-C對照)X 100%式中，I為黃嘌呤氧化酶抑制劑對黃嘌呤氧化酶的抑制率； c#s為根據線性方程求得的樣品中黃嘌呤濃度，量綱為微摩爾/升； Cm為根據線性方程求得的對照品中黃嘌呤的濃度，量綱為微摩爾/升； Cse為根據線性方程求得的空白樣品中黃嘌呤濃度，量綱為微摩爾/升。
2.如權利要求1所述的一種超高效液相色譜和質譜聯用篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑的 方法，其特徵在於，所述的黃嘌呤氧化酶抑制劑是別嘌呤醇。
3.如權利要求1所述的一種超高效液相色譜和質譜聯用篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑的 方法，其特徵在於，所述的黃嘌呤氧化酶抑制劑是異鼠李素。
4.如權利要求1所述的一種超高效液相色譜和質譜聯用篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑的 方法，其特徵在於，所述的黃嘌呤氧化酶抑制劑是染料木素。
5.如權利要求1所述的一種超高效液相色譜和質譜聯用篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑的方法，其特徵在於，所述的黃嘌呤氧化酶抑制劑是銀杏水提物。
全文摘要
本發明提供了一種超高效液相色譜和質譜聯用篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑的方法，用於分析天然產物提取物或單體對黃嘌呤氧化酶體外抑制率以及黃嘌呤氧化酶催化活性。將超高效液相色譜和質譜聯用方法應用到酶抑制劑篩選中，樣品檢測快速、準確，線性方程相關係數達到0.998，質譜針對化合物質量電荷比進行檢測，精確度高，特異性好，避免了光譜法篩選中的假陽性和假陰性結果，可用於黃嘌呤氧化酶抑制劑的篩選，並且可用於黃嘌呤氧化酶的動力學研究。得到20微摩爾/升濃度別嘌呤醇的抑制率I為80％。得到20微摩爾/升異鼠李素的抑制率為73％。得到20微摩爾/升染料木素的抑制率為50％。得到0.1毫克/毫升銀杏水提物的抑制率為27％。
文檔編號G01N30/06GK102095825SQ20101057753
公開日2011年6月15日 申請日期2010年12月8日 優先權日2010年12月8日
發明者劉志強, 劉淑瑩, 劉舒, 宋鳳瑞, 邢俊鵬, 鄭重 申請人:中國科學院長春應用化學研究所