廣東崖豆藤的組培育苗方法
2023-06-14 17:18:26 1
廣東崖豆藤的組培育苗方法
【專利摘要】本發明公開一種廣東崖豆藤的組培育苗方法。本發明的方法包括種子消毒與催芽、選萌發的無菌胚軸為外植體、不定芽增殖、生根培養、煉苗和移栽，獲得廣東崖豆藤種苗。其中，繼代增殖培養基的組成為MS培養基+6-BA 0.3～0.5mg/L+TDZ 0.06～0.1mg/L+NAA 0.15～0.3mg/L+蔗糖30g/L+卡拉膠5.8g/L，pH值5.5～5.8。利用本發明的方法培育廣東崖豆藤種苗具有遺傳穩定性好、繁殖速度快、育苗周期短、成本低廉、操作簡便的特徵；且實驗設施要求不高，操作過程簡單，實現了規模化繁殖廣東崖豆藤種苗，結果穩定可靠。
【專利說明】廣東崖豆藤的組培育苗方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於應用生物學、農業生物【技術領域】，特別涉及一種廣東崖豆藤的組培育苗方法。
【背景技術】
[0002]廣東崖豆藤(Millettia fordii Dunn)產於廣東、廣西，生於海拔500米左右的山谷疏林中。藤本；羽狀複葉；總狀花序通常腋生；莢果線形；種子褐色，卵形，長約7毫米，寬約6毫米，光滑；花期9?10月，果期11月。
[0003]民間認為廣東崖豆藤具有潤肺止咳、健脾補虛、壯陽補腎等功效。因此，在廣西梧州地區和廣州帽峰山一帶，盛行用廣東崖豆藤的根與豬骨配伍煲湯。由於人工無序採挖，導致野外資源日漸減少，市場價格逐年升高。廣州市大有玉鉉農業發展有限公司為緩解市場的緊缺需求，決定建立廣東崖豆藤的規模化人工種植基地。但因廣東崖豆藤目前仍屬野生狀態，種子來源極少，扦插繁殖速度慢，急需解決種苗的供應問題。
[0004]植物的組織培養快繁技術具有佔用空間小，不受地區、季節限制，投資少，經濟效益高等優勢，通過無菌操作，在人工控制條件下短時間大量繁殖目標植物，獲得再生的完整植株。迫切需要研宄開發廣東崖豆藤的組織培養技術，通過組培技術實現廣東崖豆藤種苗的規模化繁殖，解決廣東崖豆藤種子少、制約生產發展的難題。
【發明內容】
[0005]為了克服現有繁殖技術的缺點與不足，本發明的目的在於提供一種廣東崖豆藤的組培育苗方法。利用該方法培育廣東崖豆藤種苗具有遺傳穩定性好、繁殖速度快、育苗周期短、成本低廉、操作簡便的特徵；且實現了規模化繁殖廣東崖豆藤種苗，結果穩定可靠。
[0006]本發明的目的通過下述技術方案實現:一種廣東崖豆藤的組培育苗方法，包括種子消毒與催芽、不定芽增殖、生根培養和試管苗移栽步驟:將均勻飽滿的廣東崖豆藤種子用體積濃度為75%的酒精和lg/L的氯化汞消毒後，播入無菌的溼潤紗布或MS培養基中；以萌芽種子的胚軸為外植體，在MS+6BA+TDZ+NAA培養基上進行不定芽分化、增殖，在1/2MS+IBA培養基上進行生根培養，生根苗煉苗後移栽，形成完成的植株再生體系。
[0007]所述的廣東崖豆藤的組培育苗方法，包括如下步驟:
[0008](I)種子消毒與催芽:選擇均勻飽滿的廣東崖豆藤(Millettia fordii Dunn)種子，先用自來水衝洗，再在無菌室消毒後，進行催芽；
[0009](2)選擇外植體:選擇步驟⑴催芽後萌發的無菌胚軸為外植體；
[0010](3)不定芽增殖:將步驟(2)的外植體接種於繼代增殖培養基上，進行增殖培養，獲得不定芽；
[0011](4)生根培養:將步驟(3)獲得的不定芽，接種於生根培養基上誘導生根，獲得生根苗；
[0012](5)煉苗和移栽:將步驟(4)獲得的生根苗，煉苗後移栽，獲得廣東崖豆藤種苗。
[0013]步驟(I)中所述的消毒的條件優選為用75% (v/v)酒精消毒8?15min，用無菌水衝洗2?3次；再用lg/L氯化汞消毒4?8min，用無菌水衝洗4?6次；
[0014]步驟(I)中所述的催芽的條件優選為將消毒後的種子接種到無菌的溼潤紗布或MS培養基中，催芽20?30天，溫度20?25 °C，光照時間12h/d、光照強度2，000?3，OOOlux ；
[0015]步驟(3)中所述的繼代增殖培養基的組成優選為MS培養基+6-BA 0.3?0.5mg/L+TDZ 0.06 ?0.lmg/L+NAA 0.15 ?0.3mg/L+蔗糖 30g/L+卡拉膠 5.8g/L，pH值 5.5 ?5.8 ；所述的6-BA指6-苄基腺嘌呤；所述的NAA，指a-萘乙酸；所述的TDZ指噻重氮苯基脲，商品名噻苯隆(Thidiazuron，N-Phenyl_N，-l，2, 3-thiadiazol_5-ylurea，N-苯基-N-1, 2, 3-噻二唑-5-脲，TDZ)；
[0016]步驟(3)中所述的培養的條件優選為溫度24?30°C，培養24?30天、相對溼度60%?70%、光照時間12h/d、光照強度2，000?3，OOOlux ；
[0017]步驟(4)中所述的生根培養基的組成優選為1/2MS培養基+IBA 0.3?0.4mg/L+蔗糖15g/L+卡拉膠5.8g/L，pH值5.5?5.8 ;所述的IBA，指吲哚丁酸；所述的1/2MS培養基是指MS培養基的大量元素減半；
[0018]步驟(4)中所述的誘導生根的條件優選為溫度28?32°C，相對溼度75%?90%，光照條件為接種後先暗培養5天、隨後用自然散射光培養25?30天，光照時間12h/d ;
[0019]步驟(5)中所述的煉苗的條件優選為將生根苗轉入薄膜大棚後，煉苗25?30天；
[0020]步驟(5)中所述的移栽的條件優選為煉苗後移栽至黃心土中，覆蓋薄膜，加蓋遮陽網，移栽7?10天後，噴施0.1 % (m/m)的殺菌藥一次，30?40天後掀去薄膜和遮陽網；
[0021]本發明相對於現有技術具有如下的優點及效果:
[0022](I)通過本發明的方法獲得的種苗遺傳性狀好，結果穩定可靠。本發明採用的材料為優良種子，依據植物細胞的全能性，每個種子繁育的後代遺傳性非常一致，能夠保持原有品種的優良性狀。
[0023](2)實驗設施要求不高，操作過程簡單。採用本發明培育廣東崖豆藤種苗，所需的儀器和藥品均為組培常規設備和常用藥品，所涉及的外植體選擇與消毒、不定芽增殖、生根培養和試管苗移栽等操作過程，一般人員經過培訓均可達到技術要求，一般的組培廠均能依照本發明開展廣東崖豆藤的組培生產。
[0024](3)本發明的方法具有繁殖速度快、育苗周期短、成本低廉的特點。
[0025](4)繁殖係數高，可規模化生產廣東崖豆藤種苗。本發明的廣東崖豆藤組培育苗技術，是在人工控制條件下的進行生產，受自然環境中影響較小；只需截取種子胚軸作為繁殖材料，25天增殖一次，增殖倍數達到4.2，30天可完成生根培養，生根率達到60%以上；利用本發明可以周年開展、工廠化大量繁殖廣東崖豆藤種苗。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0026]圖1是實施例1中接種到繼代增殖培養基10天後不定芽增殖的示意圖。
[0027]圖2是實施例1中接種到繼代增殖培養基25天後不定芽增殖的示意圖。
[0028]圖3是實施例1中接種到生根培養基20天後生根苗的示意圖。
[0029]圖4是實施例1中接種到生根培養基30天後生根苗的示意圖。
[0030]圖5是實施例1中移栽以黃心土為基質的育苗袋中15天後生根苗的示意圖。
[0031]圖6是實施例1中移栽以黃心土為基質的育苗袋中30天後生根苗的示意圖。
[0032]圖7是實施例2中接種到繼代增殖培養基13天後不定芽增殖的示意圖。
[0033]圖8是實施例2中接種到繼代增殖培養基28天後不定芽增殖的示意圖。
[0034]圖9是實施例2中接種到生根培養基20天後生根苗的示意圖。
[0035]圖10是實施例2中接種到生根培養基30天後生根苗的示意圖。
[0036]圖11是實施例2中移栽以黃心土為基質的育苗袋中10天後生根苗的示意圖。
[0037]圖12是實施例2中移栽以黃心土為基質的育苗袋中25天後生根苗的示意圖。
[0038]圖13是實施例3中接種到繼代增殖培養基15天後不定芽增殖的示意圖。
[0039]圖14是實施例3中接種到繼代增殖培養基25天後不定芽增殖的示意圖。
[0040]圖15是實施例3中接種到生根培養基15天後生根苗的示意圖。
[0041]圖16是實施例3中接種到生根培養基30天後生根苗的示意圖。
[0042]圖17是實施例3中移栽以黃心土為基質的育苗袋中12天後生根苗的示意圖。
[0043]圖18是實施例3中移栽以黃心土為基質的育苗袋中30天後生根苗的示意圖。
【具體實施方式】
[0044]下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限於此。
[0045]實施例1
[0046](I)種子消毒與催芽:廣東崖豆藤(Millettia fordii Dunn)種子購自廣州市大有玉鉉農業發展有限公司；挑選成熟、飽滿、均勻的種子，用自來水仔細清洗表皮後，放置於超淨工作檯上；在消毒瓶中倒入75%的酒精，左右晃動，消毒8min，用無菌水衝洗2次；再倒入lg/L的氯化汞消毒4min，最後用無菌水衝洗4次；放置在無菌的溼潤紗布中，用紗布把種子覆蓋。消毒後種子的無汙染率可達70.6%。
[0047](2)選擇外植體:種子接種15天後，開始萌芽；30天時，萌芽長至3cm高，挑選無汙染的健壯的萌芽條，切掉胚根和子葉後，取胚軸作為外植體。總發芽率達85.0%。
[0048](3)不定芽增殖:將步驟(2)獲得的外植體接種於繼代增殖培養基(MS培養基+6-BA 0.3mg/L+TDZ 0.lmg/L+NAA 0.15mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 卡拉膠 5.8g/L，pH 值 5.5)上，進行增殖培養，獲得不定芽；培養條件:溫度24°C、相對溼度60%、光照時間12h/d、光強強度3，OOOlux，每25天將增殖的不定芽轉接一次，試驗結果見圖1和圖2 ;繼代增殖倍數可達
3.2。
[0049](4)生根培養:將步驟(3)獲得的不定芽，在超淨工作檯上切成2?2.5cm長，接種於生根培養基(1/2MS培養基+IBA 0.3mg/L+蔗糖15g/L+卡拉膠5.8g/L，pH值5.5)上培養，獲得生根苗；培養條件:溫度28°C、相對溼度75%、光照條件為接種後先暗培養5天、隨後用自然散射光培養25天，光照時間12h/d，試驗結果見圖3和圖4 ;生根率達62%。
[0050](5)煉苗和移栽:將步驟(4)獲得的生根苗轉入薄膜大棚後，煉苗30天、待根系長至I?2cm後，取出瓶苗，洗掉培養基後移栽至黃心土中，覆蓋薄膜，加蓋遮陽網，移栽7天後，噴0.1% (m/m)的殺菌藥一次，30天後掀去薄膜和遮陽網，獲得廣東崖豆藤種苗，用苗圃的常規方法進行管理，試驗結果見圖5和圖6。
[0051]實施例2
[0052](I)種子消毒與催芽:廣東崖豆藤(Millettia fordii Dunn)種子購自廣州市大有玉鉉農業發展有限公司；挑選成熟、飽滿、均勻的種子，用自來水仔細清洗表皮後，放置於超淨工作檯上；在消毒瓶中倒入75%的酒精，左右晃動，消毒12min，用無菌水衝洗2次；再倒入lg/L的氯化未消毒6min，最後用無菌水衝洗4次；放置在無菌的溼潤紗布中，用紗布把種子覆蓋。消毒後種子的無汙染率可達73%。
[0053](2)選擇外植體:種子接種15天後，開始萌芽；30天時，萌芽長至3cm高，挑選無汙染的健壯的萌芽條，切掉胚根和子葉後，取胚軸作為外植體。總發芽率達85.2%。
[0054](3)不定芽增殖:將步驟(2)獲得的外植體接種於繼代增殖培養基(MS培養基+6-BA 0.4mg/L+TDZ 0.08mg/L+NAA 0.2mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 卡拉膠 5.8g/L，pH 值 5.6)上，進行增殖培養，獲得不定芽；培養條件:溫度28°C、相對溼度65%、光照時間12h/d、光強強度2，5001ux,每25天將增殖的不定芽轉接一次，試驗結果見圖7和圖8 ;繼代增殖倍數可達
3.8。
[0055](4)生根培養:將步驟(3)獲得的不定芽，接種於生根培養基(1/2MS培養基+IBA0.35mg/L+蔗糖15g/L+卡拉膠5.8g/L，pH值5.7)上培養，獲得生根苗；培養條件:溫度30°C、相對溼度80%、光照條件為接種後先暗培養5天、隨後用自然散射光培養25天，光照時間12h/d，試驗結果見圖9和圖10 ;生根率達64%。
[0056](5)煉苗和移栽:將步驟(4)獲得的生根苗轉入薄膜大棚後，煉苗30天、待根系長至I?2cm後，取出瓶苗，洗掉培養基後移栽至黃心土中，覆蓋薄膜，加蓋遮陽網，移栽8天後，噴0.1% (m/m)的殺菌藥一次，35天後掀去薄膜和遮陽網，獲得廣東崖豆藤種苗，用苗圃的常規方法進行管理，試驗結果見圖11和圖12。
[0057]實施例3
[0058](I)種子消毒與催芽:廣東崖豆藤(Millettia fordii Dunn)種子購自廣州市大有玉鉉農業發展有限公司；挑選成熟、飽滿、均勻的種子，用自來水仔細清洗表皮後，放置於超淨工作檯上；在消毒瓶中倒入75%的酒精，左右晃動，消毒15min，用無菌水衝洗2次；再倒入lg/L的氯化汞消毒8min，最後用無菌水衝洗4次；放置在無菌的溼潤紗布中，用紗布把種子覆蓋。消毒後種子的無汙染率可達90%。
[0059](2)選擇外植體:種子接種15天後，開始萌芽；30天時，萌芽長至3cm高，挑選無汙染的健壯的萌芽條，切掉胚根和子葉後，取胚軸作為外植體。總發芽率達86%。
[0060](3)不定芽增殖:將步驟(2)獲得的外植體接種於繼代增殖培養基(MS培養基+6-BA 0.5mg/L+TDZ 0.lmg/L+NAA 0.3mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 卡拉膠 5.8g/L，pH 值 5.8)上，進行增殖培養，獲得不定芽；培養條件:溫度30°C、相對溼度70%、光照時間12h/d、光強強度2，OOOlux，每25天將增殖的不定芽轉接一次，試驗結果見圖13和圖14 ;繼代增殖倍數可達
4.2。
[0061](4)生根培養:將步驟(3)獲得的不定芽，接種於生根培養基(1/2MS培養基+IBA0.4mg/L+蔗糖15g/L+卡拉膠5.8g/L，pH值5.8)上培養，獲得生根苗；培養條件:溫度32°C、相對溼度90%、光照條件為接種後先暗培養5天、隨後用自然散射光培養25天，光照時間12h/d，試驗結果見圖15和圖16 ;生根率達64.6%。
[0062](5)煉苗和移栽:將步驟(4)獲得的生根苗轉入薄膜大棚後，煉苗30天、待根系長至I?2cm後，取出瓶苗，洗掉培養基後移栽至黃心土中，覆蓋薄膜，加蓋遮陽網，移栽10天後，噴0.1% (m/m)的殺菌藥一次，40天後掀去薄膜和遮陽網，獲得廣東崖豆藤種苗，用苗圃的常規方法進行管理，試驗結果見圖17和圖18。
[0063]上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護範圍之內。
【權利要求】
1.一種廣東崖豆藤的組培育苗方法，其特徵在於包括如下步驟: (1)種子消毒與催芽:選擇均勾飽滿的廣東崖豆藤(Millettiafordii Dunn)種子，先用自來水衝洗，再在無菌室消毒後，進行催芽； (2)選擇外植體:選擇步驟(I)催芽後萌發的無菌胚軸為外植體； (3)不定芽增殖:將步驟(2)的外植體接種於繼代增殖培養基上，進行增殖培養，獲得不定芽； (4)生根培養:將步驟(3)獲得的不定芽，接種於生根培養基上誘導生根，獲得生根苗； (5)煉苗和移栽:將步驟(4)獲得的生根苗，煉苗後移栽，獲得廣東崖豆藤種苗； 步驟(3)中所述的繼代增殖培養基的組成為MS培養基+6-BA 0.3?0.5mg/L+TDZ0.06 ?0.lmg/L+NAA 0.15 ?0.3mg/L+ 鹿糖 30g/L+ 卡拉膠 5.8g/L，pH 值 5.5 ?5.8。
2.根據權利要求1所述的廣東崖豆藤的組培育苗方法，其特徵在於: 步驟(I)中所述的消毒的條件為用體積分數75%酒精消毒8?15min，用無菌水衝洗2?3次；再用lg/L氯化未消毒4?8min，用無菌水衝洗4?6次。
3.根據權利要求1所述的廣東崖豆藤的組培育苗方法，其特徵在於: 步驟(I)中所述的催芽的條件為將消毒後的種子接種到無菌的溼潤紗布或MS培養基中，催芽20?30天，溫度20?25°C，光照時間12h/d、光照強度2，000?3，OOOlux。
4.根據權利要求1所述的廣東崖豆藤的組培育苗方法，其特徵在於: 步驟(3)中所述的培養的條件為溫度24?30°C，培養24?30天、相對溼度60%?70%、光照時間12h/d、光照強度2，000?3，OOOlux。
5.根據權利要求1所述的廣東崖豆藤的組培育苗方法，其特徵在於: 步驟⑷中所述的生根培養基的組成為1/2MS培養基+IBA 0.3?0.4mg/L+蔗糖15g/L+ 卡拉膠 5.8g/L，pH 值 5.5 ?5.8。
6.根據權利要求1所述的廣東崖豆藤的組培育苗方法，其特徵在於: 步驟(4)中所述的誘導生根的條件為溫度28?32°C，相對溼度75%?90%，光照條件為接種後先暗培養5天、隨後用自然散射光培養25?30天，光照時間12h/d。
7.根據權利要求1所述的廣東崖豆藤的組培育苗方法，其特徵在於: 步驟(5)中所述的煉苗的條件為將生根苗轉入薄膜大棚後，煉苗25?30天。
8.根據權利要求1所述的廣東崖豆藤的組培育苗方法，其特徵在於: 步驟(5)中所述的移栽的條件為煉苗後移栽至黃心土中，覆蓋薄膜，加蓋遮陽網，移栽7?10天後，噴施質量百分比0.1 %的殺菌藥一次，30?40天後掀去薄膜和遮陽網。
【文檔編號】A01H4/00GK104429971SQ201410798739
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月18日 優先權日:2014年12月18日
【發明者】曾雷, 謝鑑能, 溫依嬌 申請人:曾雷, 謝鑑能