分離和測定胰酶製劑樣品中病毒載量的方法

2023-06-14 05:34:11 1

)的目的特別是確定在所有情況中本發明的方法對於所使用的病毒的檢測限。如果考慮到到變異的一般可接受的病毒對數值範圍是0.5，在超速離心後的下層級分中至少大約定量恢復初始加入的刺狀病毒製品的病毒滴度，那麼就認為用逐漸降低的病毒滴度定量測定個體試驗樣品中的病毒載量就是成功的。a.用EMCV進行低刺突測試製備PAN混懸液(用2.5g的豬胰酶製劑，2.5ml的抗生素溶液，20ml的Dulbecco培養基)。然後以互相獨立的測定中，以一式兩份進行低刺突測試在第一個測定中，由PAN混懸液和EMCV刺狀病毒溶液製備下列的批次1)4.5ml的胰酶製劑的混懸液+0.5ml的10_3刺狀病毒的稀釋液；得到稀釋液10一4;2)4.5ml的胰酶製劑的混懸液+0.5ml的l(T刺狀病毒的稀釋液；得到稀釋液10—5;3)4.5ml的胰酶製劑的混懸液+0.5ml的10—5刺狀病毒的稀釋液；等等。4)4.5ml的胰酶製劑的混懸液+0.5ml的10—6刺狀病毒的稀釋液；5)4.5ml的胰酶製劑的混懸液+0.5ml的l(T刺狀病毒的稀釋液；6)4.5ml的胰酶製劑的混懸液+0.5ml的10—8刺狀病毒的稀釋液.在室溫下將所有的批次培養1小時，然後在4t)下以4，000rpm(2，700xg)低速離心分離15分鐘。在所有情況下，將低速離心分離後的上清液轉移到新的離心管中，然後在相同條件下進行另一次低速離心分離。如果必要，用細胞培養基將低速離心分離後的上清液加至體積為5.0ml,在所有情況下，將低速離心分離後的5.0ml的上清液在如上文實施例1所述的不連續的蔗糖梯度中進行超速離心。在超速離心後，在所有情況下用振動泵泵出上層級分(-"EMCV下層級分2";下至超速離心管的1.5cm)，用吸量管從超速離心管中吸出各個下層級分(-"EMCV下層級分3")。在所有情況下，用MEM將超速離心後的下層級分加至5.Oml，然後用於滴定或在組織培養瓶中培養。然後由上述的批次l)到3)分別製備3倍的病毒稀釋液系列，用SPEV細胞混懸液(每孔100的SPEV細胞的新製備的細胞混懸液，濃度為200，000細胞/ml)以12個稀釋步驟，以12平行線的方式轉移。此外，將所有批次的EMCV下層級分3的試驗樣品轉移到底面積為EMCV的細胞培養瓶中，該培養瓶中包含10ml的濃度為200，000細胞/ml的SPEV細胞的新製備的細胞混懸液。為此目的，用0.2ml的試驗樣品EMCV下層級分3感染每個樣品的組織培養瓶。平行地，將不加入物質的一個組織培養瓶作為對照。在36±1C下培養所有的滴定板和組織培養瓶，在6-7天的過程中，通過顯微鏡評價孔或組織培養瓶中的CPE發展。根據Spearman-Karber法計算滴定的試驗樣品的滴度。如果在7天後在一個批次的任意6個組織培養瓶中沒有觀察到CPE,那麼將這些培養瓶在-70t:下冷凍3次，並再次融化。合併所有組織培養瓶的內容物，並過濾通過0.1nm(孔徑)的過濾器。使用所得到的濾液在SPEV細胞混懸液上製備第二代用第一代得到的2ml混懸液來感染分別包含10ml新鮮SPEV細胞混懸液的2個組織培養瓶，然後在36±1C下培養最多7天，並觀察CPE的發展。如果在第二代中也未觀察到CPE，再實施第三代。如果在第三代中也發現了陰性結果，可以認為原試驗樣品不含試驗樣品EMCV。用EMCV的有刻度的稀釋液，在上述低刺突測定中確定所使用的每0.1g的胰酶製劑樣品的EMCV的一個感染單元的根據本發明的方法的檢測限。b.用PPV進行低刺突測試製備PAN混懸液(用2.5g的豬胰酶製劑，2.5ml的抗生素溶液，20ml的Dulbecco培養基)。然後以互相獨立的測定中，以一式兩份進行低刺突測試為此目的，由PAN混懸液和PPV刺狀病毒溶液製備下列的批次1)4.5ml的胰酶製劑的混懸液+0.5ml的10_1刺狀病毒的稀釋液；2)4.5ml的胰酶製劑的混懸液+0.5ml的10_2刺狀病毒的稀釋液；3)4.5ml的胰酶製劑的混懸液+0.5ml的1(T刺狀病毒的稀釋液；4)4.5ml的胰酶製劑的混懸液+0.5ml的IO"刺狀病毒的稀釋液；在室溫下將所有的批次培養1小時，然後在4X:下以4,000rpm(2,700xg)低速離心分離15分鐘。在所有情況下，將低速離心分離後的上清液轉移到新的離心管中，然後在相同條件下進行另一次低速離心分離。如果必要，用細胞培養基將低速離心分離後的上清液加至體積為5.0ml,在所有情況下，將低速離心分離後的5.0ml的上清液在如上文實施例1所述的不連續的蔗糖梯度中進行超速離心分離。在超速離心後，在所有情況下用振動泵泵出上層級分(-"PPV下層級分2";下至超速離心管的1.5cm)，用吸量管從超速離心管中吸出各個下層級分H'PPV下層級分3，，)。在所有情況下，用Dulbecco培養基將超速離心後的下層級分加至5.0ml，然後用於滴定或在組織培養瓶中培養。然後由上述的批次l)到3)分別製備3倍的病毒稀釋液系列，用SK-6細胞混懸液(每孔100—的SK-6細胞的新製備的細胞混懸液，濃度為200，000細胞/ml)以12個稀釋步驟，以12平行線的方式轉移。用0.2ml的PPV下層級分3感染每個批次的6個組織培養瓶。平行地，將不加入物質的一個組織培養瓶作為對照。在36±IC下培養所有的滴定板和組織培養瓶，在6-7天的過程中，通過顯微鏡評價孔或組織培養瓶中的CPE發展。根據Spearman-Karber法計算滴定的試驗樣品的滴度。如果在7天後在一個批次的任意6個組織培養瓶中沒有觀察到CPE，那麼將這些培養瓶在-70'C下冷凍3次，並再次融化。合併所有組織培養瓶的內容物，並過濾通過O.lpm(孔徑)的過濾器。使用所得到的濾液在SK-6細胞混懸液上製備第二代用第一代得到的2ml混懸液來感染分別包含10ml新鮮SK-6細胞混懸液的2個組織培養瓶，然後在36±1C下培養最多7天，並觀察CPE的發展。如果在第二代中也未觀察到CPE，再實施第三代。如果在第三代中也沒有發現CPE，在7天後從第三代的瓶中移出細胞培養基，用水冷的丙酮/曱醇(80:20vol./vol.)固定細胞層。然後通過FITC-標記的抗-PPV抗體(每瓶具有lml的抗體溶液；在37t:下培養60分鐘，用洗滌緩衝液洗滌，隨後在UV光下通過顯微鏡評價)檢測組織培養瓶中受感染的細胞。如果第三代的瓶中不含受感染的細胞，可以認為原試驗樣品不含PPV。用PPV的有刻度的稀釋液，在上述低刺突測定中確定所使用的每0.1g的胰酶製劑樣品的PPV的一個感染單元的根據本發明的方法的檢測限。權利要求1.一種從胰酶製劑樣品中分離病毒載量的方法，包括下列步驟a)製備適合從胰酶製劑樣品中離心分離的液體胰酶製劑試驗樣品，這樣做的話不會改變其病毒載量，b)在一定條件下將步驟a)的胰酶製劑試驗樣品的至少一個限定部分進行至少一次低速離心分離，在該條件下沉降常數≥120S的病毒不會形成沉澱，c)棄去任選在步驟b)的低速離心分離期間出現的任何固體沉澱，保留胰酶製劑試驗樣品的上清液，d)將在步驟c)中獲得的胰酶製劑試驗樣品的上清液的至少一個限定部分在不連續梯度的介質中超速離心，其中選擇超速離心的持續時間和超速離心的相對離心力，以便將病毒載量從胰酶製劑試驗樣品的上清液定量轉運到位於上方的靶級分中或上層最低濃度梯度組分和下層次高濃度梯度組分之間的分界層中，和e)從胰酶製劑試驗樣品的上清液中定量分離包含所述病毒載量的靶級分。2.如權利要求1所要求保護的方法，其中還在步驟e)後的步驟f)中，通過測定包含病毒載量的靶級分中的病毒感染滴度來進行胰酶製劑樣品的病毒載量的定量測定。3.如權利要求2所要求保護的方法，其中在進行病毒載量的定量測定前將稀釋或未稀釋的靶級分通過微過濾器過濾。4.如權利要求1所要求保護的方法，其中在步驟a)中通過將胰酶製劑樣品與適合用於培養待研究的病毒類型的細胞系的細胞培養基和一種或多種抗生素組合將該胰酶製劑試驗樣品製備成胰酶製劑試驗樣品的混懸液。5.如權利要求4所要求保護的方法，其中將溫度冷卻至0-15X:以進行胰酶製劑試驗樣品的混懸液的製備。6.如權利要求1所要求保護的方法，其中在所有情況中，以小於的相對離心力來進行步驟b)的低速離心分離。7.如權利要求1所要求保護的方法，其中在所有情況中，以1，500-5,000xg的相對離心力來進行步驟b)的低速離心分離。8.如權利要求1所要求保護的方法，其中進行步驟b)的低速離心分離的持續時間是至少5分鐘。9.如權利要求1所要求保護的方法，其中進行步驟d)的超速離心，其持續時間是至少l小時，相對離心力是至少100,000xg。10.如權利要求9所要求保護的方法，其中進行步驟d)的超速離心，其持續時間是2-8小時，相對離心力是200，000-350，000xg,11.如權利要求1所要求保護的方法，其中在所有情況中，將溫度冷卻至0-15。C以進行步驟b)的低速離心分離和步驟d)的超速離心。12.如權利要求1所要求保護的方法，其中在步驟d)中引入的不連續梯度的介質是不連續的雙相蔗糖梯度。13.如權利要求12所要求保護的方法，其中不連續梯度的介質是由50%(wt./vol.)緩衝蔗糖溶液和20%(wt./vol.)緩衝蔗糖溶液製備的梯度。14.如權利要求1所要求保護的方法，其中胰酶製劑樣品是豬的胰酶製劑樣品。15.如權利要求1所要求保護的方法，其中胰酶製劑試驗樣品的病毒載量包含牛輪狀病毒A、腦炎心肌炎病毒、豬環病毒、豬細小病毒、豬輪狀病毒A、豬輪狀病毒和/或豬水泡病病毒。16.—種胰酶製劑試驗樣品的混懸液，通過權利要求4的方法的步驟a)可得到的，其中通過將胰酶製劑樣品與適合用於培養待研究的病毒類型的細胞系的細胞培養基和一種或多種抗生素組合將該胰酶製劑試驗樣品製備成胰酶製劑試驗樣品的混懸液。17.—種胰酶製劑試驗樣品的上清液，通過權利要求l的方法的步驟a)-c)可得到的，其中在步驟a)中通過將胰酶製劑樣品與適合用於培養待研究的病毒類型的細胞系的細胞培養基和一種或多種抗生素組合將該胰酶製劑試驗樣品製備成胰酶製劑試驗樣品的混懸液。18.分離的靶級分，通過權利要求1的方法可以獲得。19.如權利要求18所要求保護的分離的靶級分，其中在權利要求1的步驟a)中通過將胰酶製劑樣品與適合用於培養待研究的病毒類型的細胞系的細胞培養基和一種或多種抗生素組合將該胰酶製劑試驗樣品製備成胰酶製劑試驗樣品的混懸液。全文摘要本發明描述了從胰酶製劑樣品中分離病毒載量和定量測定胰酶製劑樣品中病毒載量的方法。文檔編號C12N9/94GK101448935SQ200780018677公開日2009年6月3日申請日期2007年5月21日優先權日2006年5月22日發明者D·貝歇爾,F·布塞,L·德納,M·弗林克申請人:索爾瓦藥物有限公司