樹莓果實中超氧化物歧化酶的提取方法

2023-06-14 05:32:41 2

專利名稱：:樹莓果實中超氧化物歧化酶的提取方法
技術領域：
：本發明涉及超氧化物歧化酶的提取技術，特別是樹莓果實中超氧化物歧化酶的提取技術。技術背景超氧化物歧化酶(以下簡稱SOD)對於人類健康極為重要，醫學及'生物化學研究結果表明，它具有防衰老、防癌、防心腦血管疾病的功能。因而SOD製劑被列為國家優先發展的高新技術，列為第31項。由於人工還不能合成SOD,現在只能從動植物中提出SOD。藥品級SOD每毫克價格為200元~20000元，為食品級SOD價格的一千倍，因而提取高純度SOD的醫學價值及經濟意義重大。從動物血中提SOD的方法已有很多專利發表。它們的共同特點是工藝流程長，質量較差，產品單一，浪費資源。本發明採用了新的工藝，從樹莓果實中提取SOD，其特點及先進性如下-1、本發明採用了適合於工業化生產的工藝流程，特別是在提取SOD的工藝過程中的每個工序都是適合產業化的，特別需要指出的在採用凝膠過濾色譜分離SOD時，都是採用製備型設備，而不是分析型設備。2、本發明提取的SOD純度達99n/o以上，適合製藥品級SOD針劑、SOD粉劑(片劑〉。純度高是由工藝特點決定，而不是人工操作決定的。3、本發明充分利用樹莓果實的各種營養成分，除利用SOD外其它成分也得到充分利用，因而在同一工藝過程的不同階段開發出系列產品食品級樹莓SOD高檔果汁、食品級樹莓果汁精華液、藥品級S0D針劑、藥品級SOD粉劑(片劑)。
發明內容1、樹莓果實中SOD的提取涉及四個分離過程(1)S(H)與樹莓果實固性物分離樹莓果實屮SOD存在於線粒體中，首先需將SOD與線粒體分離，使SOD進入果汁中。為此需進行粉碎(搾汁)，膠體磨磨細、均化再磨細。將果汁與固性物分離可採用板框過濾機及離心機分離，濾液為SOD果汁。它用於進一步提取SOD，也可以將它加工為"食品級樹莓SOD高檔果汁"。(2)SOD與小分子及離子分離SOD果汁中還有銅、鋅、鐵、錳、鈣、硒、鍺、鉻、鈦、硼、鎂、鉀、磷、VB1、VB2、VB6、Vc、VE、Vp、水楊酸、糖、胺基酸、胡蘿蔔素、磷酯等小分子及離子。將上述小分子物質及離子與SOD分子分離屬於小分子與大分子的分離，並且屬於水相中的分離，可採用膜分離法、離凝膠過濾色譜分離法。通過上述分離則得到不含有小分子物質及離子的SOD水溶液，還含有其它大分子物質，例如蛋白質。含有小分子的水溶液則可進一步製成"食品級樹莓果汁精華液"。(3〉SOD與蛋白質分離。SOD與蛋白質均屬於大分子(高聚物)，分子量都大於幾萬。樹莓果實中SOD分子量為3.8萬。蛋白質的分子量更高，分子體積更大。可以通過蛋白質變性方法，膜分離，凝膠色譜分離將SOD與蛋白質分離開，得到只含有SOD的水溶液。通過聚乙二醇(PEG)濃縮則得到SOD各種濃度的藥品級SOD針劑。waOD與水分的分離。4將SOD濃縮液中的水分除掉，則得到SOD乾粉。加熱乾燥可導致SOD失掉活性，因而必需採用真空冷凍乾燥。現已有真空冷凍乾燥機可供使用。乾燥後所得SOD乾粉則為藥品級SOD粉劑或製成藥品級SOD片劑。Z、休陣。UU，。T土tE訓丄U任汰JL廿WIW禪-ltji口'J/JfZ;(1)還原劑保護在製備食品級樹莓SOD高檔果汁過程中，在還原劑配料工序中加入異抗壞血酸鈉，加入量為紅樹莓果實的0.001%^U%，通常可採用0.02%，保護SOD在後續加工過程中不被氧化。(2)氮氣保護在氮氣保護下進行粉碎、磨細、均化、離心分離。防止氧氣對SOD的氧化破壞作用。(3)PEG濃縮冷凍乾燥，不採用熱濃縮及加熱乾燥，而採用PEG濃縮和真空冷凍乾燥，保護SOD在濃縮及乾燥過程中不被氧化。(4)氮氣置換產品中不含有氧氣，利用氮氣置換氧，保護SOD在貯存時不被氧化。3、SOD提取採用工業生產可行的分離方法在SOD與小分子分離及SOD與大分子分離過程中均採用可工業化生產的膜分離工藝及製備型凝膠過濾色譜分離工藝。中圖l為SOD與固性物分離工藝流程框圖，其分離後的產品為"食品級樹莓SOD高檔果汁"。中圖2為膜法將SOD與小分子、離子及蛋白質的分離工藝流程框圖，其分離後的產品為"食品級樹莓果汁精華液"、"藥品級SOD針劑"及"藥品級SOD粉劑"。中圖3為製備型凝膠過濾色譜柱層析法將SOD與小分子離子及蛋白質分離工藝流程框圖，其分離後的產品為"食品級樹莓果汁精華液"、"藥品級SOD針劑"及"藥品級SOD粉劑"。具體實施方式將上述發明3項內容通過三個實施例表現出來。實施例l:食品級SOD高檔果汁製造方法實施例1為
發明內容中四個分離過程中的第一個分離過程(SOD與固性物分離)的具體實施方式。它的工藝流程框圖加中圖1所示。對於實施例1工藝流程的某些細節說明如下-1、選果首選樹莓中SOD含量高的品種，採購樹莓果實。樹莓果實要選成熟度適當的果實，即SOD含量最高時期的樹莓果實。不得有腐爛果實。2、洗滌可用0.05%~0.1%KMnO4水溶液消毒8M0min，清水洗23次。3、還原劑配料還原劑配料指將還原劑加入物料中。加入還原劑的目的是保護SOD在加工過程中不被空氣中的氧及其它氧化劑所氧化。對於本工藝過程而言，最合適的還原劑為異抗壞血酸鈉。用量範圍為0.001~0.1%。本實施例l每kg物料加入0.02kg1%異抗壞酸鈉水溶液，即加入0.02%異粒壞血酸鈉。4、氮氣保護粉碎在打漿過程可採用篩網孔為0.4mm~4).5mm的打漿機。打漿過程在氮氣保護罩內進行，也對對打漿機局部氮氣保護，防止SOD在打漿粉碎過程被氧化。5、氮氣保護磨細打漿後的漿料細度不夠細，還需在膠體磨中磨12次。該過程在氮氣保護下進行，防止SOD被氧化。膠體膠要通冷水降溫。6、氮氣保護均化均化是將物料進一步磨細的過程，最終達到SOD分子全部進入水相的目的。可採用連續柱塞式高壓均質機進行均化，均化12遍，工作壓力可選定25MPa。均化過程要有氮氣保護。7、氮氣保護離心分離通過離心分離將果汁與固性物分離，通氮氣保護SOD不被氧化。離心分離所得濾液為SOD果汁。0、私飛置伏Tm熟—飛，晰dW35田tc術"t口'j平"to熟"Vi甘。升口ir'j疋n問口口nrT防止SOD被氧化。9、氮氣保護灌裝防止在灌裝過程中混入空氣中的氧，採用氮氣保護灌裝。10、食品級樹莓S0D高檔果汁產品檢查合格後入庫，放在陰涼處。該產品中的SOD含量、鞣化酸含量、花青素含量、黃酮含量均是所有水果汁中含量最高的，它具有確切的防癌、防衰老、防心腦血管疾病的功效。實施例2膜法提取S0D膜法工藝將發明過程中四個分離過程的第二個分離過程(SOD與小分子分離)、第三個分離過程(SOD與蛋白質分離)及第四個分離過程(SOD與水分子分離〉流程統一起來，三個過程分步進行，每步均有一個產品。實施例2的工藝流程框圖如中圖2所示。對於實施例2工藝流程的某些細節說明如下--1、微濾微米過濾在微米膜過濾器中進行。首先要除去微米級顆粒物及細菌等，採用微米膜過濾。它利用的是篩分原理。微米膜的膜孔徑在可大於O.lnm的範圍內選擇，最小孔徑為0.1拜。實施例2選擇膜孔徑為0.1拜，將大於lMm的所有懸浮固體及細菌過濾掉。微米膜過濾現已有各種型號的生產設備及小規模的實驗設備可供選用。實施例2使用的設備的過濾體積為10L，使用10kg物料較為方便，微米膜安放在過濾溶器的下邊。將物料放入過濾器後，加少許壓力，過濾完成後，收集濾液。用清水洗淨過濾膜，下次過濾備用。所得濾液為不含有微米級固體顆粒，不含有細菌的SOD溶液，但還含有蛋白質及小分子物質。2、超濾超濾在超濾膜過濾器中進行。它利用的是篩分原理。有各種規格超濾膜可選，對有機物截留分子量從1萬~10萬道爾頓超濾膜可供選擇。實施例2選擇截留分子量為5萬道爾頓的篩孔超濾膜過濾機。將上述近10kg物料放入超濾機中，加適當壓力，過濾後收集濾液。濾餅為蛋白質。洗淨趣濾膜，下次備用。得到9kg多濾液。此濾液已不含有分子量大於5萬道爾頓的蛋白質，只有SOD及小分子。3、納濾納濾在納濾機中進行。它的原理也是篩分原理。納濾膜是納米顆粒粘在一起。使用時一定多精心保護。納米膜的孔徑是可選的，也就是對截留分子量在20OM0OO道爾頓範圍內可選。實施例2選取孔徑最大者，即可將分子量小於1000道爾頓的物質全部濾掉。將9kg上述濾液裝入納濾器中，加壓過濾。過濾完成後，收集濾餅，它即是SOD濾餅。濾液不要扔掉，可做其它果汁的原料，它含有大量營養物鞣化酸、花青素、黃酮、各種維生素、各種礦物質，經包裝則為"樹莓果汁精華液"產品。表1"樹莓果汁精華液"營養物質含量tableseeoriginaldocumentpage7為了SOD易被納濾過濾出來，加入適量絮凝劑。4、SOD針劑將濾餅用沌淨水溶解，則得到不同濃度的SOD水溶液，經分裝可製得不同濃度規格的"藥品級SOD針劑"。5、SOD粉劑(片劑)將SOD濾餅放入冷凍室中保存，溫度為-10'C。待樣品貯存一定數量後，將樣品一起放入冷凍乾燥機，找開真空泵開關，在一IO'C下真空乾燥。乾燥完成後，取出SOD產品在氮氣保護下分裝。該產品為"藥品級SOD粉劑"，所有操作在無菌室中進行，一切操作均要附和製藥要求。也可加入片劑附料，打成片劑，製成"藥SSSOD片劑"。實施例3:制^^型凝膠過濾色譜柱層析法提取紅樹莓SOD產品製備型凝膠色譜柱層析法提取紅樹莓SOD產品的工藝流程框圖如中圖3所示。它的原理是所謂"分子篩效益""一個含有各種分子大小不一的樣品溶液緩慢地流經凝膠色譜柱時，各種分子在柱內進行著兩種不同的運動垂直向下移動和無走向的擴散運動。大分子物質由於分子直徑大，不易進行凝膠顆粒孔內，而只能分布顆粒之間而向下移動，因而向下運動速度快。小分子除了可在顆粒間隙中向下運動外，還可以進入凝膠顆粒微孔中，即進入凝膠相中，向下移動。小分子不斷在凝膠顆粒中運動，因而流動速度慢，小分子在柱內向下運動速度大大低於大分子。大分子首先從色譜柱流出，小分子最後流出，中等分子在中間流出"。這就是"分子篩效益"。—、SOD提取的前期準備工作1、SOD提取工作液的準備(1〉工作液的粒度檢査通過顯微鏡檢査，粒度不得有大於0.45mhi顆粒，否則需過濾除掉之。(2>工作液粘度檢査利用旋轉粘度計測量其粘度f工作液的粘度不得大於5cp，否則用純水稀釋使其粘度小於5cp。(3)SOD的凝膠滲透色譜的獮定利用分析方法製得樹莓中SOD純粹品，然後用凝膠、滲透色譜測定SOD峰值。測定每個峰值物質的SOD活性。得知那幾個峰是SOD峰，那些峰是其它蛋白質的峰。並計算每個峰的分子量。由於樹莓的品種繁多，栽培方法各異，使用的微肥各異，所用分泌SOD菌種各異，因而樹莓中SOD種類各異是很正常的。已有文獻報導，某-樹莓果實中有三種SOE>同工酶。(4)SOD及其它蛋白質的熱變穩定性試驗進行不同溫度下熱變試驗，如果說soi>穩定，其它蛋白質可沉澱，則可用熱變方法除掉蛋白質。如果SOD不穩定，則用分級分離除去蛋白質。2、分族凝膠過濾色譜設備的建立現在已有各種凝膠過濾色譜儀供採用，但色譜柱條件及使用工藝要求需用戶自己提供。(1>製備型分族凝膠過濾柱尺寸長徑比(L/D)=5:1~10:1，實施例3採用柱長30cm，直徑5cm，L/D=6:l。Vt=589cm3。(2〉凝膠採用交聯葡聚糖凝膠，有幾個型號可用SephadexG-25、G50。(3>試樣量.-試樣量通常為Vt的2(K30%，實施例3釆用100cm3。3、分級凝膠過濾色譜設備的建立分級凝膠過濾色譜儀己有市售產品可供選購。但製備型分級凝膠過濾色譜條件則需自己提供。(1)製備型分級凝膠過濾柱尺寸長徑比(L/D)應在20:1100:1範圍內，理論塔板數應在30WK60GO範圍內，實施例3採用L=90cm，D=4cm，L/D=22.5。Vt=ll-30cm3。(2)填料採用交聯葡聚糖凝膠SephadexGlOO，分級範圍4000~150000，粒徑l(MO拜，可分級較大蛋白。(3)平衡裝好柱後，用洗脫液洗柱時，紫外檢測器走直線不代表平衡，平衡至少需要5個柱體積。(4〉樣品量樣品量為Vt的2~5%，實施樹3採用Vt的3%，樣品量為33cm3。(5)流速流脫速度通常在5~10em/h，實施例3,採用8cm/h。二、製備型凝膠過濾色譜柱層析法提取樹莓果實中SOD產品的工藝該工藝流程圖列於中圖3。重點工序介紹如下.-1、SO&果汁GFC工作液GFC代表凝膠過濾色譜，SOD果汁GFC工作液代表由實施例1中所得SOD果汁經調製後所得用於凝膠過濾色譜過濾的工作液。其標準是工作液粘度〈5ep，粒度〈0.45pm，SOD的凝膠滲透色譜己知其分布曲線，其關鍵是得知SOD峰洗脫體積(Ve)。通過預備實驗完成上述工作。2、分族GFC過濾器層析分離將SOiy果汁GFC工作液加入分族GFC過濾器中，加入量為100cm3(ml),由於該設備屬於製備型，Vt589cn^，因而試樣量較大。流速可適當加快，視樹莓具體品種的分離效果而異。截取分子量(MG大於10000濾液，實際上等於把濾液分為分子量大於10000和分子量小於10000兩部分。分子量大於10000濾液中含有SOD與蛋白質，分子量小於10000的濾液含有各種礦物質、維生素、鞣化酸、花青素、黃酮等具有防癌、防衰老、防心腦血管疾病等功能，是樹莓果實中的精華成分，由它們制"樹莓果實精華液"。3、樹莓果汁精華液將分子量小於10000的濾液經濃縮分裝，製得樹莓果汁精華液。濃縮採用先氮氣置換，然後減壓濃縮，加入萬分之一的異抗壞血酸鈉，保護鞣化酸、花青素、黃酮等不被氧化。分裝在氮氣保護下進行，最後產品為"樹莓果汁精華液"。4、分級GFC過濾器層析分離將分子量大於10000的濾液，經濃縮後才能進入分級GFC過濾器進行層析分離。濃縮可採用PEG濃縮法，即採用聚乙醇2000濃縮法，濃縮後可以大大縮小試樣的體積。試樣濃度不得大於5%,即SOD與蛋白質濃度之和不得大於5%。樣品量為33cm3(ml)，因為是製備型凝膠過濾色譜設備，所以試樣量較大。流速要慢，採用8cm/h。根據條件試驗測得的SOD的Ve值，截取SOD組份。經濃縮得到SOD濃縮液，它可用於藥品級SOD針劑製造和藥品級SOD粉劑(片劑)製造。濃縮採用PEG濃縮，在氮氣保護下進行。5、藥品級SOD針劑產品製備將SOD濃縮到藥品級SOD針劑所需濃度後，在氮氣保護下，進行針劑配製，針劑分裝。最後製得藥品級SOD針劑產品。上述操作作在無菌室進行，產品符合製藥要求。6、藥品級S0D粉劑(片劑)產品製備將可用於針劑的SOD濃縮劑，繼續濃縮，然後冷凍乾燥。冷凍乾燥在冷凍機中進行，溫度為-l(TC，減壓乾燥。SOD乾粉分裝在氮氣保護下進行，製成"藥品級S0D粉劑"。上述操作在無菌室進行，產品符合製藥要求。也可加入片劑附料，打成片劑，製成"藥品級SOD片劑"。權利要求1、一種從樹莓果實提取過氧化物歧化酶的方法，其特徵在於將過氧化物歧化酶(以下簡稱SOD)從樹莓果實中提取出來涉及四個分離過程(1)SOD與固性物分離通機械磨細方法使SOD從線粒體進入果汁中，然後通過離心分離等分離過程，將含有SOD的果汁與樹莓果實的固性物分離得到SOD果汁。它可以用於進一步提取SOD，也可以製成「食品級樹莓SOD高檔果汁」。(2)SOD與小分子及離子分離通過膜分離法或凝膠過濾色譜法將小分子及離子與SOD分離，得到兩種產物一種產物是含有分子量超過一萬的大分子物質，它們是SOD和蛋白質的水溶液，可用於進一步提取SOD；一種產物是含有小分子及離子的水溶液，它含有極為豐富的防癌、防衰老、防心腦血管疾病的營養物質，經分裝後得到「樹莓果精華液」產品。(3)SOD與蛋白質分離通過膜分離或凝膠過濾色譜分離將蛋白質與SOD分離，得到非常純淨SOD水溶液，其純度達到藥品級要求，沒有細菌，沒有雜質。該SOD水溶液經濃縮達到SOD針劑所需濃度的SOD濃縮液，該濃縮液可以用於制「藥品級SOD針劑」，也可用於制「藥品級SOD粉劑」或「藥品級SOD片劑」。(4)SOD與水分離通過濃縮及冷凍真空乾燥等工藝過程，將SOD濃縮液中的SOD與水分離，得到「藥品級SOD粉劑」或「藥品級SOD片劑」。2、根據權利要求1所述的S0D與固性物的分離，其特徵在於(1)採用了中圖1所示的工藝流程，該工藝流程是本發明首先提出的從樹莓果實中提取SOD果汁的工藝流程。(2)在加工工藝過程中，全程防止SOD被氧化。其特徵是在粉碎、磨細、均化、離心分離、灌裝等分離過程中均採用氮氣保護，防止SOD與氧氣接觸而氧化。在還原劑配料工序加入異抗壞血酸鈉，其用量範圍是O.001—0.1%。3、根據權利要求1所述的將SOD與小分子物質及離子的分離、SOD與蛋白質的分離可用膜分離方法，其特徵在於(1)採用了中圖2所示的工藝流程，實施例2說明了該工藝流程。其特徵該工藝流程是本發明首先提出的，通過膜分離法從樹莓SOD果汁中提取SOD濃縮液的工藝流程。(2)該膜分離法的特徵在於將微濾、超濾與納濾技術聯合使用。微濾膜孔徑為0.1,，除掉ljtni以上的顆粒及病菌。超濾選用截出分子量大於5萬的超濾膜，濾液只含有SOD及小分子、離子。納濾選用截取分子量大於2000的納濾膜，濾液為小分子營養物，可制"樹莓果精華液"。濾餅為S0D。該濾餅SOD可冷凍乾燥製成"藥品級SOD粉劑"或"藥品級SOD片劑"，也可配製成"藥品級SOD針劑"。4、根據權利要求1所述的將SOD與小分子物質及離子的分離，SOD與蛋白質分離可用凝膠過濾色譜分離法，其特徵在於(1〉採用了中圖3所示的工藝流程，實施例3說明了該流程，其特徵在於該工程流程是本發明首先提出的，通過製備型凝膠過濾色譜分離法從樹莓SOD果汁中提取SOD濃縮的工藝流程。(2)該製備型凝膠過濾色譜分離法的特徵在於將樹莓SOD果汁製成SOD果汁GFC工作液。②釆用製備型分族凝膠過濾色譜裝置L/D範圍在5:1-10:1,實例3採用L/D=6:1，Vt=589cra3，凝膠為S印hadexG-25，G50。進料樣品量為100cm3。③截取分子量小於10000濾液制"樹莓果糖華液"。截取分子量大於10000濾液用於分離SOD。採用製備型條^J1濾色麟置L/D範圍在20:11-00:1，實例3採用L/D=22.5，Vt=1130cm3，凝膠為S印hadexG100。進料試樣量為33cm3，流速5-10cm/h，實施例3採用8cm/h。根據樹莓SOD的峰洗提體積Ve截取SOD組份，得到純SOD水溶液。利用該純SOD水溶液可製得"藥品級SOD針劑"，也可乾燥後製得"藥品級S0D粉劑"或"藥品級SOD片劑"。專利摘要
技術領域：
：本發明涉及超氧化物歧化酶的提取技術，特別是樹莓果實中超氧化物歧化酶(以下簡稱SOD)的提取技術。要解決的技術問題(1)提出從樹莓果實中提取SOD的新工藝過程；(2)在提取SOD工藝過程中降低SOD的損失，提高產品SOD的純度；(3)充分利用樹莓果實中所有營養成分，開發多種產品。技術方案要點(1)從樹莓果實中提取SOD分為四個分離過程；(2)採用四種措施降低SOD被氧化而造成的損失；採用適合工業化生產的工藝流程及設備，使本發明適於用生產應用。主要用途本發明產品適用於保健品和藥品，用於防癌、防衰老及防心腦血管疾病。文檔編號C12N9/08GKCN101307308SQ200710055624公開日2008年11月19日申請日期2007年5月14日發明者關士林,劉景芬,家賢茹,方中琴,楊世升,石文淵,胡文學,鄭德隆,陳衛民申請人:關士林;陳衛民;胡文學;鄭德隆;楊世升;石文淵;方中琴;劉景芬;家賢茹導出引文BiBTeX,EndNote,RefMan