一種檢測菸草料液中4-甲基咪唑含量的方法

2023-06-14 14:18:16

專利名稱：一種檢測菸草料液中4-甲基咪唑含量的方法
技術領域：
本發明屬於菸草添加劑理化檢驗技術領域，具體涉及一種檢測菸草料液中4-甲基咪唑含量的方法。
背景技術：
隨著世界範圍內對「吸菸與健康」的廣泛關注和我國正式籤署FCTC協議，目前，努力提高捲菸的吸食安全性已經為國內外菸草行業的共識，為了提高捲菸的吸食安全性，菸草科研人員進行了大量的理化檢驗技術基礎研究。4-甲基咪唑(4-Methylimidazole)溶於水和乙醇,有腐蝕性,具有強烈的驚闕作用，能使動物產生超興奮狀態，長期攝入能導致動物長腫瘤，可能給人體帶來致癌風險。在工業生產中,4-甲基咪唑(簡稱4-MI)是一種重要的有機中間體，主要用於合成大宗胃藥西 咪替丁，也可用作環氧樹脂固化劑和金屬表面防護劑等。在日常生活中，人們可能由於食用普遍使用的焦糖色素飲料或醬油而攝入一定量的4-甲基咪唑。由於焦糖色素能使可樂飲料、調味品和食品變成棕褐色，而被廣泛用於醬油、食醋、黃酒、啤酒以及部分烤制食品和飲料中，目前焦糖色素已經發展成為全球範圍內用量最大的色素。直接用糖加工而成的焦糖色素不含有4-甲基咪唑；而當前國內外大部分廠家生產的焦糖色素普遍採用氨類化合物作為催化劑，由糖、氨水或銨鹽及亞硝-酸鹽在高壓高溫下生成，稱之為氨法焦糖色素，在氨法焦糖色素生產過程中不可避免的會產生一定量的4-甲基咪唑，屬於生產過程中的副產物。出於焦糖色素中4-甲基咪唑對人體潛在危害性的考慮，世界衛生組織及許多國家的研究人員曾經多次進行相關的動物毒理學實驗研究，提出對於非氨法焦糖色素，可根據正常生產需要配比，在使用量上不受限制；對於氨法焦糖色素，每日允許攝入量(ADI)為200毫克/公斤體重,其中氨法焦糖色素中4-甲基咪唑的含量應小於200毫克/公斤焦糖色素。我國的GB8817-2001等國家標準也對焦糖色素的質量標準做出限定，對於非氨法焦糖色素，4-甲基咪唑不得檢出；對於氨法焦糖色素，4-甲基咪唑的含量應低於O. 02%。由於大部分菸草料液或糖料都是棕褐色，同時焦糖色素是一種廣泛使用的著色劑，因此，為保障菸草料液或糖料產品的安全性，對菸草料液或糖料中的4-甲基咪唑進行檢測分析具有重要意義。目前，國內外測定4-甲基咪唑的方法主要有薄層層析法、氣相色譜法、液相色譜法和分光光度法。採用薄層層析法，其操作步驟多，特別是色譜斑點拖尾，定量不準確，檢測限較高；氣相色譜法雖然檢測限較低，但需要樣品量大，且要對樣品進行硅藻土等小柱的純化以及濃縮操作等前處理，操作複雜；目前的液相色譜法主要採用衍生化後液相色譜檢測或在215nm波長進行紫外檢測，前者的缺點與分光光度法相同，後者由於檢測波長短受溶劑和複雜樣品基質影響較大；分光光度法利用4-甲基咪唑與亞硝酸鈉和對氨基磺酸反應生成黃色的有色物質而進行檢測，但由於實際樣品基質幹擾嚴重以及樣品穩定時間只有大約4小時，測定結果標準偏差較大。因而開發一種更為有效的檢測菸草料液或糖料中4-甲基咪唑的方法對提升捲菸產品質量安全具有重要意義。

發明內容
本發明的目的在於針對現有檢測方法存在的樣品前處理繁瑣、靈敏度較低、重現性較差等不足，提供一種檢測菸草料液或糖料中4-甲基咪唑含量的方法，為菸草行業和煙用添加劑生產企業的產品質量安全提供技術保障，該方法具有檢測限低、穩定性好、前處理簡單、快速準確等優點。本發明的目的通過下述技術方案予以實現。除非另有說明，本發明中所採用的百分數均為重量百分數。一種檢測菸草料液中4-甲基咪唑含量的方法，該方法包括以下步驟(I)樣品準備準確稱取O. 6g 3. Og待測樣品，精確至O. lmg，加入2_乙基咪唑 內標溶液，用水或O. I 1%的乙酸或甲酸水溶液稀釋至5 25mL，控制使2-乙基咪唑在稀釋後樣品中的濃度為IOppb，搖勻；(2)SPE柱純化依次用6mL甲醇、12mL水與IOmL O. I 1%的乙酸或甲酸水溶液活化和平衡6mL規格的C18-SPE小柱，活化和平衡SPE柱的柱流速為I 2mL/min ;取2mL步驟(I)所述的稀釋後樣品用活化好的C18-SPE小柱純化，上樣後依次用6mL0. I 1%的乙酸或甲酸水溶液、6mL水淋洗，再用IOmL 10%的乙腈水溶液洗脫4-甲基咪唑，取2mL洗脫液用O. 22 μ m水相濾膜過濾，濾液待LC-MS/MS檢測；(3)製備標準溶液配製4-甲基咪唑濃度分別為lng/mL、2ng/mL、5ng/mL、IOng/mL、20ng/mL、50ng/mL和100ng/mL的標準溶液，每個標準溶液中2-乙基咪唑內標的濃度均為 10ng/mL ；(4)建立標準溶液工作曲線以4-甲基咪唑濃度與2-乙基咪唑內標濃度的比值為橫坐標，以4-甲基咪唑定量離子對的峰面積與2-乙基咪唑內標定量離子對峰面積的比值為縱坐標，建立4-甲基咪唑的標準溶液工作曲線；對標準溶液檢測數據進行線性回歸，求得4-甲基咪唑的回歸方程，R2應不小於O. 999 ；(5)實際樣品檢測測定步驟(2)得到的待測濾液中4-甲基咪唑子離子峰面積與2-乙基咪唑內標子離子峰面積，使用標準溶液工作曲線計算待測濾液中的4-甲基咪唑濃度，進而換算出樣品中的4-甲基咪唑含量；LC-MS/MS的檢測條件為色譜條件WatersAcquity UPLC BEH C18 色譜柱(2. Imm i. d. X 10Omm, I. 7 μ m),流動相為乙腈10mmo 1/L乙酸銨水溶液=12% :88%等度洗脫，色譜柱溫度35°C，進樣量
2μ L,流速 O. 2mL/min,運行時間 IOmin ；質譜條件採用ESI正離子檢測模式，利用針泵直接將含內標濃度標準溶液注入質譜儀，改變質譜參數找出準確的M+1峰及信號較強的碎片離子，以母離子與子離子組成監測離子對，以多反應監測方式對待測組分進行定性定量檢測。進一步的，優化後的質譜分析條件為正離子模式，電噴霧，噴霧電壓2270V，離子源溫度120°C ;霧化氣700L/hr ;氣簾氣50L/hr，碰撞氣O. 18mL/min，掃描時間100ms，錐孔電壓35V，碰撞電壓20V，4-甲基咪唑的檢測離子對(Q1/Q3)為83/56，2-乙基咪唑的檢測離子對(Q1/Q3)為95/81，定性分析採用標準物質保留時間、待測組分特徵離子進行定性分析，定量分析採用多反應監測(MRM)模式分段掃描，以特徵離子對進行定量分析。實驗結果證明在香精試樣中該方法的檢測限為O. 2539ng/g,定量限為O. 8455ng/g°與現有技術相比，本發明具有以下突出優點I.本發明使用LC-MS/MS法在反相條件下進行4_甲基咪唑分析檢測具有檢測限低、穩定性好、前處理簡單、快速準確等優點；2.本發明方法的檢測結果受主觀判斷因素影響小，易於推廣應用。
具體實施例方式以下結合應用實施例對本發明作進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，並不限定本發明的保護範圍。實施例I
①樣品準備準確稱取I. Og香精試樣A，精確至O. lmg，加入2_乙基咪唑內標溶液，用水稀釋至10mL，控制使2-乙基咪唑在稀釋後樣品中的濃度為lOppb，搖勻；②SPE柱純化依次用6mL甲醇、12mL水與IOmLO. 2%的乙酸水溶液活化和平衡6mL (IOOOmg)規格的C18-SPE小柱，活化和平衡SPE柱的柱流速為lmL/min。將2mL①所述稀釋後的菸草料液或糖料用活化好的C18-SPE小柱純化，上樣後依次用6mL O. 2%的乙酸水溶液、6mL水淋洗，再用10mL10%的乙腈水溶液洗脫4-甲基咪唑，取2mL洗脫液用O. 22 μ m有機相濾膜過濾，濾液待LC-MS/MS檢測。③製備標準溶液配製4-甲基咪唑濃度分別為lng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL的標準溶液，每個標準溶液中2-乙基咪唑內標的濃度均為10ng/mL ；④建立標準溶液工作曲線在選定的儀器參數下，以4-甲基咪唑濃度與2-乙基咪唑內標濃度的比值為橫坐標，以4-甲基咪唑定量離子對的峰面積與2-乙基咪唑內標定量離子對峰面積的比值為縱坐標，建立4-甲基咪唑的標準溶液工作曲線。對標準溶液檢測數據進行線性回歸，求得4-甲基咪唑的回歸方程，R應不小於O. 999。⑤實際樣品檢測在選定的儀器參數下測定待測樣品溶液中4-甲基咪唑子離子峰面積與2-乙基咪唑內標子離子峰面積，使用標準溶液工作曲線計算待測樣品中的4-甲基咪唑濃度，進而換算得到香精試樣A中4-甲基咪唑的含量為3. 716ng/g。實施例2①樣品準備準確稱取2. Og香精試樣B，精確至O. lmg，加入2_乙基咪唑內標溶液，用水稀釋至10mL，控制使2-乙基咪唑在稀釋後樣品中的濃度為lOppb，搖勻；②SPE柱純化依次用6mL甲醇、12mL水與IOmLO. 2%的甲酸水溶液活化和平衡6mL (IOOOmg)規格的C18-SPE小柱，活化和平衡SPE柱的柱流速為lmL/min。將2mL①所述稀釋後的菸草料液或糖料用活化好的C18-SPE小柱純化，上樣後依次用6mL 0. 2%的甲酸水溶液、6mL水淋洗，再用10mL10%的乙腈水溶液洗脫4-甲基咪唑，取2mL洗脫液用0. 22 μ m有機相濾膜過濾，濾液待LC-MS/MS檢測。③製備標準溶液配製4-甲基咪唑濃度分別為lng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL的標準溶液，每個標準溶液中2-乙基咪唑內標的濃度均為10ng/mL ；④建立標準溶液工作曲線在選定的儀器參數下，以4-甲基咪唑濃度與2-乙基咪唑內標濃度的比值為橫坐標，以4-甲基咪唑定量離子對的峰面積與2-乙基咪唑內標定量離子對峰面積的比值為縱坐標，建立4-甲基咪唑的標準溶液工作曲線。對標準溶液檢測數據進行線性回歸，求得4-甲基咪唑的回歸方程，R應不小於O. 999。⑤實際樣品檢測在選定的儀器參數下測定香精試樣B溶液中4-甲基咪唑子離子峰面積與2-乙基咪唑內標子離子峰面積，使用標準溶液工作曲線計算待測樣品中的4-甲基咪唑濃度，進而換算得到香精試樣B中的4-甲基咪唑含量為2. 375ng/g。實施例3 ①樣品準備準確稱取2. Og香精試樣C，精確至O. lmg，加入2_乙基咪唑內標溶液，用水稀釋至25mL，控制使2-乙基咪唑在稀釋後樣品中的濃度為8ppb，搖勻；②SPE柱純化依次用6mL甲醇、12mL水與IOmLO. 2%的乙酸水溶液活化和平衡6mL (IOOOmg)規格的C18-SPE小柱，活化和平衡SPE柱的柱流速為2mL/min。將2mL①所述稀釋後的菸草料液或糖料用活化好的C18-SPE小柱純化，上樣後依次用6mL O. 2%的乙酸水溶液、6mL水淋洗，再用10mL10%的乙腈水溶液洗脫4-甲基咪唑，取2mL洗脫液用O. 22 μ m有機相濾膜過濾，濾液待LC-MS/MS檢測。③製備標準溶液配製4-甲基咪唑濃度分別為lng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL的標準溶液，每個標準溶液中2-乙基咪唑內標的濃度均為8ng/mL ；④建立標準溶液工作曲線在選定的儀器參數下，以4-甲基咪唑濃度與2-乙基咪唑內標濃度的比值為橫坐標，以4-甲基咪唑定量離子對的峰面積與2-乙基咪唑內標定量離子對峰面積的比值為縱坐標，建立4-甲基咪唑的標準溶液工作曲線。對標準溶液檢測數據進行線性回歸，求得4-甲基咪唑的回歸方程，R應不小於O. 999。⑤實際樣品檢測在選定的儀器參數下測定待測樣品溶液中4-甲基咪唑子離子峰面積與2-乙基咪唑內標子離子峰面積，使用標準溶液工作曲線計算待測樣品中的4-甲基咪唑濃度，進而換算得到香精試樣C中的4-甲基咪唑含量為O. 2326ng/g，低於該方法的檢測限。因此香精試樣C中不含有4-甲基咪唑。需要指出，以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，並不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。
權利要求
1.一種檢測菸草料液中4-甲基咪唑含量的方法，該方法包括以下步驟 (1)樣品準備準確稱取O.6g 3. Og待測樣品，精確至O. lmg，加入2-乙基咪唑內標溶液，用水或O. I 1%的乙酸或甲酸水溶液稀釋至5 25mL，控制使2-乙基咪唑在稀釋後樣品中的濃度為IOppb，搖勻； (2)SPE柱純化依次用6mL甲醇、12mL水與IOmLO. I 1%的乙酸或甲酸水溶液活化和平衡6mL規格的C18-SPE小柱，活化和平衡SPE柱的柱流速為I 2mL/min ;取2mL步驟(I)所述的稀釋後樣品用活化好的C18-SPE小柱純化，上樣後依次用6mL0. I 1%的乙酸或甲酸水溶液、6mL水淋洗，再用IOmL 10%的乙腈水溶液洗脫4-甲基咪唑，取2mL洗脫液用O.22 μ m水相濾膜過濾，濾液待LC-MS/MS檢測； (3)製備標準溶液配製4-甲基咪唑濃度分別為lng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL和100ng/mL的標準溶液，每個標準溶液中2-乙基咪唑內標的濃度均為10ng/mL ； (4)建立標準溶液工作曲線以4-甲基咪唑濃度與2-乙基咪唑內標濃度的比值為橫坐標，以4-甲基咪唑定量離子對的峰面積與2-乙基咪唑內標定量離子對峰面積的比值為縱坐標，建立4-甲基咪唑的標準溶液工作曲線；對標準溶液檢測數據進行線性回歸，求得4-甲基咪唑的回歸方程，R2應不小於O. 999 ； (5)實際樣品檢測測定步驟(2)得到的待測濾液中4-甲基咪唑子離子峰面積與2-乙基咪唑內標子離子峰面積，使用標準溶液工作曲線計算待測濾液中的4-甲基咪唑濃度，進而換算出樣品中的4-甲基咪唑含量；LC-MS/MS的檢測條件為色譜條件Waters Acquity UPLC BEH C18 色譜柱(2. Imm i. d. X 10Omm, I. 7 μ m),流動相為乙腈IOmmoI/L乙酸銨水溶液=12% 88%等度洗脫，色譜柱溫度35°C，進樣量2 μ L，流速 O. 2mL/min,運行時間 IOmin ； 質譜條件採用ESI正離子檢測模式，利用針泵直接將含內標濃度標準溶液注入質譜儀，改變質譜參數找出準確的M+1峰及信號較強的碎片離子，以母離子與子離子組成監測離子對，以多反應監測方式對待測組分進行定性定量檢測。
2.根據權利要求I所述的檢測菸草料液中4-甲基咪唑含量的方法，其特徵在於優化後的質譜分析條件為正離子模式，電噴霧，噴霧電壓2270V，離子源溫度120°C ;霧化氣700L/hr ;氣簾氣50L/hr，碰撞氣O. 18mL/min，掃描時間100ms，錐孔電壓35V，碰撞電壓20V，4-甲基咪唑的檢測離子對(Q1/Q3)為83/56,2-乙基咪唑的檢測離子對(Q1/Q3)為95/81，定性分析採用標準物質保留時間、待測組分特徵離子進行定性分析，定量分析採用多反應監測(MRM)模式分段掃描，以特徵離子對進行定量分析。
全文摘要
本發明公開了一種檢測菸草料液中4-甲基咪唑含量的方法。該方法包括將菸草料液或糖料準確稱量、添加2-乙基咪唑內標並溶解後，經過C18-SPE小柱純化，用LC-MS/MS法在反相條件下進行分析檢測。檢測樣品中4-甲基咪唑採用內標校準曲線法進行定量測定，計算出菸草料液或糖料中4-甲基咪唑的含量。本發明提供了一種檢測限低、穩定性好、前處理簡單、快速準確的菸草料液或糖料中4-甲基咪唑的分析檢測方法，適用於菸草行業和菸草添加劑生產企業對菸草料液或糖料中4-甲基咪唑的分析檢測，填補了這一技術領域的空白。
文檔編號G01N30/06GK102879487SQ20121033724
公開日2013年1月16日 申請日期2012年9月13日 優先權日2012年9月13日
發明者蔣舉興, 王文元, 劉亞, 夏建軍, 段焰青, 黨立志 申請人:紅雲紅河菸草(集團)有限責任公司