一種醫用無菌無熱源魚皮膠原蛋白海綿的製備方法

2023-06-18 04:25:01

一種醫用無菌無熱源魚皮膠原蛋白海綿的製備方法
【專利摘要】本發明屬於生物醫用材料製備領域，特別涉及一種魚皮膠原蛋白海綿的製備方法，經過前處理、酸溶、鹽析、透析純化、超濾膜濃縮、除菌、除熱源和凍幹得到醫用無菌無熱源魚皮膠原蛋白海綿。本發明使用了成本低廉、且更加安全的魚皮作為膠原蛋白海綿的來源，不需要經過交聯的步驟就能得到高純度、低灰分的醫用膠原蛋白海綿。
【專利說明】一種醫用無菌無熱源魚皮膠原蛋白海綿的製備方法

【技術領域】
[0001] 本發明屬於生物醫用材料製備領域，特別涉及一種魚皮膠原蛋白海綿的製備方 法。

【背景技術】
[0002] 膠原蛋白廣泛存在於從低等脊椎動物的體表面到哺乳動物機體的一切組織之中。 魚類的膠原主要存在於鱗和皮之中。膠原是一類特殊的蛋白質，是三螺旋結構，不同的三股 肽鏈可以組成27種不同的膠原類型。不同的膠原類型具有不同的功能特性。
[0003] 膠原蛋白具有低抗原性、可生物降解性、生物相容性、促進血小板凝聚等生物學特 性，是非常重要的天然生物材料，主要醫學應用包括注射型膠原蛋白、膠原蛋白膜、膠原纖 維、膠原蛋白管及各類膠原蛋白複合材料。其中膠原蛋白海綿被應用於外科止血，口腔再吸 收性敷料，組織填充，細胞培養材料，組織工程支架等方面。
[0004] 目前市場上的膠原蛋白海綿多來源於陸生動物的皮、骨等。由於日益嚴重的安全 問題，如狂牛症、口蹄疫等，威脅著陸生來源產品的安全性。魚皮中含有大量的膠原蛋白，是 製備膠原蛋白海綿的優質原料，且具有更高的安全性和更低廉的成本。


【發明內容】

[0005] 本發明要解決的技術問題是：提供一種以魚皮為原料，製備無菌無熱源膠原蛋白 海綿的方法。
[0006] 本發明提供了一種醫用無菌無熱源魚皮膠原蛋白海綿的製備方法，步驟如下：
[0007] (1)去除魚皮上的魚肉及脂肪，用10-50倍魚皮重量的清水清洗2次，將洗淨的魚 皮剪碎成〇. 5?5cm2的小塊；
[0008] (2)用10-50倍魚皮重量的1%?10%NaCl溶液攪拌下漂洗魚皮32h?48h，每8h? 12h更換一次NaCl溶液；
[0009] (3)用10-50倍魚皮重量的去離子水漂洗4次，每次0. 5?Ih ;
[0010] (4)用10-50倍魚皮重量的0. lmol/L NaOH溶液攪拌下漂洗32h?48h，每8h? 12h換一次NaOH溶液；
[0011] (5)用10-50倍魚皮重量的去離子水漂洗4次，每次0· 5?lh，至pH6?7 ;
[0012] (6)將經前述步驟（1)- (5)處理後得到的魚皮置於0· 3?I. Omol/L的稀酸緩衝 液中溶脹，攪拌4h?12h後離心，取上清液，得到魚皮粗膠原提取液；
[0013] (7)魚皮粗膠原提取液經5 μ m濾膜過濾，加入飽和NaCl或（NH4)2SO4溶液鹽析，蛋 白析出；靜置數小時後(TC?KTC離心，轉速8000-10000rpm，得到膠原沉澱；
[0014] (8)將膠原沉澱重新溶解於3-5倍魚皮重量的純水中，以5-20倍魚皮重量的純水 為透析外液，半透膜截流分子量lOOKDa，對膠原蛋白進行透析純化；
[0015] (9)取純化膠原液用30KD?50KD分子量的超濾膜濃縮，至膠液中蛋白濃度達到 1% ?4% ;
[0016] (10)濃縮後的膠液用0. 22μπι?0.45μπι板式膜進行除菌，然後加入0. 1%?5% (w/v)藥用活性炭攪拌後過濾，以去除熱源；
[0017] (11)膠液置於_60°C低溫冷凍乾燥機凍幹，得到膠原蛋白海綿。
[0018] 所述的稀酸可以是鹽酸、醋酸或檸檬酸。
[0019] 所述的膠原蛋白海綿製備工藝中，步驟（1)- (10)均在0°C?KTC條件下進行。
[0020] 本發明的有益效果：使用了成本低廉、且更加安全的魚皮作為膠原蛋白海綿的來 源，經過前處理、酸溶、鹽析、透析純化、超濾膜濃縮、除菌、除熱源和凍幹，不需要經過交聯 的步驟就能得到高質量的醫用膠原蛋白海綿。

【具體實施方式】
[0021] 實施例1
[0022] 稱取200g新鮮羅非魚皮，剪成0. 5cmX0. 5cm小片狀，4°C條件下，5%NaCl溶液攪拌 漂洗（l:30w/w)48h，每12h換一次NaCl溶液，過濾去除濾液；去離子水（l:30w/ w)漂洗原 料4次，每次Ih ;4°C條件下，濾幹的魚皮中加入0. IM NaOH溶液攪拌漂洗（l:30w/w)48h，每 12h換一次NaOH溶液，過濾去除濾液；再以去離子水（1:30w/w)漂洗原料4次，每次lh，至 漂洗液pH為6?7 ;
[0023] 4°C下，將經前處理的原料置於0. 5mol/L醋酸溶液（l:30w/W)中溶脹，攪拌4h，在 (TC?KTC下、轉速8000?IOOOOrpm離心，取上清液，得到魚皮粗膠原提取液；
[0024] 4°C條件下，料液經5 μ m膜過濾，再加入飽和NaCl溶液鹽析，直至NaCl終濃度4%， 蛋白析出；靜置數小時後，在〇°C?KTC下、轉速8000?IOOOOrpm離心，獲得膠原沉澱；
[0025] 將膠原沉澱重新溶解於純水中，以純水（1:20w/w)為透析外液，半透膜截流分子量 lOOKDa，4°C透析72小時，每12小時更換一次透析外液；
[0026] 取純化膠原液在4°C條件下用50KDa的膜濃縮，至膠液中蛋白濃度達到2% ;
[0027] 濃縮好的膠液經0. 22 μ m板式膜過濾進行除菌；
[0028] 加入1% (w/v)椰殼活性炭攪拌後過濾，去除熱源；
[0029] _60°C低溫冷凍乾燥機冷凍乾燥72小時，得到醫用膠原海綿。
[0030] 實施例2
[0031] 稱取200g新鮮草魚皮，剪成IcmX Icm小片狀，4°C條件下，5%NaCl溶液攪拌漂洗 (l:30w/w)48h，每12h換一次NaCl溶液，過濾去除濾液；去離子水（l:30w/ w)漂洗原料4 次，每次Ih ;
[0032] 4°C條件下，濾幹的魚皮中加入0. IM NaOH溶液攪拌漂洗（l:30w/w)48h，每12h換 一次NaOH溶液，過濾去除濾液；再以去離子水（1:30w/w)漂洗原料4次，每次lh，至漂洗液 pH為6?7 ;
[0033] 4°C下，將經前處理的原料置於0. lmol/L鹽酸溶液（l:30w/w)中溶脹，攪拌4h，在 (TC?KTC下、轉速8000?IOOOOrpm離心，取上清液，得到魚皮粗膠原提取液；
[0034] 4°C條件下，料液經5 μ m膜過濾，再加入飽和NaCl溶液鹽析，直至NaCl終濃度4%， 蛋白析出；靜置數小時後，在〇°C?KTC下、轉速8000?IOOOOrpm離心，獲得膠原沉澱；
[0035] 將膠原沉澱重新溶解於純水中，以純水（1:20w/w)為透析外液，半透膜截流分子量 lOOKDa，4°C透析72小時，每12小時更換一次透析外液；
[0036] 取純化膠原液在4°C條件下用30KDa的膜濃縮，至膠液中蛋白濃度達到3% ;
[0037] 濃縮好的膠液經0. 22 μ m板式膜過濾進行除菌；
[0038] 加入1% (w/v)椰殼活性炭攪拌後過濾，去除熱源；
[0039] _60°C低溫冷凍乾燥機冷凍乾燥72小時，得到醫用膠原海綿。
[0040] 實施例3
[0041] 表1 :本發明的膠原蛋白海綿與現有產品質量比較
[0042]

【權利要求】
1. 一種醫用無菌無熱源魚皮膠原蛋白海綿的製備方法，其特徵在於步驟如下： (1) 去除魚皮上的魚肉及脂肪，用10-50倍魚皮重量的清水清洗2次，將洗淨的魚皮剪 碎成0. 5?5cm2的小塊； (2) 用10-50倍魚皮重量的1%?10%NaCl溶液攪拌下漂洗魚皮32h?48h，每8h? 12h更換一次NaCl溶液； (3) 用10-50倍魚皮重量的去離子水漂洗4次，每次0. 5?lh ; (4) 用10-50倍魚皮重量的0. lmol/L NaOH溶液攪拌下漂洗32h?48h，每8h?12h 換一次NaOH溶液； (5) 用10-50倍魚皮重量的去離子水漂洗4次，每次0. 5?lh，至pH6?7 ; (6) 將經前述步驟（1)?（5)處理後得到的魚皮置於0. 3?1. Omol/L的稀酸緩衝液中 溶脹，攪拌4h?12h後離心，取上清液，得到魚皮粗膠原提取液； (7 )魚皮粗膠原提取液經5 y m濾膜過濾，加入飽和NaCl或（NH4) 2S04溶液鹽析，蛋白析 出；靜置數小時後離心，得到膠原沉澱； (8) 將膠原沉澱重新溶解於3-5倍魚皮重量的純水中，以5-20倍魚皮重量的純水為透 析外液，半透膜截流分子量l〇〇KDa，對膠原蛋白進行透析純化； (9) 取純化膠原液用30KD?50KD分子量的超濾膜濃縮，至膠液中蛋白濃度達到1%? 4% ； (10) 濃縮後的膠液用0. 22 y m?0. 45 y m板式膜進行除菌，然後加入0. 1%?5% (w/ v)藥用活性炭攪拌後過濾，以去除熱源； (11) 膠液置於_60°C低溫冷凍乾燥機凍幹，得到膠原蛋白海綿。
2. 如權利要求1所述的魚皮膠原蛋白海綿的製備方法，其特徵在於所述稀酸為鹽酸、 醋酸或檸檬酸。
3. 如權利要求1所述的魚皮膠原蛋白海綿的製備方法，其特徵在於所述步驟（1)? (10)均在0°C?10°C條件下進行。
【文檔編號】A61L27/24GK104338175SQ201310333125
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2013年8月1日 優先權日:2013年8月1日
【發明者】顧其勝, 辛春華, 王南平, 王知華, 金強 申請人:上海華睿生物科技有限公司