栽培黑麥籽粒Waxy蛋白亞基及其提取、鑑定方法和編碼基因與應用的製作方法

2023-06-18 07:49:21 3

栽培黑麥籽粒Waxy蛋白亞基及其提取、鑑定方法和編碼基因與應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了栽培黑麥籽粒Waxy蛋白亞基以及該蛋白亞基的DuoFlow提取方案、CE快速鑑定體系及與該蛋白亞基對應的編碼序列，所公開的黑麥籽粒Waxy蛋白亞基具有序列表1所示的胺基酸排列順序。本發明公開的DuoFlow提取方案可用於從黑麥籽粒中直接、大批量提取Waxy蛋白，其產物可用於該酶生理生化特性等後續研究；所公開的CE快速鑑定體系可用於對黑麥群體的籽粒Waxy蛋白亞基進行大規模掃描，其測定結果可用於黑麥Waxy種質資源的分析、保存與利用；本發明所公開的黑麥籽粒Waxy蛋白亞基及其編碼基因序列可用於栽培黑麥的分子設計育種。
【專利說明】栽培黑麥籽粒Waxy蛋白亞基及其提取、鑑定方法和編碼基因與應用
【技術領域】
[0001]本發明公開了栽培黑麥籽粒Waxy蛋白亞基的DuoFlow提取方案、CE快速鑑定體系及該亞基對應的編碼序列，屬於基因工程領域。
【背景技術】 [0002]栽培黑麥(Secale cereale L.2n=2x=14, RR)屬禾本科黑麥屬,是除小麥之外唯一一種被廣泛用於麵包製作的禾穀類作物，也作為歐洲重要的飼料加工原料及生物能源而被廣泛種植。此種栽培黑麥具有突出的穗部性狀、優良的的抗逆性和廣泛的病蟲害抗性，該品種與普通小麥親緣關係較近而具有可雜交性，因此，該種質被廣泛應用於小麥重要農藝性狀的遺傳改良及基礎理論研究。
[0003]在已有的栽培黑麥品種中，奧地利黑麥是代表品種，該品種攜帶有抗條銹病和抗白粉病基因，該品種在黑麥系統演化、品種培育等方面具有潛在價值。Waxy蛋白(即顆粒結合型澱粉合成酶，granule-bound starch synthase 1,6BSSI),是控制著禾穀類籽粒直鏈澱粉合成的關鍵酶，通過改變直鏈澱粉的含量，最終影響麵條加工品質。

【發明內容】

[0004]為了更好的控制和調節禾穀類籽粒直鏈澱粉合成以及其中直鏈澱粉的含量， 申請人:利用Waxy特異引物組合從奧地利黑麥的cDNA文庫中擴增獲得了全長Waxy序列，並提取分離純化了 Waxy蛋白亞基，在研究過程中建立了成熟可靠的分離方法和鑑定方法。
[0005]本發明首先提供了一種栽培黑麥的黑麥籽粒Waxy蛋白亞基，具有序列表1所示的胺基酸排列順序。
[0006]本領域技術人員可以理解，上述蛋白亞基還可以包括將序列表1的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加從而衍生的蛋白質。
[0007]上述Waxy蛋白亞基可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。
[0008]編碼上述黑麥籽粒Waxy蛋白亞基的核酸分子同樣屬於本發明的保護範圍，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA ;也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA 等。
[0009]當所述核酸分子是DNA時，其具有序列表2所示的核苷酸序列；或與序列表2所示的核苷酸序列具有90%以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。
[0010]上述所稱的同源性，通常應在95 %以上，優選的為97 %以上，更優選為99 %以上。
[0011]在上述基礎上，本發明還公開了用於上述編碼基因擴增的表達引物，其序列為WxexpF:5，-ATGAACCTCGTGTTCGTCGGC-3，，WxexpR:5，-TCAGGGAGCGGCGACG-3，。
[0012]相應的，本發明還公開了所述編碼基因的表達方法，首先採用PCR方法擴增栽培黑麥Waxy基因完整編碼序列，將所得擴增產物回收目的片段，與載體連接並轉化大腸桿菌，在LB平板上37°C過夜培養，利用測序引物進行陽性篩選並測序；利用表達引物對擴增陽性質粒，將回收片段克隆至表達載體並轉化，將所得陽性菌株誘導後離心收集菌體即得。
[0013]在上述方法中，根據GenBank得到栽培黑麥Waxy (FJ491376)基因完整編碼序列，並設計相應的覆蓋全長Waxy的克隆引物:WxR)(5』 -ATGGCGGCTCTGGTCACGT-3』 )和WxR2800(5，-TCAGGGAGCGGCGACGTT-3，)。
[0014]在上述方法中，具體的擴增體系可採用模板DNA100ng、0.1 μ mol.L-1的Wxi7O/WxR2800 各 I μ L、LA Taq DNA 聚合酶 0.25 μ L、0.05mmol.L-1dNTP mixl2.5 μ L，加 ddH20至反應體積25 μ L。
[0015]在上述方法中，PCR反應條件為:95°C 5min ；94°C 40s, 58°C 50s, 72°C 90s，35 個循環；72°C 8min，4°C保存。
[0016]將上述擴增產物經I %瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收目的片段，純度檢測後與pEASY-Tl載體連接；轉化大腸桿菌DH5 α，在塗有氨苄青黴素、X-Gal, IPTG的LB平板上37°C過夜培養，利用測序引物M13F/R進行陽性篩選並測序。
[0017]參照上述PCR 反應條件，利用表達引物(WxexpF:5』-ATGAACCTCGTGTTCGTCGGC-3』，WxexpR:5』 -TCAGGGAGCGGCGACG-3』)擴增陽性質粒，將回收片段克隆至表達載體pEASY_Fl，轉化到BL21 (DE3)pLysS,陽性菌株經IPTG誘導然後離心收集菌體。
[0018]相應的，本發明還公開了所述黑麥籽粒Waxy蛋白亞基的提取分離方法，首先是進行黑麥籽粒Waxy蛋白亞基的提取:採用多籽粒提取，去除懸濁液中的麵筋和種皮，然後將粗澱粉加入上樣緩衝液後高溫水浴和沸煮，離心取上清液；然後是進行粗提物的分離:將從籽粒中提取的Waxy蛋白粗提液加載到DuoF1w蛋白純化系統,收集目標洗脫組分供質譜測序及SDS-PAGE檢測。
[0019]由於Waxy蛋白在黑麥籽粒中的含量較低，常溫下與澱粉顆粒緊密結合，為了促進該蛋白的解離， 申請人:廣泛研究了各種方法，發現通過增加高溫水浴這一提取步驟可有效減少澱粉顆粒束縛態Waxy蛋白。
[0020]優選的，高溫水浴條件為80°C、30min水浴。
[0021]上述的DuoF1w蛋白純化系統是將Waxy蛋白粗提液採用DuoFlow UNO Ql陽離子交換柱，其中掛柱緩衝液為低濃度Tris-Hcl (20mM Tris-Hcl,pH9.5)，蛋白洗脫液為高濃度NaCl:20mM Tris+1M NaCl，ρΗ9.5。
[0022]分離完成後，對分離產物的檢測可在280、260、214或200nm波段進行檢測，檢測結果呈現單一峰型，優選採用214nm識別效果最佳。 申請人:進行的實驗證實,上述DuoFlow體系能正確分離籽粒中Waxy蛋白。
[0023]進一步的，本發明還公開了所述黑麥籽粒Waxy蛋白亞基的鑑定方法，包括但不限於SDS-PAGE檢測、MALD1-T0F質譜鑑定、CE (毛細管)鑑定，當採用CE鑑定方法時，優選採用下述檢測條件:以DuoFlow純化產物為標準樣，以0.05mM硼砂+15%乙腈+1 % SDS溶液(pH9.5)為緩衝液，採用分離電壓20kV，溫度25°C，檢測波長214nm，壓力進樣，0.5psiX5s。
[0024]實驗結果顯示,上述條件下能夠在ll_12min處獲得峰值約12mAU單一主峰，圖形清晰，基線水平，是一種良好的CE鑑定體系，可將籽粒Waxy蛋白提取物直接用於對該亞基的檢測。 [0025]最後，本發明還公開了所述蛋白在調節禾穀類籽粒直鏈澱粉合成酶與調節禾穀類籽粒直鏈澱粉含量的應用，由於Waxy蛋白是禾穀類作物籽粒直鏈澱粉合成的關鍵酶，對其分離有助於深入了解該酶的生理生化特性，從而用於後續的研究工作，構建該蛋白的高效鑑定體系可促進黑麥種質資源Waxy蛋白分類、鑑定與利用工作。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1為DuoFlow操作流程不意圖，其中各步驟為1:平衡；2:進樣；3:洗脫未吸附組分；4:梯度洗脫目標蛋白；5:高鹽再生；6:再平衡備用。
[0027]圖2為Waxy基因的PCR擴增電泳檢測結果圖，其中M:1Kb DNA marker ；1:奧地利黑麥；箭頭為目標片段。
[0028]圖3為黑麥Waxy蛋白DuoFlow純化體系的構建與分離效果圖，其中A:奧地利黑麥；B:黑麥品種RyeOl ；C:黑麥品種Rye02 ；D:黑麥品種Rye03 ；E:黑麥品種Rye04。
[0029]圖4為Waxy蛋白的SDS-PAGE檢測結果圖，其中M:蛋白質分子量標準；樣品1:未經DuoFlow純化的奧地利黑麥籽粒Waxy蛋白；樣品2:經DuoFlow純化的奧地利黑麥籽粒Waxy蛋白；樣品3:未經誘導的Waxy原核表達；樣品4:經IPTG誘導的Waxy原核表達；樣品5:經N1-柱純化的重組Waxy ;箭頭:目標蛋白。
[0030]圖5為黑麥Waxy亞基毛細管鑑定體系的構建及有效性檢測結果，其中A:經DuoFlow純化的奧地利黑麥籽粒Waxy蛋白；B:未經純化的Waxy蛋白(奧地利黑麥籽粒)；C-F:未經純化的Waxy蛋白(依次為品種RyeOl，Rye02，Rye03, Rye04) ；G:經Ni2+_親和層析純化的奧地利黑麥Waxy原核表達產物。
[0031] 圖6為利用優化後的CE體系對DuoFlow純化及籽粒粗提物中Waxy亞基的檢測結果圖。
【具體實施方式】
[0032]實施例1:Waxy基因克隆、測序及原核表達
[0033]實驗材料:供試材料奧地利黑麥(Secale cereale L.cv.Austria)及其他四份栽培黑麥品種Rye01、Rye02、Rye03、Rye04，由國家小麥改良中心品質育種實驗室保存並繁育。
[0034]實驗過程:根據GenBank中栽培黑麥Waxy (FJ491376)及小麥Waxy基因完整編碼序列(EU719608)，設計覆蓋全長 Waxy 的克隆引物，'--70(5』-4了66066(:1'(^6611^061'-3』)和ffxR2800(5> -TCAGGGAGCGGCGACGTT-3』)，上述引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
[0035]根據Easypure? Plant RNA Kit說明書提取灌眾期間奧地利黑麥籽粒的總RNA,按EasyScript?First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒(全式金生物技術有限公司，北京)合成cDNA。
[0036]PCR 擴增體系為:模板 DNAlOOng,0.1 μ mol.L-1 的 WxF0/ffxR2800 各 I μ L、LA7aqDNA 聚合酶 0.25 μ L、0.05mmol.L-1ClNTP mixl2.5 μ L，加 ddH20 至反應體積 25 μ L。
[0037]PCR 反應條件為:95°C 5min ；94°C 40s, 58°C 50s, 72°C 90s, 35 個循環；72°C 8min,
4°C保存。
[0038]擴增產物經1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收目的片段，純度檢測後與pEASY-Tl載體25°C連接20min ;轉化大腸桿菌DH5 α，在塗有氨苄青黴素、X-Gal, IPTG的LB平板上37°C過夜培養，利用測序引物M13F/R進行陽性篩選，通過北京華大基因有限公司(BGI，北京)測序。[0039]參照上述PCR 反應條件，利用表達引物(WxexpF:5』-ATGAACCTCGTGTTCGTCGGC-3』，WxexpR:5』 -TCAGGGAGCGGCGACG-3』 )擴增陽性質粒，將回收片段克隆至表達載體pEASY-El (全式金生物技術有限公司，北京)，轉化BL21 (DE3)pLysS,陽性菌株經IPTG (終濃度Immol.L-1)誘導6h，8000g離心收集菌體備用。
[0040]實施例2:原核表達Waxy蛋白的提取
[0041]參考ProteinIsoTm N1-NTA Resin (全式金生物技術有限公司，北京)親和層析介質說明書，純化帶有His-標籤的重組Waxy蛋白，回收產物將用於SDS-PAGE及CE分析。
[0042]實施例3:籽粒Waxy蛋白提取
[0043]參照已有的單粒種子提取法(Zhao X C, Sharp P J.An improvedlD SDS-PAGEmethod for the identification of three bread wheat 『waxy』 proteins.Journal ofCereal Science，1996，23:191-193)進行Waxy蛋白提取，並作如下改進:採用多籽粒提取；在第一步粗澱粉漂洗前，儘量去除懸濁液中的麵筋和種皮；粗澱粉加入上樣緩衝液後經80°C水浴30min，沸水煮15min，經短暫離心，取上清液備用。
[0044]實施例4:DuoF1w蛋白純化體系構建
[0045]首先對BioLogic DuoFlow FlO工作平臺(B10-RAD，USA)進行管道清洗，排盡泵及管道內的氣泡；然後裝Iml柱體積的UNO Ql柱(7mm IDX 35mm L);再次平衡UNO Ql柱。待儀器準備就緒之後進入Browser界面設置:選擇QuadTec Detector並設定檢測波長、電導和AVR7-3進樣閥，整個流程如圖1所示。
[0046]預實驗體系為:柱子平衡後進樣100 μ I ;經Buffer A以流速1.0ml/min(10-50mM Tris, ρΗ8.5-9.5)進行低鹽掛柱；再經 Buffer B 以 1.0ml/min 的流速(10_50mMTris+0.5-3M NaCl，ρΗ8.8-9.5)進行梯度洗脫，梯度從O至100%，洗脫5-10倍柱體積；檢測波段分別設置為QuadTec280、260、214和200nm。
[0047]根據預實驗結果，篩選出分離效果良好的體系，將從籽粒中提取的Waxy蛋白粗提液加載到DuoFlow蛋白純化系統，收集目標洗脫組分供質譜測序及SDS-PAGE檢測。同時，利用所構建的DuoFlow體系對Rye01_Rye04等四份黑麥品種的籽粒Waxy蛋白提取物進行測試，以確定該體系對黑麥Waxy蛋白的分離效果。
[0048]實施例5:分離蛋白的SDS-PAGE檢測
[0049]採用濃度為12%的SDS-PAGE，取20 μ L籽粒蛋白粗提液、DuoFlow峰值收集液及原核表達產物(並以未誘導菌株為對照)上樣，BIO-RAD MINI4型電泳槽80V恆壓4小時，考馬斯亮藍G-250在室溫下固定染色半小時，用脫色液(30%甲醇+30%乙酸+40%蒸餾水)脫色至條帶清晰，用UMAX Powerlook2100XL-USB型掃描儀掃描電泳結果。
[0050]實施例6:ffaxy蛋白MALD1-T0F質譜鑑定
[0051]用消毒的手術刀切下大小約為60KD的SDS-PAGE條帶，樣品在中國科學院上海生命科學研究院蛋白質組研究分析中心進行MALD1-T0F質譜鑑定，樣品序列分析採用一級肽指紋質量與二級肽碎片質量綜合分析法Combined (MS+MS/MS)，用MASCOT對UniProt庫及本地Waxy蛋白質庫進行搜索；一、二級質譜綜合得分及可信度參數分別設定為ProteinScore≥60、Protein Score Cl %≥95 針對多個比對得分都超過閾值的檢索結果(≥60, ≥95% )，則通過序列同源性比對以確定蛋白質的性質。
[0052]實施例7 =Waxy蛋白的CE鑑定體系的構建[0053]7.1、CE運行前處理:CE體系在BECKMAN P/ACE?MDQ型毛細管電泳儀(BeckmanCoulter, USA)上進行，所用緩衝液均由超純水配製，經聚乙烯濾膜(0.22 μ m)過濾及超聲脫氣處理40min ；電泳前，樣品經13，000r/min離心2min，保留上清；毛細管依次用0.1MNaOH溶液衝洗8min、ddH20衝洗5min、運行緩衝液衝洗8min，分離電壓為20kV，恆溫25°C ；每次電泳結束後用0.1M的NaOH溶液衝洗5min、ddH20衝洗2min,恢復管壁的OH'
[0054]7.2、CE檢測體系的優化:設置不同緩衝液成分濃度梯度，採用壓力進樣
0.5psi X 5s，運行電壓20-25kV，溫度25°C，檢測波長200和214nm，運行緩衝液分離15min。測試緩衝液體系為:硼砂(0.05 和 0.055mol/L)+ 乙腈(0,6 %,8%UO %,12%15% v/v) +SDS(0,0.4%,0.6%,0.8%和 1% m/v)，pH 值 9.0、9.2、9.5 和 9.8。
[0055]篩選出鑑定效果良好的緩衝體系，分別對從籽粒中直接提取的Waxy蛋白液及DuoFlow收集組分進行檢測。同時，以四份黑麥籽粒的Waxy蛋白提取物為材料，對上述CE緩衝體系進行測試，以確定該體系對黑麥Waxy蛋白亞基鑑定的特異性。
[0056]實驗結果分析如下
[0057]1、目的基因克隆及序列分析
[0058]用引物組合WXR)/WXR2800從奧地利黑麥灌漿期籽粒總cDNA中擴增到一條長約1800bp的條帶(圖2)。對目的片段進行回收純化，連接到pEASY-Tl克隆載體，轉化大腸桿菌DH5a，隨機篩選出3個陽性克隆進行測序。
[0059]BLASTn顯示，上述三個陽性克隆為同一序列，其長度為1815bp，與普通小麥及黑麥Waxy基因的相似性均超過了 95%，基因序列與編碼蛋白如序列表1、2所示。
`[0060]2、DuoFlow蛋白純化體系及對黑麥Waxy蛋白的分離效果
[0061]籽粒蛋白粗提物經DuoFlow UNO Ql陽離子交換柱檢測，確立了最佳分離體系。其中，掛柱緩衝液為低濃度Tris-Hcl (20mM Tris-Hcl，pH9.5)，蛋白洗脫液為高濃度NaCl (20mM Tris+1M NaCl, pH9.5);在 280、260、214 和 200nm 四個波段進行檢測，均呈現單一峰型，以214nm識別效果最佳，表明籽粒粗提物經過DuoFlow分離純化後獲得了高純度的單一條帶(圖3A)。利用該分離體系對奧地利籽粒粗提物進行DuoFlow純化，回收產物分別用於 SDS-PAGE (圖 4)及 MALD1-T0F MS 測序。
[0062]同時，利用構建的DuoFlow體系對四份黑麥品種籽粒Waxy蛋白提取物進行純化。如圖3B-3E所示，在柱平衡體積、掛柱及洗脫流速一定時，上述四份黑麥品種的籽粒Waxy蛋白在DuoFlow出峰時間、分離純度及峰形等參數上保持穩定，且具有極低的噪音，並與奧地利黑麥Waxy蛋白的分離峰形圖類似(圖3A)，因此該體系實現了對黑麥籽粒來源Waxy蛋白的特異性純化。
[0063]3、Waxy 蛋白的 SDS-PAGE 檢測
[0064]奧地利黑麥品種的籽粒蛋白提取產物、DuoFlow峰值回收產物，經SDS-PAGE電泳，均顯示出一條近60KD的清晰條帶(圖4-A)。由於重組蛋白的標籤較小(2.3kD)，經誘導的Waxy基因在原核表達體系中也產生一條與種子Waxy亞基近似的帶(圖4_B)，經N1-柱親和層析後獲得高純度的重組蛋白(圖4-B)，條帶大小與文獻闡述的Waxy蛋白分子量相符，並與黑麥品種Rogo及奧地利黑麥編碼基因(登錄號分別為FJ491376、KF559182)所推導的蛋白質理論值一致。圖4同時表明，奧地利黑麥籽粒Waxy蛋白粗提物經過DuoFlow分離純化後獲得了高純度的單一條帶。[0065]4、MALD1-T0F 質譜鑑定
[0066]由於籽粒粗提物與DuoFlow純化產物的SDS-PAGE具有一致大小，因此直接對後者的膠回收條帶進行質譜鑑定(圖4-A);同時，對原核表達條帶進行挖膠測序(圖4-B)。奧地利黑麥籽粒Waxy蛋白鑑定結果與資料庫中已知黑麥Rogo品種來源的Waxy蛋白、奧地利黑麥Waxy基因所推斷的胺基酸序列以及該基因原核表達產物的質譜鑑定片段等的具有一致的序列特徵；而與普通小麥Cheyenne來源的Waxy序列之間的相似性也高於95% (表I)。此結果表明，籽粒蛋白的DuoFlow峰值回收產物具有與原核表達產物和由基因序列推導的Waxy亞基一致的序列特徵,屬於Waxy蛋白。
[0067]表1奧地利黑麥籽粒Waxy蛋白的質譜鑑定及其比對結果
[0068]
【權利要求】
1.栽培黑麥的黑麥籽粒Waxy蛋白亞基，具有序列表1所示的胺基酸排列順序。
2.權利要求1所述蛋白的編碼基因，其特徵在於具有序列表2所示的核苷酸序列；或與序列表2所示的核苷酸序列具有90%以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。
3.擴增權利要求2所述編碼基因的引物對。
4.根據權利要求3所述的引物對，其特徵在於表達引物的序列為WxexpF:5，-ATGAACCTCGTGTTCGTCGGC-3，，WxexpR:5，-TCAGGGAGCGGCGACG-3，。
5.權利要求1所述黑麥籽粒Waxy蛋白亞基在調節禾穀類籽粒直鏈澱粉合成酶與調節禾穀類籽粒直鏈澱粉含量的應用。
6.權利要求2所述編碼基因的表達方法，其特徵在於首先採用PCR方法擴增栽培黑麥Waxy基因完整編碼序列，將所得擴增產物回收目的片段，與載體連接並轉化大腸桿菌，在LB平板上37°C過夜培養，利用測序引物進行陽性篩選並測序；利用權利要求5的引物對擴增陽性質粒，將回收片段克隆至表達載體並轉化，將所得陽性菌株誘導後離心收集菌體即得。
7.權利要求1所述黑麥籽粒Waxy蛋白亞基的提取分離方法，其特徵在於採用多籽粒提取，去除懸濁液中的麵筋和種皮，然後將粗澱粉加入上樣緩衝液後高溫水浴和沸煮，離心取上清液；將從籽粒中提取的Waxy蛋白粗提液加載到DuoF1w蛋白純化系統,收集目標洗脫組分供質譜測序及SDS-PAGE檢測。
8.根據權利要求7所述的提取方法，其特徵在於所述高溫水浴條件為80°C、30min水浴。
9.根據權利要求7所述的提取方法，其特徵在於所述Waxy蛋白粗提液採用DuoFlowUNO Ql陽離子交換柱，其中掛柱緩衝液為低濃度Tris-Hcl (20mM Tris-Hcl,pH9.5)，蛋白洗脫液為高濃度 NaCl:20mM Tris+1M NaCl, pH9.5 ;在 280、260、214 或 200nm 波段進行檢測。
10.權利要求1所述黑麥籽粒Waxy蛋白亞基的鑑定方法，其特徵在於採用CE鑑定方法，以DuoF1w純化產物為標準樣，以0.05mM硼砂+15%乙腈+1% SDS溶液(pH9.5)為緩衝液，採用分離電壓20kV，溫度25°C，檢測波長214nm，壓力進樣，0.5psi X 5s。
【文檔編號】C07K14/415GK103554239SQ201310525936
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月30日 優先權日:2013年10月30日
【發明者】高翔, 陳其皎, 董劍, 孟敏, 趙萬春 申請人:西北農林科技大學