一種白僵菌及其製備2-香豆滿酮的方法
2023-06-18 00:45:06
專利名稱：一種白僵菌及其製備2-香豆滿酮的方法
技術領域：
本發明涉及白僵菌，具體屬於一種白僵菌及其製備2-香豆滿酮的方法。
背景技術：
2-香豆滿酮(2-coumaranone)，又名正羥基苯乙酸內酯，是一種合成殺蟲劑和生理學試劑的原材料。2-香豆滿酮目前主要是通過化學合成的方法得到，不僅成本高，產量低，而且生產過程中產生的副產品汙染環境。如果利用微生物發酵產生2-香豆滿酮的方法就有可能解決上述問題。
發明內容
本發明的目的在於提供一種產2-香豆滿酮的白僵菌。
本發明的另一目的是提供一種利用該菌種製備2-香豆滿酮的方法。
本發明提供的一種產2-香豆滿酮的白僵菌，卵孢白僵菌(Beauveria tenella)CGMCC NO.2382。該菌種，是本發明人從河北省承德縣沙陀子鄉瓦房店村油松林油松毛蟲蟲屍上分離獲得的，鑑定為白僵菌屬(Beauveria)的卵孢白僵菌(Beauveria tenella)。該菌種的菌株已於2008年3月3日在北京中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)進行了保藏，保藏中心地址為北京市朝陽區大屯路中國科學院微生物研究所，郵政編碼為100101，菌種保藏號為CGMCC NO.2382。
形態特徵該菌種菌絲棉絮狀，表面色澤白色，在PDA培養基上呈不同程度的淺紫色至紅色，菌絲長而細，直徑為1.5-2.0μm，具有隔膜.產孢細胞有各種形狀，膨大的至細絲狀生於主幹的分枝上，或與主軸呈直角的小枝梗上聚集成緊密的頭狀.孢子亞圓至橢圓形，長直徑為2.0μm-6.0μm，短直徑1.5μm-3.0μm，生於產孢細胞頂端所延伸的「之」字型絲狀器上。
生理生化特徵該菌種在PDA培養基中培養，溫度20-27℃的條件下均可生長。菌株能利用葡萄糖，可產生胞外蛋白酶、脂酶、幾丁質酶，對松毛蟲具有殺蟲活性。
本發明提供的一種製備2-香豆滿酮的方法，包括如下步驟 (1)將保藏號為CGMCC NO.2382的卵孢白僵菌菌種接入斜面培養基，在溫度20-27℃，相對溼度60-85％下培養7-10天，得到斜面菌種； (2)將斜面菌種在無菌條件下接入裝有液體培養基的三角瓶中，在溫度20-27℃培養7-10天，得到種子液； (3)將種子液接入裝有液體培養基的發酵罐中，在溫度20-27℃培養7-10天，得到菌種發酵液； 所述的固體斜面培養基的組分和配比蛋白腖8-15g/L，酵母浸出膏8-15g/L，葡萄糖30-50g/L，瓊脂15-25g/L，蒸餾水定容；所述的液體培養基的組分和配比蛋白腖8-15g/L，酵母浸出膏8-15g/L，葡萄糖30-50g/L，蒸餾水定容； (4)將培養好的菌種發酵液在5000r/min下離心15-30min，除去菌絲體，將上清液在45-50℃下濃縮至原體積的1/4-1/5，室溫下加入3倍體積95％乙醇，靜置24h-36h，4000r/min下離心10-20min，去除沉澱，上清液脫醇後，加入1.5-2.5倍體積的乙酸乙酯，萃取三次，所得有機相濃縮乾燥，得粗提物乾粉； (5)將粗提物乾粉用常壓矽膠色譜進行分離，得到含有2-香豆滿酮的物質。
所述的固體斜面培養基的組分和配比優選為蛋白腖10g/L，酵母浸出膏10g/L，葡萄糖40g/L，瓊脂20g/L，蒸餾水定容。所述的液體培養基的組分和配比優選為蛋白腖10g/L，酵母浸出膏10g/L，葡萄糖40g/L，蒸餾水定容。
本發明的優點和效果本發明通過微生物發酵的方法製備得到2-香豆滿酮，與化學合成的方法相比，方法簡單，成本低，而且生產過程不產生汙染。
本發明所提供的卵孢白僵菌(Beauveria tenella)CGMCC NO.2382不僅可用於2-香豆滿酮的提取，也可用於防治松毛蟲。
說明書附圖
圖1含有2-香豆滿酮的物質的GC/MS檢測氣相色譜圖 圖2
圖1中峰2與2-香豆滿酮的標準質譜圖比較
具體實施例方式 實施例1 2-香豆滿酮的製備，包括如下步驟 (1)將保藏號為CGMCC NO.2382的卵孢白僵菌菌種接入斜面培養基，在溫度25℃，相對溼度75％下培養7天，得到斜面菌種； (2)將斜面菌種在無菌條件下接入裝有200ml液體培養基的500ml三角瓶中，置於恆溫震蕩培養箱，25℃下180r/min，培養7天，得到種子液； (3)在7L液體發酵罐中，裝入5L的液體培養基，將1瓶上述培養好的種子液接入發酵罐中，在25±0.5℃，375±5r/min下培養7天，得到菌種發酵液； 所述固體斜面培養基配比蛋白腖10g/L，酵母浸出膏10g/L，葡萄糖40g/L，瓊脂20g/L，蒸餾水定容；所述液體培養基配比蛋白腖10g/L，酵母浸出膏10g/L，葡萄糖40g/L，蒸餾水定容；固體斜面培養基和液體培養基在製備時均要通過常規方法滅菌； (4)將培養好的菌株發酵液於5000r/min下離心20min，去除菌絲體。然後將上清液於50℃下濃縮至原體積的1/5，室溫下加入3倍體積95％乙醇，醇沉，靜置24h，4000r/min下離心20min，去除沉澱；上清脫醇後，加入2倍體積的乙酸乙酯，分三次進行萃取，所得有機相濃縮乾燥，得粗提物乾粉； (5)將粗提物乾粉用常壓矽膠色譜進行初步分離，首先將選出的流動相加入到層析柱中，然後用自然沉降法將矽膠裝入20mm×300mm玻璃柱中；同時將0.2g試樣溶於乙酸乙酯中，然後加入樣品質量5倍矽膠攪拌均勻，濃縮成乾粉，用自然沉降法加到矽膠柱的上部；用優選的流動相(乙酸乙酯/甲醇/水＝170/10/5)進行洗脫；自動分步收集；逐管點樣進行薄層分析，得到6組組分，其中第6組組分佔總量的60％。
將第6組組分進行化學成分鑑定成分分析採用氣/質聯用技術，GC/MS聯用儀的型號為島津GC/MS-QP2010，色譜柱型號為DB-5ms，長30m，直徑0.25mm。測試的工作條件為先將溫度升到120℃，保持2min，然後以20℃/min的速度升到250℃保持20min。分流比為10∶1，進樣口溫度為250℃。質譜條件離子源溫度為250℃，電子能量是70ev，掃描範圍為20-650m/z。
鑑定結果分析得到色譜圖(
圖1)，從色譜圖看出，第6組物質進樣後出峰主要集中在保留時間3.625-19.117min範圍內，共17個峰，對質譜圖檢索和解析後得知其包括17個組分，其中相對含量大於2％的有6種組分(表1)，包括2-哌啶酮佔14.02％，2-香豆滿酮佔47.10％，3-吡咯烷-2-基-丙酸佔6.16％，六氫化-吡咯環[1，2-a]吡嗪-1，4-二酮佔21.05％，5，10-二乙氧基-2，3，7，8-4氫化-1H，6H-雙吡咯[1，2-a；1』，2』-d]吡嗪佔2.782％，1，2-苯二甲酸，二異辛酯佔3.69％，其餘組分只佔5.21％。其中2-香豆滿酮佔47.10％，說明它是第6組物質的主要成分。根據質譜圖與資料庫進行對照，這種組分與標準圖譜的符合度為98％(圖2)。由以上分析可知2-香豆滿酮是該菌株的主要代謝產物。
表1第6組物質經GC/MS檢測的化學組分
實施例2 卵孢白僵菌(Beauveria tenella)CGMCC NO.2382的殺蟲活性試驗 PDA培養基馬鈴薯200g、瓊脂20g、葡萄糖20g、蒸餾水1000ml。
供試昆蟲為採自山西省靈丘縣西山礦物局林場的油松毛蟲4-5齡健康幼蟲。
孢子懸液的製備將供試菌株斜面培養後，用0.1％吐溫80無菌水配製成濃度為1.0×107個/ml的孢子懸液。
白僵菌孢子懸液對油松毛蟲的殺蟲活性試驗 用濃度為1.0×107個/ml的孢子懸液感染油松毛蟲5齡幼蟲，每組30頭，設3重複和對照。對感染孢子懸液的油松毛蟲5齡幼蟲和空白對照組進行觀察。感染組在第二、三天體重較前一天有所增加，經觀察取食量與對照比變化不大；從第四天開始，大部分幼蟲取食量下降，個別幼蟲停止取食，體重開始下降；從第五天開始，被感染組幼蟲體重下降加快；第六天開始有幼蟲相繼死亡；第七天統計每組死亡蟲數分別為19頭、15頭、20頭，平均死亡蟲數為18.0頭。蟲屍僵硬且放置幾天後長出白色菌絲。對照組在試驗觀察中幼蟲的行為沒有異常變化，正常取食，體重有所上升，第7天每組死亡蟲數分別為1頭、2頭、1頭，平均死亡蟲數為1.3頭。蟲屍沒有菌絲，也沒有僵硬現象。根據計算，白僵菌孢子懸液對油松毛蟲的校正死亡率達到57.52％，用t-檢驗對數據進行統計分析，P＜0.01，說明白僵菌孢子懸液對油松毛蟲幼蟲有極顯著的殺蟲活性(表2)。
表2孢子懸液對油松毛蟲的殺蟲活性
權利要求
1、一種產2-香豆滿酮的白僵菌，卵孢白僵菌(Beauveria tenella)CGMCC NO.2382。
2、一種製備2-香豆滿酮的方法，其特徵在於，包括如下步驟
(1)將保藏號為CGMCC NO.2382的卵孢白僵菌菌種接入斜面培養基，在溫度20-27℃，相對溼度60-85％下培養7-10天，得到斜面菌種；
(2)將斜面菌種在無菌條件下接入裝有液體培養基的三角瓶中，在溫度20-27℃培養7-10天，得到種子液；
(3)將種子液接入裝有液體培養基的發酵罐中，在溫度20-27℃培養7-10天，得到菌種發酵液；
所述的固體斜面培養基的組分和配比蛋白腖8-15g/L，酵母浸出膏8-15g/L，葡萄糖30-50g/L，瓊脂15-25g/L，蒸餾水定容；所述的液體培養基的組分和配比蛋白腖8-15g/L，酵母浸出膏8-15g/L，葡萄糖30-50g/L，蒸餾水定容；
(4)將培養好的菌種發酵液在5000r/min下離心15-30min，除去菌絲體，將上清液在45-50℃下濃縮至原體積的1/4-1/5，室溫下加入3倍體積95％乙醇，靜置24h-36h，4000r/min下離心10-20min，去除沉澱，上清液脫醇後，加入1.5-2.5倍體積的乙酸乙酯，萃取三次，所得有機相濃縮乾燥，得粗提物乾粉；
(5)將粗提物乾粉用常壓矽膠色譜進行分離，得到含有2-香豆滿酮的物質。
3、如權利要求2所述製備2-香豆滿酮的方法，其特徵在於，所述的固體斜面培養基的組分和配比蛋白腖10g/L，酵母浸出膏10g/L，葡萄糖40g/L，瓊脂20g/L，蒸餾水定容。
4、如權利要求2所述製備2-香豆滿酮的方法，其特徵在於，所述的液體培養基的組分和配比蛋白腖10g/L，酵母浸出膏10g/L，葡萄糖40g/L，蒸餾水定容。
5、如權利要求1所述的一種產2-香豆滿酮的白僵菌，可用於防治松毛蟲。
全文摘要
本發明提供了一種產2-香豆滿酮的白僵菌，卵孢白僵菌(Beauveria tenella)CGMCC NO.2382。並提供了利用該菌種製備2-香豆滿酮的方法，步驟包括白僵菌發酵液製備，發酵液經離心、萃取、乾燥得粗提物乾粉，用常壓矽膠色譜進行分離，得到含有2-香豆滿酮的物質。本發明通過微生物發酵的方法製備得到2-香豆滿酮，與化學合成的方法相比，方法簡單，成本低，而且生產過程不產生汙染。本發明所提供的卵孢白僵菌不僅可用於2-香豆滿酮的提取，也可用於防治松毛蟲。
文檔編號A01P7/04GK101302478SQ200810054719
公開日2008年11月12日 申請日期2008年3月28日 優先權日2008年3月28日
發明者謝映平, 樊金華, 薛皎亮, 李保珍 申請人:山西大學