一種低溫高效玉米秸稈降解複合菌系及其應用的製作方法

2023-06-06 03:23:16

一種低溫高效玉米秸稈降解複合菌系及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及微生物領域，具體公開了一種低溫高效玉米秸稈降解複合菌系及其應用。本發明所述複合菌系包括細菌和真菌，所述細菌包括Cellvibrio、Azospira、Arcobacter、Azonexus、Clostridium、Paludibacter菌屬，所述真菌包括Lotharella、Trichosporon菌屬。本發明以特定組成的菌屬為菌源樣品，利用與之相適應的培養基，經過富集培養、繼代培養、產酶活培養以及玉米秸稈降解培養，篩選馴化出由特定菌屬組成的複合菌系，其能夠在低溫條件下高效降解玉米秸稈，彌補了現有微生物菌劑只能在中高溫條件下降解秸稈的缺陷。
【專利說明】一種低溫高效玉米秸稈降解複合菌系及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及微生物領域，更具體的說是涉及一種低溫高效玉米秸杆降解複合菌系及其應用。
【背景技術】
[0002]秸杆纖維素是地球上最豐富、來源最廣泛的有機物質。玉米秸杆原位還田，不僅可提高玉米秸杆的綜合利用率，而且是培肥改土、提高土壤肥力的一項行之有效的技術措施。但由於我國北方氣候寒冷乾燥，玉米秸杆在短期內的不易腐解，直接還田影響墒情和耕作，廢棄和焚燒不僅造成了資源浪費，而且引起環境汙染。由於秸杆中含量達到40%~50%的纖維素大分子被木質素包圍，而木質素分子很穩定，不易降解，這使得秸杆中的纖維素難於被分解利用，秸杆腐解速度慢、腐解效果差已成為限制秸杆資源利用的瓶頸。因此，實現大量玉米秸杆就地直接還田，加快秸杆腐解速度，是生產實踐中提出的急切需要解決的課題。
[0003]土壤中纖維素酶對秸杆降解有很重要的促進作用，但是自然條件下土壤中纖維素酶的活性較低，通過利用秸杆降解菌，加快秸杆有機質的原位分解速度，是促進秸杆原位降解的新途徑。為了提高秸杆降解效果，人們對在秸杆還田中應用微生物菌劑進行了大量研究並出現了一些市售微生物菌劑，但這些微生物菌劑的適應溫度均是中高溫(15-50°C )，而北方地區氣候較為寒冷，中高溫的微生物菌劑無法適應，易出現酶活低、穩定性差、易退化、耐冷性差等問題， 無法利於秸杆還田效果，因而開發一種適合於北方地區寒冷氣候的高效秸杆降解菌對秸杆還田具有重大意義。

【發明內容】

[0004]有鑑於此，本發明的目的在於提供一種低溫高效玉米秸杆降解複合菌系，使其能夠在低溫狀態下高效降解玉米秸杆；
[0005]本發明的另一個目的在於提供一種低溫高效玉米秸杆降解複合菌系，使其降解玉米秸杆的穩定性較高；
[0006]本發明的另一個目的在於提供一種低溫高效玉米秸杆降解複合菌系，使其提高土壤脲酶酶活、過氧化氫酶酶活、β -葡萄糖苷酶酶活、纖維素酶酶活、轉化酶酶活和鹼性磷酸酶酶活；
[0007]本發明的另一個目的在於提供一種低溫高效玉米秸杆降解複合菌系，使其提高土壤腐殖質和肥力；
[0008]本發明的另一個目的是提供所述複合菌系在降解玉米秸杆以及製備降解玉米秸杆產品中的應用，特別是在降解溫度為4-10°C低溫降解玉米秸杆以及製備低溫降解玉米秸杆廣品中的應用；
[0009]本發明的另一個目的是提供所述複合菌系在提高土壤腐殖質和肥力中的應用以及在提高土壤脲酶酶活、過氧化氫酶酶活、β -葡萄糖苷酶酶活、纖維素酶酶活、轉化酶酶活和鹼性磷酸酶酶活的應用。[0010]為實現上述目的，本發明提供如下技術方案:
[0011]一種低溫高效玉米秸杆降解複合菌系，包括細菌和真菌，所述細菌包括Cellvibrio、Azospira、Arcobacter> Azonexus、Clostridium、Paludibacter 菌屬，所述真菌包括 Lotharella、Trichosporon 菌屬；
[0012]其由以下步驟製備獲得:
[0013]步驟1、將包含有 Cellvibrio、Azospira、Arcobacter> Azonexus、Clostridium、Paludibacter> Lotharella、Trichosporon菌屬的樣品，按100g/L的接種量接種到放置有濾紙條的富集培養基中25°C培養，所述富集培養基包含5g/L蛋白腖、lg/L酵母提取粉、5g/L氯化鈉、5g/L玉米稻杆、2.0g/L CaC0310mL/L 土壤浸提液,其餘成分為無菌水；
[0014]步驟2、培養15-20天至富集培養基顏色變深、濾紙條潰爛，取培養液按5-10%接種量接種到新鮮的步驟I所述富集培養基中繼續富集培養；
[0015]步驟3、重複3-4次步驟2，取富集培養後的培養液按5-10%接種量接種到放置有濾紙條的繼代培養基中25°C培養，培養至濾紙條黃化斷裂時停止並記錄濾紙條黃化斷裂時間，所述繼代培養基包含(NH4) 2S042.0g/L、K2HPO4L Og/L、MgSO4.7Η200.05g/L、CaC032.0g/L、NaC10.2g/L、5g/L玉米秸杆，餘量為水；
[0016]步驟4、取繼代培養後的培養液按5-10%接種量接種到新鮮的放置有濾紙條的所述繼代培養基中25°C繼代培養，培養至濾紙條黃化斷裂時停止並記錄濾紙條黃化斷裂時間； [0017]步驟5、重複步驟4至濾紙條黃化斷裂時間恆定時，降低繼代培養溫度1_2°C，繼續按照步驟4方法繼代培養；
[0018]步驟6、繼代培養溫度降至4°C且濾紙條黃化斷裂時間恆定時，取繼代培養後的培養液按5-10%接種量接種到產酶培養基10°C培養，每隔24h測定一次酶活，連續測定12次，選取濾紙酶最高酶活大於1.lU/ml、內切酶最高酶活大於1.7U/ml的複合菌系培養液，所述產酶培養基包含蛋白腖0.5g/L、(NH4) 2S042.0g/L、K2HPO4L Og/L、尿素0.6g/L、MgSO4.7Η200.05g/L、MnS04.7Η200.016g/L、ZnSO4.7Η200.017g/L、CaCl20.02g/L、NaC10.2g/L,餘量為水；
[0019]步驟7、將步驟6選取的複合菌系培養液按5-10%接種量接種到玉米秸杆降解培養基中10°c培養15天，選取玉米秸杆降解率大於23%的複合菌系培養液，即為所述複合菌系，所述玉米稻杆降解培養基包含100g/L玉米稻杆、(NH4)2S0415g/L、尿素3g/L、蛋白腖 3g/L、CaCl20.lg/L、MgSO4.7H205g/L、K2HPO41 g/L, NaCl0.lg/L、FeSO4.7H200.05g/L、MnSO4.7H200.016g/L、ZnSO4.7H200.014g/L、CoCl20.02g/L，餘量為水。
[0020]本發明所述按5-10%接種量是指每IOOmL培養基中接種5_10mL培養液。
[0021]本發明針對現有降解秸杆微生物菌劑均為中高溫的適應溫度的缺陷，以特定組合的菌源樣品進行一系列的篩選馴化步驟，獲得在4-10°C低溫狀態下具有高效降解玉米稻杆的複合菌系，該複合菌系包含有Cellvibrio、Azospira、Arcobacter> Azonexus、Clostridium、Paludibacter> Lotharella、Trichosporon 菌屬。
[0022]其中，作為優選，所述樣品為我國北方高寒地區富含纖維素的多年玉米秸杆還田土壤、牛羊糞或草原草甸土，如吉林長春長年玉米秸杆還田土壤，內蒙古通遼市玉米秸杆還田土壤，內蒙古呼倫貝爾根河、滿歸等地的森林腐殖質材料，內蒙古呼倫貝爾、興安盟等地的草原牛羊糞。
[0023]作為優選，所述複合菌系包括細菌和真菌，所述細菌包括Cellvibrio mixtussubsp.Mixtus ACM26011"、Azospira oryzae6aT> Arcobacter defluvii SW28-11T> Azonexushydrophilus d8_lT、Clostridium populeti ATCC352951"、Paludibacter propionicigenesWB4T,所述真菌包括 Lotharella globosa、Trichosporon sp.、Trichosporon loubieri。
[0024]作為優選，所述土壤浸提液由土壤和去離子水按質量比1:1混合，60°C水浴2h，過濾滅菌製備獲得。
[0025]作為優選，所述富集培養為在25°C下先以50rpm/min轉動30min，然後靜置培養。
[0026]作為優選，所述富集培養基和繼代培養基中的玉米秸杆為經過烘乾剪切後的l-2cm長度玉米秸杆。
[0027]在本發明篩選馴化過程中，所採用的濾紙條主要成分為纖維素，既可以作為篩選馴化的外觀指標，也可以和玉米秸杆一同作為培養基碳源參與菌系的限制性培養。其中，所述濾紙條優選一半位於培養基液面以下，一半位於葉面以上，濾紙條潰爛或斷裂越接近液面，代表複合菌系的降解能力越強。作為優選，所述濾紙條均為WhatmanNOl濾紙條。
[0028]利用本發明所述複合菌系在4-10°C下進行玉米秸杆降解，其降解率仍能達到23%以上，比空白對照處理提高了 21.94% ;而利用市售微生物菌劑(山東天合生物工程技術有限公司，生物反應堆專用菌種001)在其最適應的中高溫(15°C -30°C )下進行玉米秸杆的降解，其降解率分別為13.34±0.96%和19.13±1.07%。
[0029]將本發明所述複合菌系培養至25代時，各代之間在10°C下玉米秸杆降解率無明顯差別，具有較高的穩定性。同時，本發明所述複合菌系在10°C下具有較高的FPA、C1、CX、CB以及木聚糖酶活，表明其能夠有效針對玉米秸杆進行降解。
[0030]此外，本發明所述複合菌系提高土壤腐殖質、肥力，優化突然腐殖質組成結構，提高土壤脲酶酶活、過氧化氫酶酶活、β -葡萄糖苷酶酶活、纖維素酶酶活、轉化酶酶活和鹼性磷酸酶酶活。
[0031]由此，本發明還提供本發明所述複合菌系在降解玉米秸杆以及製備降解玉米秸杆產品中的應用。作為優選，所述降解的溫度為4-10°C。
[0032]還提供本發明所述複合菌系在提高土壤腐殖質和肥力中的應用以及在提高土壤脲酶酶活、過氧化氫酶酶活、β -葡萄糖苷酶酶活、纖維素酶酶活、轉化酶酶活和鹼性磷酸酶酶活的應用。
[0033]由以上技術方案可知，本發明以特定組成的菌屬為菌源樣品，利用與之相適應的培養基，經過富集培養、繼代培養、產酶活培養以及玉米秸杆降解培養，篩選馴化出由特定菌屬組成的複合菌系，其能夠在低溫條件下高效降解玉米秸杆，提高土壤肥力和多種酶活，彌補了現有微生物菌劑只能在中高溫條件下降解秸杆的缺陷。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0034]圖1所示為本發明所述複合菌系玉米秸杆降解率折線圖；
[0035]圖2所示為不同處理土壤脲酶酶活變化折線圖；
[0036]圖3所示為不同處理土壤過氧化氫酶酶活變化折線圖；
[0037]圖4所示為不同處理土壤轉化酶酶活變化折線圖；[0038]圖5所示為不同處理土壤β -葡萄糖苷酶酶活變化折線圖；
[0039]圖6所示為不同處理土壤纖維素酶酶活變化折線圖；
[0040]圖7所示為不同處理土壤鹼性磷酸酶酶活變化折線圖；
[0041]圖8所示為本發明所述複合菌系不同代數的玉米秸杆降解率柱形圖。
【具體實施方式】
[0042]本發明公開了一種低溫高效玉米秸杆降解複合菌系及其應用，本領域技術人員可以借鑑本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明所述複合菌系及其應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
【發明內容】
、精神和範圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。
[0043]下面結合實施例，進一步闡述本發明。
[0044]實施例1:本發明所述複合菌系的篩選馴化
[0045]富集培養:
[0046]將秋季收穫後的天然玉米秸杆洗淨烘乾至恆重之後剪成l-2cm左右長若干，121。。、101Pa 滅菌 30min 備用。
[0047]土壤浸提液由土壤和去離子水按質量比1:1混合，60°C水浴2h，過濾滅菌製備獲得
[0048]將包含有Cellvibrio、Azospira、Arcobacter> Azonexus、Clostridium、Paludibacter、Lotharella、Trichosporon菌屬的長春市多年玉米稻杆還田的土壤，按100g/L的接種量接種到放置有Whatman NOl濾紙條(2*6cm,—半浸入培養基液面以下,一半位於液面以上)的富集培養基中，50rpm/min輕輕轉動30min後25°C靜置培養，所述富集培養基包含5g/L蛋白腖、lg/L酵母提取粉、5g/L氯化鈉、5g/L玉米秸杆、2.0g/L CaCO3UOmL/L 土壤浸提液，其餘成分為無菌水；
[0049]每天觀察培養物情況，培養15-20天至富集培養基顏色變深、濾紙條潰爛，取培養液按5-10%接種量接種到新鮮的所述富集培養基中繼續富集培養，如此重複轉接3-4次，完成富集培養，準備進入繼代培養；
[0050]繼代培養和低溫馴化:
[0051]取4次富集培養後的培養液按5-10%接種量接種到放置有Whatman NOl濾紙條(2*6cm,—半浸入培養基液面以下，一半位於液面以上)的繼代培養基中25°C繼代培養，培養至濾紙條黃化斷裂時停止並記錄濾紙條黃化斷裂時間，所述繼代培養基包含(NH4) 2S042.0g/L、K2HPO4L Og/L、MgSO4.7Η200.05g/L、CaC032.0g/L、NaCl0.2g/L、5g/L 玉米稻杆，餘量為水；
[0052] 上述取繼代培養後的培養液按5-10%接種量接種到新鮮的放置有濾紙條的所述繼代培養基中25°C繼代培養，再次培養至濾紙條黃化斷裂時停止並記錄濾紙條黃化斷裂時間；重複此繼代培養步驟，至濾紙條黃化斷裂時間恆定時，降低繼代培養溫度1_2°C，繼續繼代培養；
[0053]產酶活培養:
[0054]繼代培養溫度降至4°C且濾紙條黃化斷裂時間恆定時，取繼代培養後的培養液按5-10%接種量接種到產酶培養基10°C培養，每隔24h測定一次酶活，連續測定12次，選取濾紙酶最高酶活大於1.lU/ml、內切酶最高酶活大於1.7U/ml的複合菌系培養液,所述產酶培養基包含蛋白腖 0.5g/L、(NH4) 2S042.0g/L、K2HPO4L Og/L、尿素 0.6g/L、MgSO4.7Η200.05g/UMnSO4.7Η200.016g/L、ZnSO4.7Η200.017g/L、CaCl20.02g/L、NaC10.2g/L，餘量為水；
[0055]玉米秸杆降解培養:
[0056]將經過產酶活培養選取的複合菌系培養液按5-10%接種量接種到玉米秸杆降解培養基中10°c培養15天，選取玉米秸杆降解率大於23%的複合菌系培養液，即為所述複合菌系，所述玉米稻杆降解培養基包含100g/L玉米稻杆、(NH4)2S0415g/L、尿素3g/L、蛋白腖 3g/L、CaCl20.lg/L、MgSO4.7H205g/L、K2HPO41 g/L, NaCl0.lg/L、FeSO4.7H200.05g/L、MnSO4.7H200.016g/L、ZnSO4.7H200.014g/L、CoCl20.02g/L，餘量為水。
[0057]實施例2:本發明所述複合菌系的鑑定
[0058]將實施例1篩選出的複合菌系，通過對菌系16S-rDNA和18S_rDNA序列進行測定菌系菌種組成，結果見表1。
[0059]表1複合菌系微生物菌種組成
[0060]
【權利要求】
1.一種低溫高效玉米秸杆降解複合菌系，其特徵在於，包括細菌和真菌，所述細菌包括Cellvibrio、Azospira、Arcobacter> Azonexus、Clostridium、Paludibacter 菌屬，所述真菌包括 Lotharella、Trichosporon 菌屬； 其經以下步驟篩選馴化獲得: 步驟 1、將包含有 Cellvibrio、Azospira、Arcobacter> Azonexus、Clostridium、Paludibacter> Lotharella、Trichosporon菌屬的樣品，按100g/L的接種量接種到放置有濾紙條的富集培養基中富集培養，所述富集培養基包含5g/L蛋白腖、lg/L酵母提取粉、5g/L氯化鈉、5g/L玉米稻杆、2.0g/L CaC03、10mL/L 土壤浸提液,其餘成分為無菌水； 步驟2、培養15-20天至富集培養基顏色變深、濾紙條潰爛，取培養液按5-10%接種量接種到新鮮的步驟I所述富集培養基中繼續富集培養； 步驟3、重複3-4次步驟2，取富集培養後的培養液按5-10%接種量接種到放置有濾紙條的繼代培養基中25°C繼代培養，培養至濾紙條黃化斷裂時停止並記錄濾紙條黃化斷裂時間，所述繼代培養基包含(NH4) 2S042.0g/L、K2HPO4L Og/L、MgSO4.7Η200.05g/L、CaC032.0g/L、NaC10.2g/L、5g/L玉米秸杆，餘量為水； 步驟4、取繼代培養後的培養液按5-10%接種量接種到新鮮的放置有濾紙條的所述繼代培養基中25°C繼代培養，培養至濾紙條黃化斷裂時停止並記錄濾紙條黃化斷裂時間； 步驟5、重複步驟4至濾紙條黃化斷裂時間恆定時，降低繼代培養溫度1_2°C，繼續按照步驟4方法繼代培養； 步驟6、繼代培養溫度降至4°C且濾紙條黃化斷裂時間恆定時，取繼代培養後的培養液按5-10%接種量接種到產酶培養基10°C培養，每隔24h測定一次酶活，連續測定12次，選取濾紙酶最高酶活大於1.lU/ml、內切酶最高酶活大於1.7U/ml的複合菌系培養液，所述產酶培養基包含蛋白腖0.5g/L、(NH4)2S042.0g/L、K2HPO4L Og/L、尿素0.6g/L、MgSO4.7Η200.05g/L、MnS04.7Η200.016g/L、ZnSO4.7Η200.017g/L、CaCl20.02g/L、NaC10.2g/L,餘量為水； 步驟7、將步驟6選取的複合菌系培養液按5-10%接種量接種到玉米秸杆降解培養基中10°C培養15天，選取玉米秸杆降解率大於23%的複合菌系培養液，即為所述複合菌系，所述玉米稻杆降解培養基包含100g/L玉米稻杆、(NH4)2S0415g/L、尿素3g/L、蛋白腖 3g/L、CaCl20.lg/L、MgSO4.7H205g/L、K2HPO41 g/L, NaCl0.lg/L、FeSO4.7H200.05g/L、MnSO4.7H200.016g/L、ZnSO4.7H200.014g/L、CoCl20.02g/L，餘量為水。
2.根據權利要求1所述的複合菌系，其特徵在於，所述樣品為我國北方高寒地區富含纖維素的多年玉米秸杆還田土壤、牛羊糞或草原草甸土。
3.根據權利要求1所述的複合菌系，其特徵在於，所述土壤浸提液由土壤和去離子水按質量比1:1混合，60°c水浴2h，過濾滅菌製備獲得。
4.根據權利要求1所述的複合菌系，其特徵在於，所述富集培養為在25°C下先以50rpm/min轉動30min,然後靜置培養。
5.根據權利要求1所述的複合菌系，其特徵在於，所述富集培養基和繼代培養基中的玉米秸杆為經過烘乾剪切後的l-2cm長度玉米秸杆。
6.根據權利要求1所述的複合菌系，其特徵在於，所述濾紙條均為WhatmanNOl濾紙條。
7.權利要求1-6任意一項所述的複合菌系在降解玉米秸杆以及製備降解玉米秸杆產品中的應用。
8.根據權利要求7所述應用，其特徵在於，所述降解的溫度為4-10°C。
9.權利要求1-6任意一項所述的複合菌系在提高土壤腐殖質和肥力中的應用。
10.權利要求1-6任意一項所述的複合菌系在提高土壤脲酶酶活、過氧化氫酶酶活、β -葡萄糖苷酶酶活、 纖維素酶酶活、轉化酶酶活和鹼性磷酸酶酶活的應用。
【文檔編號】C12R1/145GK104004694SQ201410277388
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年6月19日 優先權日:2014年6月19日
【發明者】高聚林, 青格爾, 於曉芳, 胡樹平, 鬧幹朝魯, 孫繼穎, 王振, 王志剛, 蘇志軍, 謝岷, 薩如拉, 高琳, 胡海紅 申請人:內蒙古農業大學