用於含凝集素的天然產物的腸溶包衣的組合物的製作方法

2023-06-06 07:52:51 1

專利名稱：用於含凝集素的天然產物的腸溶包衣的組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種用於含有凝集素的槲寄生提取物的腸溶包衣的組合物。本發明還涉及一種用於以凝集素為主要成分的腸溶包衣微囊的組合物。
背景技術：
凝集素可以從多種植物中提取，例如，槲寄生、山茱萸科、月見草、菜豆、豆類、麥冬、芍藥科、血根(sangryuk)、番木瓜科、酸漿屬、土當歸(todangui)、常春藤屬、藜科、蘆根(guallugun)、日本蘑菇(shitake mushroom)、半夏、黃楊樹、金合歡屬以及各種來自海洋的天然物質如海星和泥魚。目前，可以工業化規模生產大量的凝集素，而且，來自菜豆(PHA)，蓖麻蛋白，相思豆毒蛋白等物質的伴刀豆球蛋白A(con A)或凝集素已應用於許多研究中。凝集素是一種糖蛋白或者葡萄糖結合蛋白，其具有兩個以上的葡萄糖結合位點。它凝集紅細胞和其他血細胞，並沉澱碳水化合物。凝集素的各種生化和免疫特性使其被應用於治療、診斷及生命科學的研究方法中(Chung et al.，Arch Pharm Res vol.40(4)387-393，1996)。
凝集素的一個最重要的生化和免疫特性是選擇性凝集腫瘤細胞、特異性拮抗人類血細胞、激活處於S期的淋巴細胞的分化的促有絲分裂活性等。具有2到6個葡萄糖結合位點並具有B-鏈(結合鏈)的凝集素能夠結合到細胞表面受體(特異的糖類)上，並因此使凝集素可以進入細胞的A-鏈(活性鏈)，該A-鏈可以抑制核糖體的活性從而抑制蛋白質的合成。細胞表面的糖類與B-鏈的結合與抗原-抗體反應相似，並且這種結合特異性對免疫系統的調節或抗癌活性有著重要的直接作用。據報導，癌性淋巴細胞在由凝集素引起的凝集活性方面與正常淋巴細胞不同，這一事實成為用凝集素改變癌性細胞膜的研究基礎。當凝集素作用於淋巴細胞時，已經分化的淋巴細胞分裂並增殖為淋巴母細胞。
凝集素生理活性的免疫特性之一是對淋巴細胞具有促有絲分裂活性。根據凝集素的類型不同，凝集素可以刺激T細胞或B細胞。對T細胞的機理是凝集素刺激巨噬細胞分泌白介素-1(IL-1)，因此激活輔助T細胞分泌IL-2而使T細胞增殖。對B細胞的機理是凝集素直接起作用或者通過輔助T細胞分泌的幹擾素-γ(IFN-γ)、IL-4、IL-5和IL-6起作用而使B細胞增殖。
第二，其具有抗癌活性。當將凝集素給予由癌細胞抗原生長激活的單細胞群抗體時，就通過抑制蛋白質的合成來抑制癌細胞的生長(Vieta et al.，Science 219644，1983)，巨噬細胞或多核白細胞在凝集素存在下溶解癌細胞(Ohkuma et al.，CancerRes.45，4397，1985)。而由凝集素激活的T細胞或巨噬細胞分泌的細胞因子(IFN-γ，IL-2，TNF-a)的抗癌活性機制已有報導(Tamuraet al.，FEBS Lett.175325-328，1984)。
此外，凝集素還有擬胰島素活性。據報導，凝集素可以與脂肪細胞的胰島素受體結合，以便促進葡萄糖的轉運和代謝、促進脂肪形成並提高丙酮酸脫氫酶的活性、促進糖原合成並提高Mg-ATP酶的活性、抑制脂類分解和腺苷酸環化酶的活性(Suya et al.，J.Biochem.921251-1257，1982)。
如上所述，雖然天然來源的物質中包含的凝集素具有許多生理活性，但是由於在小腸中凝集素蛋白會被消化為胺基酸並吸收入血液循環系統而使凝集素失去功效(Pusztai A.Lectins.Toxicants inplant origin，Vol III，1987)。
一種含有凝集素的植物槲寄生(Viscum album)長期用於癌症治療，它具有非常好的抗癌活性和極少的副作用(Hajto et al.，Cancer Research 503322-3326，1990.Jassen et al.，Drug Research 43(11)1221-1227，1993，Am.Soc.Biochem.and Molc.Biol.267(33)23722-23727，1992)。據報導，這種植物可以直接殺死癌細胞、具有免疫活化綜合作用、可以刺激體液和細胞介導的免疫、並可以激活巨噬細胞和自然殺傷(NK)細胞，從而抑制癌細胞，並且提高癌症患者的生存率(Jassen et al.Drug Research，43(11)1221-1227，1993)。
這種植物含有分子量為60kDa的凝集素、粘毒素、多糖、及其它活性因子，而其中最有效的成分是凝集素(Bussing et al.，CancerLett.92199-205，1995，Cancer Lett.9959-72，1996.，Jung et al.，Cancer Letters 51103-108，1990)。由抗癌藥物獲得的抗癌效果會誘導癌細胞的死亡或抑制癌細胞的非正常生長。槲寄生的抗腫瘤細胞和白細胞的細胞毒性源於誘導凋亡，並且據報導，只有凝集素能夠誘導此過程(Bussing et al.，Cancer Lett.94199-205，1995，Cancer Lett.9959-72，1996)。
已有報導表明，韓國槲寄生(Viscum album，L.coloratum)，一種歐洲槲寄生的變種，在療效方面優於歐洲槲寄生，但是對其研究不足(Park et al.，Arch Pharm Res vol.38(4)418-424，1994，ArchPharm Res vol.39(1)24-30，1995，Arch.Pharm.Res.20(4)306-312，1997，Arch.Pharm.Res.21(40)429-435，1998，Foods andbiotechnology 8(4)232-237，1999)。
本申請的發明人從韓國槲寄生中提取了凝集素，並已證明其和歐洲槲寄生具有相似的細胞毒性效果，但在槲寄生提取物中，如果沒有凝集素就會失去這種活性(Park et al.，Food Sci.and Biotechnol.8391-396，1999.，Foods and Biotechnol.8(4)232-237，1999)。而且，進行了基因和胺基酸序列分析，隨後通過柱層析，發明人提取到了純的凝集素，發現它具有增強免疫和抗癌的效果，他們為ELLA(酶聯凝集素分析)申請了專利(韓國專利申請第2000-83383號)，其用於檢測槲寄生中凝集素的濃度。而且，槲寄生的水提取物具有極少的副作用，並能有效地抑制包括皮膚癌在內的各種癌的轉移。此外，他們開發了凝集素加強的槲寄生提取物以及一種抗癌組合物，該組合物通過凝集素可以利用由凋亡引起的細胞毒性、抗血管生成作用、抑制端粒酶活性。他們開發和申請了可以在皮膚癌或口腔癌的患部直接加藥的藥物專利(韓國專利申請第2001-0061118號)。
雖然抗癌作用的主要因素是凝集素，但是目前生產的槲寄生藥物是水提取物的複雜混合物，並且已有報導表明該混合物比單一的凝集素更有效。這是因為其他化合物像粘毒素、生物鹼等在一起具有協同效應。尤其是有報導表明5kDa的粘毒素也具有抗癌作用(Schaller et al.，Phytotherapy Res.10473-477)。此外，複雜混合物中的凝集素要比單一的凝集素更穩定的事實可能是另一個原因。
像這樣，槲寄生具有有效的抗癌活性而沒有副作用。因此，如果槲寄生經口服途徑遞送可行，它就能夠廣泛應用於治療和預防癌症。據報導，如果凝集素的口服遞送劑量比皮下注射劑量(0.05mg-3mg/kg體重)多10到1000倍，凝集素就會牢固地和派伊爾結(Peyer’s patch)的M-細胞結合，抑制腫瘤細胞的生長，促進細胞因子TNF-α，IL-1β等的分泌(Pusztai et al.，J.Nutr.Biochem.931-36，1998)。但是，考慮到凝集素在消化系統中會分解，服用高劑量的凝集素是不合算的，而且，沒有在腸中消化的其他化合物可能會產生副作用。也就是說，即使槲寄生提取物能被廣泛用於抗癌治療和預防，它也只能開發成注射劑而不能廣泛使用。
口服給藥是廣泛應用於製藥領域的，藥物必須穿過屏障到達血液循環才能發揮它的療效。口服遞送的藥物向下進入食道、腸並溶解和釋放藥物。人類的消化系統長達數米，需很長時間才能通過。當通過消化系統時，消化道的pH從酸性到中性再到弱鹼性變化，這一pH變化使得藥物暴露在各種酶和腸道內容物下。同時，藥物溶解成分子後，通過消化道黏膜被吸收。絕大多數藥物通過胃腸繫膜靜脈到達肝臟，並發生首過效應。因此，因為在腸道內的不穩定性或透過黏膜的低滲透率，使得它很難被開發成口服藥物。特別是，口服遞送時，蛋白質或肽類(如胰島素、幹擾素)和糖蛋白(如凝集素)將被消化成胺基酸或小肽。小腸上皮內的肽在氨基肽酶作用下被快速溶解成胺基酸，並被吸收進入血液循環。因此，藥物通過口服給藥時療效將降低。
在這種情況下，我們可以提高藥物在腸道中的穩定性以改善吸收。首先，藥物需要不被胃酸溶解。所以，通過藥物膠囊化(encapsulating medicines)開發了腸溶包衣藥物以避免胃酸或胃蛋白酶介導的分解。腸溶包衣藥物(片劑或顆粒劑)在酸性或中性pH條件下不會溶化，但當其到達腸道時，由於鹼性腸液的作用會產生溶化作用而選擇性地釋放藥物。此外，為了解決分解問題，有人嘗試了利用蛋白酶抑制劑(例如，抑肽酶、大豆胰蛋白酶抑制劑、苯丁抑制素等)的系統(Drug Delivery Rev.，4171，1990)。
一般來說，那些存在於細胞間隙中的小分子化合物(分子量小於5000)能夠通過毛細血管到達循環系統。相反，大分子化合物、微粒及形成較大乳糜微粒的物質由於它們的親脂性太強而不能通過毛細管，以致它們通過黏膜到達淋巴管和體內。在腸黏膜中，雖然有少量含M(微皺褶)-細胞的派伊爾結和淋巴系統，但是，淋巴流是血液的1/200-1/500，因此藥物很難吸收到淋巴管中。特殊化合物(如維生素A)、脂質(如膽固醇)、維生素B12及其衍生物、含凝集素的化合物、脂質體及超微粒(直徑小於10μm)等不能經由M-細胞到達淋巴管但可直接進入血管中。因此，如果我們能使這些化合物具有腸壁通透性，它們就可以用做淋巴管載體。
如果藥物能被吸收入淋巴系統，藥物將通過腸淋巴管和胸淋巴管進入血管而避免首先經過肝臟。所以，如果我們使凝集素具有黏膜通透性，凝集素會經由派伊爾結中的M-細胞並通過淋巴管直接進入血管而不經過肝臟，畢竟，凝集素是作為淋巴管載體使用。尤其是，淋巴系統是癌轉移或細菌感染的通道，所以淋巴結可能是引發疾病的原因。因此，凝集素可以用於選擇性遞送抗癌療法或抗生素到淋巴結來達到治療或診斷目的。
藥物要便於使用，製備工藝要特別適宜藥效的發揮。藥物服用後被釋放，再通過吸收，分布，代謝，排洩發揮治療作用。為了使藥物更穩定和更有效地得到利用，我們需要能控制藥物的作用的技術。藥物遞送系統(DDS)的目的是減少副作用和使所需藥量達到最大化的遞送效果。控釋系統有口服給藥的膠囊、基質型(matrixstyle)、口服或注射給藥的微囊、微球、微粒、納米粒、脂質體和植入體等。
根據製備的形狀和大小，微囊可以用很多詞來定義。即，微囊是球形微粒，其具有置於中部核內的固態或液態藥物；而微球是一種多核的微囊，其包含分散的固態或液態藥物。此外，微粒包括微囊和微球，並且是一種粒子型的藥物載體，其攜帶高分子量的基質或脂質顆粒。其中，某些具有小於1μm的直徑，其被稱作納米球(或納米粒)。在下文中，除非不同地使用這些詞，否則它們具有如上所述的含義。
脂質體具有與細胞膜相似的結構，所以脂質體可用於藥物遞送系統而發揮功能。脂質體包括可在體內溶解並且沒有細胞毒性的磷脂，由於脂質體的兩親性質，它既可以捕獲親水性藥物又可以捕獲疏水性藥物。它還可以把藥物捕獲到脂質體內部以防止藥物失活、提高肽類藥物的利用率、攜帶任何類型的藥物到幾乎任何一種的遞送通道和靶向特異性組織，以便促進醫藥治療。根據結構不同，脂質體可分為多層囊泡(MLV)(其包括含許多褶皺的雙層)和由單層組成的單層囊泡。根據大小不同，該單層囊泡可分為小單層囊泡(SUV)、大單層囊泡(LUV)及其他單層囊泡。SUV的大小是20-50nm，而LUV的大小是100-1000nm。
固-液納米微粒(SLN)是為利用疏水性藥物而開發的納米微粒口服遞送系統。與高分子顆粒或脂質體相比較，它增強了捕獲藥物的化學穩定性、控制了藥物的釋放、並抑制了顆粒之間的聚集。
微囊化是這樣的一種技術，該技術把微小的固態或液態顆粒用各種包衣材料包封起來或製備其內大小為0.1μm到幾百μm的混合型。也就是說，微囊是一種顆粒，其經特殊反應或處理而製得，以便封裝藥物、包衣材料、添加劑和溶劑。所以從微觀角度講，我們可以封裝固體、液體、氣體。
在蛋白質的微囊化過程中，蛋白質會受到過度的應力。蛋白質是大分子量物質而且其活性和物理性質依賴於其三維結構，因而蛋白質比其它化學合成藥物更易於變性。所以，蛋白質藥物的微囊製備工藝過程必須避免過熱、剪切應力、pH值的極端變化、有機溶劑、冷凍、乾燥。此外，在儲存過程中，微囊化的蛋白質能被水合而容易導致聚集、變性和失活。因此，必須使用可生物降解的聚合物且必須阻斷變性作用，同時在製備含蛋白質或肽的微囊時，必須有足夠高的包封效率。此外，必需有可行的簡單製備工藝、儘量少使用有機溶劑和有大規模的生產。
微囊化技術是多樣的，核心物質和最終顆粒的大小依賴於工藝過程。該工藝過程中使用的物質是各種合成的和天然的高分子化合物。同時，使用在人體內會分解的高分子材料如白蛋白、明膠、膠原、纖維蛋白原、藻酸鹽、澱粉、多聚胺基酸、聚交酯(PLA)、聚乙交酯(PGA)、聚β-羥基丁酸(PHB)、聚己酸內酯、聚酐類、聚原酸酯、及其混合物PLGA。而且，製備方法有空氣懸浮法、相分離法、空氣噴霧法、孔/離心法、超臨界流體技術、鍋包法、溶劑蒸發法、噴霧乾燥法和凝聚法、表面聚合法、熔融冷卻法。
複合乳化劑揮發法是把高分子溶劑溶解在易揮發的有機溶劑(OS)中，而把藥物溶解在蒸餾水或緩衝溶液(內水相IWP)中而沒有與水混合。在乳化有機溶劑中的IWP並製成初級乳劑(primary emulsion)(W/O)以後，將初級乳劑倒入含乳化劑的外水相(OWP)，然後攪拌製成二級乳劑(secondary emulsion)(W/O/W)。持續攪拌該複合乳劑並揮發有機溶劑以誘導高分子物質的沉澱，然後形成載藥的微粒。OWP中的乳化劑在球狀微粒形成過程中起了重要作用。這是為了防止在有機溶劑揮發時顆粒之間聚結。一般使用聚乙烯醇(PVA)做乳化劑，但聚乙烯吡咯烷酮、藻酸鹽、甲基纖維素、明膠也能用作乳化劑。有機溶劑能在常壓或減壓條件下去除。
最常用的藥物遞送方法是口服給藥。然而，口服給藥的困難之處在於藥物在腸道中消化或藥物對黏膜的低滲透性使得口服給藥有不穩定性。例如，胰島素、幹擾素和其他蛋白質或肽類、糖蛋白(如凝集素)會被消化成胺基酸或小肽。可以說，口服遞送的藥物在通過消化系統時會溶解和釋放藥物，這是因為當口服遞送的藥物通過消化系統時，消化道的pH從酸性到中性再到鹼性變化，同時口服遞送的藥物也會接觸到各種酶。進入小腸上皮細胞的肽在氨基肽酶作用下會分解成胺基酸，並通過胺基酸載體吸收進入血液循環。因此，蛋白質會損失其功能。
因此，凝集素的天然物質儘管可以用於醫藥治療但不能廣泛使用口服遞送。在這種情況下，我們能夠通過增加藥物在消化系統中的穩定性來增加吸收。為了提高藥物的穩定性和吸收，開發了各種腸溶包衣藥物以阻止藥物在胃裡的分解和避免藥物接觸酸和胃蛋白酶有關的蛋白質。腸溶包衣藥物(片劑或顆粒劑)可以耐受胃中的低pH，然後在腸中由於較高pH而溶化從而選擇性地釋放藥物。腸溶包衣不僅能夠應用於片劑而且能用於顆粒劑，並且包衣厚度可以調控。蟲膠、羥丙基甲基纖維素酯、聚鄰苯二甲酸乙烯基醋酸酯、鄰苯二甲酸醋酸纖維素、玉米醇溶蛋白、EudragitL100、S100、藻酸鹽、明膠、澱粉和其他物質單獨使用或混合使用作為腸溶包衣物質。對於包衣物質有很多方法，如使用扇形包衣裝置(fan coatingapparatus)、流化床包衣機、旋轉噴霧包衣(spraying to make a coataround)、使用靜電的粉末包衣技術、幹法包衣、熱熔包衣等，並且這些方法可以單獨使用或一起使用。
因此，本發明提供了製備含有很難口服給藥的槲寄生提取物和凝集素的片劑和顆粒劑的方法，以及通過在低溫條件下利用包衣工具和增塑劑將片劑或顆粒劑包衣從而製備腸溶包衣藥物的方法。此外，本發明提供了在製備含凝集素的微囊後製備雙層腸溶微囊的方法。


圖1是藻酸-鹽雙層微囊的表面結構圖。
圖2示出了含凝集素的槲寄生提取物從藻酸雙層微囊中的洗脫率。
發明詳述技術問題本發明的目的是製備一種用於含凝集素的槲寄生提取物的腸溶包衣藥物的有效組合物和一種用於以凝集素為主要成分的腸溶包衣微囊的有效組合物。
技術方案通過製備一種用於含凝集素的槲寄生提取物的腸溶包衣藥物的有效組合物和製備一種用於以凝集素為主要成分的腸溶包衣微囊的有效組合物來完成本發明。
用於含凝集素的槲寄生提取物的腸溶包衣藥物的輔料包括甘露醇115g作為賦形劑、Avicel PH 10118g、磷酸氫鈣17g、羥丙基甲基纖維素20g作為粘合劑溶液、水100mL、乙醇100mL、Zein-DP 25g作為包衣液、蟲膠35g、80％乙醇180mL。
另外，以凝集素為主要成分的腸溶包衣微囊包括PLGA/CH2Cl24mL、1％聚乙烯醇50mL、司盤802mL作為表面活性劑、食用油48mL、1-4％藻酸鈉溶液8mL、0.02-0.2M CaCl2溶液60mL。
含凝集素的槲寄生提取物的腸溶包衣是使用特殊的包衣材料製成，如蟲膠、羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯(HPMCP，Pharmacoat 606，Pharmacoat 645)、聚醋酸乙烯鄰苯二甲酸酯、鄰苯二甲酸醋酸纖維素、玉米醇溶蛋白、Eudragit L100、Eudragit S100、藻酸鹽、明膠、澱粉等包衣材料，這些材料可以單獨使用或混合使用。有很多方法進行包衣，如使用扇形包衣裝置、流化床包衣機、噴霧包衣、幹法包衣、熱熔包衣和其他包衣方法，並且這些方法可以單獨使用或一起使用。
理想地含凝集素的槲寄生提取物佔整個包衣顆粒總重量的1-95％。通過將包衣試劑和增塑劑溶解在適宜的溶劑中來製成包衣液。在此過程中使用的包衣試劑有甲基丙烯酸共聚物Eudragit(註冊商標)E-100、Eudragit L3D(RohmHass公司，德國)、玉米蛋白提取物(Zein-DP)和利用這些物質產生的人工加工材料如藻酸鈉、藻酸、蟲膠、羧乙烯基聚合物(卡波姆(註冊商標))、羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯、醋酸羥丙基甲基纖維素琥珀酸酯、醋酸羥丙基甲基琥珀酸酯、羧甲基纖維素、鄰苯二甲酸醋酸纖維素、羥丙基纖維素、乙基纖維素、甲基纖維素、聚醋酸乙烯鄰苯二甲酸酯、大豆蛋白、小麥蛋白、利用大豆或小麥蛋白加工成的材料、殼多糖、殼多糖酸、利用殼多糖或殼多糖酸加工成的材料、明膠、角叉菜膠、果膠、瓜爾豆膠、刺槐豆膠、黃原膠、結冷膠、阿拉伯樹膠、Kollicoat MAE 30DP(BASF公司)、有6-12碳原子的中鏈甘油三酯，這些包衣材料可以單獨使用或混合使用。理想地包衣試劑佔整個包衣顆粒總重量的1-50％。
本發明中使用的增塑劑有聚乙二醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸山梨坦酯、丙二醇、丙三醇、檸檬酸三乙酯、甘油三乙酸酯、十六醇、十八醇，這些增塑劑可以單獨或混合使用，增塑劑的較佳用量是重量為0.5-50％。如果上述包衣試劑和增塑劑超出規定的範圍，那麼包衣顆粒的溶解性降低從而產生不穩定的包衣和藥物延遲效應。
本發明中使用的溶劑有水、乙醇、醇類(甲醇，異丙醇)、丙酮、乙腈、二氯甲烷、醚、核苷酸、氯仿、1，4-二氧六環、四氫呋喃、二甲亞碸、乙酸乙酯、乙酸甲酯，這些溶劑可以單獨使用或混合使用。
本發明中使用的賦形劑有澱粉、乳糖、非晶纖維素、輕質無水矽酸、磷酸氫鈣、交聯羧甲基纖維素鈉、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)K-30等，賦形劑的較佳用量是佔包衣顆粒總重量的0.5-90％。
為了製備腸溶包衣藥物，需要使用流化床安裝機、高速混合機、柱形制粒機。需要用到的設備有流化床包衣機、CF-制粒機和尤其用於本發明的流化床包衣機Granule-40(Freund公司，日本)，該流化床包衣機和上述的設備相似，另外，也可使用其他類似的設備。
用於製備腸溶包衣顆粒劑所需要的設備溫度為35-70℃。而且，在每一步製備過程中，儀器內部溫度需保持在25-60℃，因為低於25℃，吸溼的顆粒會聚集在一起，而超過60℃，顆粒不能進行操作或者不能成形而破碎。因為正常溫度和季節有關，所以必須控制溫度，例如，在雨季或冬天，溫度必須設定為稍高，而在夏天溫度必須設定為稍低以便於包衣。
另外，凝集素蛋白的微囊化使用雙乳化法。可以使用可分解的高分子物質，如白蛋白、明膠、膠原、纖維蛋白原、聚交酯(PLA)、聚丙交酯-乙交酯共聚物(PLGA)樣羥基酸(polylactide-co-glycolides(PLGA)-like hydroxy acid)、丙交酯-乙交酯共聚物(polylactide-co-glycolides)(PLGA)、PEG、聚β-羥基丁酸(PHB)、聚己酸內酯、聚酐、多聚原酸酯、聚丙交酯-乙交酯共聚物(polylactide-co-glycolides)(PLGA)、聚氨酯(polyuretan)、聚丁酸酯(polybutylates)、聚戊酸酯(polyvalerylate)、聚丙交酯-己內酯共聚物(polylactide-co-caprolactone)及其衍生物、共聚物或混合物。術語「衍生物」是指通過化學基團如烷基或亞烷基可轉變的高分子化合物。一般來說，可生物降解的高分子化合物可以發生酶催化水解或非酶催化水解，這引起表面或整體溶蝕(bulkerosion)。
凝集素的微囊化利用複合(雙)乳化劑蒸發法，具體描述如下。
將凝集素溶液加入到高分子化合物溶液中(如PLGA/DCM)以製備主乳化液，把主乳化液緩慢地加入乳化劑(如1％的PVA溶液)中，再製成第二乳化液。接著，攪拌以凝固高分子化合物和離心收集顆粒，然後用水洗三遍以獲得微囊。
凝集素控釋製劑可以包括藥用賦形劑、載體或添加劑。並且，它可以被製成吸入給藥型、口服給藥型、注射型、鞏膜(sclerite)-吸收型。而且，利用以往的製劑技術，凝集素控釋製劑可以利用微囊(如晶體/PLGA)加以製備。
並且，通過逆相蒸發(REV)，即對溶入磷脂膽鹼的凝集素溶液給予超聲波(該磷脂膽鹼溶解在醚類溶液和緩衝液中)以蒸發醚類從而製成脂質體。
包含凝集素的雙層腸溶微囊劑是通過使用藻酸-鹽包衣上述微囊或脂質體而製成，其在胃中穩定但在腸中則可以分解。
以下實施例詳細地描述了本發明。然而，以下實施例並不用於限定本發明的範圍，對於本領域的普通技術人員來說，本發明可以有各種更改和變化，而這種更改和變化均應包含在本發明的技術和權利要求範圍之內。
而且，下述的實施例僅描述了本發明而不是限定權利要求的範圍。
有益效果本發明的目的是製備一種用於含凝集素的槲寄生提取物的腸溶包衣藥物的有效組合物和製備一種用於以凝集素為主要成分的腸溶包衣微囊劑的有效組合物。本發明解決了口服給藥後藥物在消化系統中的不穩定問題，並且本發明提高了藥物效力、醫藥治療效果，從而對醫藥工業做出了貢獻。
本發明的最佳實施方式實施例1含凝集素的槲寄生的粉末提取物、水提取物、水提取物粉末的製備。
凝集素可以從多種植物中提取，例如山茱萸科、月見草、菜豆、豆類、麥冬、芍藥科、血根(sangryuk)、番木瓜科、酸漿屬、土當歸(todangui)、常春藤屬、藜科、蘆根(guallugun)、日本蘑菇(shitake mushroom)、半夏、黃楊樹、金合歡屬以及各種來自海洋的天然物質如海星和泥魚，提取方法和槲寄生提取方法相似，但本發明中使用了槲寄生，下文將對槲寄生的提取進行描述。
將槲寄生的苗分成葉、果實和莖，用蒸餾水清洗後，凍幹或在低於35℃條件下在通風良好的地方乾燥。再在低於35℃條件下用輥式破碎機、球磨機和其他碾磨機或研磨機製成(槲寄生)粉末。此外，新鮮的槲寄生用相同的方法通過液氮冷凍。按照它們的用途控制顆粒的大小。經確認1mg的該粉末含有92ng的凝集素(VCA)。
使用本發明人開發的方法(韓國專利申請第2000-83383號和第2001-0061118號)製備了提取物。清洗葉、果實和莖的每個部分，並存儲在-70℃條件下。加入該材料10倍量的水，同時在4℃研磨混合24小時。用過濾網過濾，然後12,000rpm離心30分鐘，再用尺寸為20μm，0.45μm和0.22μm的膜過濾器過濾上清液以除去微生物，然後加入已滅菌的PBS緩衝液來調節該溶液濃度到100mg/mL。100mg/mL是指1mL溶液中有100mg槲寄生提取物，當用ELLA(酶聯凝集素分析儀)進行定量分析時，濃度為1mg/mL的VCE液1mL中，有30ng的凝集素(VCE)。此外，用上述濾膜過濾的溶液被凍幹成棕色粉末。
韓國槲寄生(Viscum album L.var.coloratum)凝集素(VCA)提取物是按照上述方法(韓國專利申請第2000-83383號和第2001-0061118號)加以製備並使用脫唾液酸胎球蛋白-瓊脂糖加以純化，然後用BCA方法測定濃度，用血細胞的凝集反應來測定凝集素的活性。
實施例2顆粒形成過程實施例2-1
種子顆粒(seed granule)是以纖維素∶澱粉∶糖∶明膠＝30∶30∶30∶10的比率製成，藉助韋林攪拌器將該種子顆粒和槲寄生提取物或上述的凝集素溶液進行混合。潮溼的結塊在4℃下真空乾燥，並被研磨成碎塊以便形成大小合適的顆粒，隨後過篩，存儲在真空4℃條件下。
實施例2-2
來自實施例1，作為粉末或水提取粉末的凝集素150g、作為賦形劑的甘露醇115g、Avicel PH 101，18g、磷酸氫鈣17g混合，並懸浮於流化床包衣機內，對其噴霧粘合溶液(丙基甲基纖維素20g，水100mL和乙醇100mL)以製備用於包衣的種子顆粒。所用的賦形劑可是甘露醇、澱粉、乳糖、和水或葡萄糖及PV K-30、微晶纖維素和水或乳糖、甘露醇、交聯羧甲基纖維素鈉、羥丙基纖維素和70％乙醇或澱粉、乳糖、藻酸鈉和水或以適宜比例混合的甘露醇和白糖。槲寄生和賦形劑在包衣機內必須保持在25～50℃。進入的空氣和通風溫度為35-70℃，轉子轉速為100-350rpm。
實施例3腸溶包衣過程實施例3-1腸溶顆粒包衣過程來自實施例2所制的顆粒作為種子並懸浮於流化床包衣機內，然後噴霧包衣溶液(Zein-DP 25g，蟲膠35g，80％乙醇180mL)以進行包衣。包衣機內材料溫度控制在25-60℃，進入的空氣和通風溫度在35-70℃，轉子轉速為100-350rpm。
在包衣過程中使用的包衣試劑有甲基丙烯酸共聚物Eudragit(註冊商標)E-100、Eudragit L3D(RohmHass公司，德國)、玉米蛋白提取物(Zein-DP)和利用這些物質產生的人工加工材料如藻酸鈉、藻酸、蟲膠、羧乙烯基聚合物(卡波姆(註冊商標))、羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯、醋酸羥丙基甲基纖維素琥珀酸酯、醋酸羥丙基甲基琥珀酸酯、羧甲基纖維素、鄰苯二甲酸醋酸纖維素、羥丙基纖維素、乙基纖維素、甲基纖維素、聚鄰苯二甲基醋酸乙烯酯、大豆蛋白、小麥蛋白、利用大豆或小麥蛋白加工成的材料、殼多糖、殼多糖酸、利用殼多糖或殼多糖酸加工成的材料、明膠、角叉菜膠、果膠、瓜爾豆膠、刺槐豆膠、黃原膠、結冷膠、阿拉伯樹膠、Kollicoat MAE 30DP(BASF公司)、有6-12碳原子的中鏈甘油三酯，這些包衣材料可以單獨使用或混合使用。包衣試劑佔整個包衣顆粒總重量的1-50％較好。
單層(primary)包衣顆粒是使用上述組合物之一來製備，雙層包衣顆粒則使用另一種包衣溶液來製備。
實施例3-2腸溶片劑包衣過程植物乾粉或植物提取粉和凝集素乾粉以及賦形劑粉末以適當的比例通過48目篩，加入潤滑劑硬脂酸鎂5mg，混合均勻後壓製成片劑。對於賦形劑，各種羥丙基甲基纖維素(HPMC)衍生物和EC、MC等被用於幹法、直接壓制工藝。
在包衣過程中使用的包衣試劑有甲基丙烯酸共聚物Eudragit(註冊商標)E-100、Eudragit L3D(RohmHass公司，德國)、玉米蛋白提取物(Zein-DP)和利用這些物質產生的人工加工材料如藻酸鈉、藻酸、蟲膠、羧乙烯基聚合物(卡波姆(註冊商標))、羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯、醋酸羥丙基甲基纖維素琥珀酸酯、醋酸羥丙基甲基琥珀酸酯、羧甲基纖維素、鄰苯二甲酸醋酸纖維素、羥丙基纖維素、乙基纖維素、甲基纖維素、聚醋酸乙烯鄰苯二甲基酯、大豆蛋白、小麥蛋白、利用大豆或小麥蛋白加工成的材料、殼多糖、殼多糖酸、利用殼多糖或殼多糖酸加工成的材料、明膠、角叉菜膠、果膠、瓜爾豆膠、刺槐豆膠、黃原膠、結冷膠、阿拉伯樹膠、Kollicoat MAE 30DP(BASF公司)、有6-12碳原子的中鏈甘油三酯，這些包衣試劑可以單獨使用或混合使用。該包衣試劑佔整個包衣片劑總重量的1-50％較好。
單層包衣顆粒是使用上述組合物之一來製備，雙層包衣顆粒則使用另一種包衣溶液來製備。
實施例4含凝集素的腸溶包衣微囊的製備過程實施例4-1使用雙乳化溶劑蒸發法進行微囊化將1N含凝集素溶液的乙酸溶液注入到4mL PLGA/CH2Cl2中，然後使用組織粉碎機將初級乳化溶液(primary emulsion solution)緩慢注入到50mL 1％的聚乙烯醇溶液中以製成二級乳化溶劑(secondary emulsion solvent)。混合三小時並除去CH2Cl2後，2300rpm離心5分鐘，並去除上清液。然後用水洗3遍以得到微囊。
實施例4-2脂質體過程將適量濃度的凝集素3mL加入到磷脂膽鹼(PC)/二乙醚溶液中，然後用超聲波發生器勻化混合物直至成為單相。通入氮氣以完全去除二乙醚，並且沒有包入脂質體的物質用Sephadex G-25柱去除。用2mL磷酸緩衝液稀釋離心的脂質體沉澱物，然後加入TritonX-100以破壞脂質體。測得凝集素的捕獲效率為68％。
實施例4-3藻酸鹽雙層微囊過程將表面活性劑司盤802mL和食用油48mL混合，再與8mL藻酸鈉溶液和來自實施例4-1的微囊或來自實施例4-2的稀釋在0.15M的NaCl溶液中的脂質體混合。當兩層被乳化時，平穩快速地加入60mL CaCl2溶液(0.02-0.2M)，直至水/油乳劑被擾亂然後混合30分鐘，將其照現在這樣放置。當藻酸鹽雙層微囊形成後，離心並去除上清液。沉澱的微囊用水和丙酮重複清洗，然後在室溫下乾燥。將乾燥的藻酸鹽雙層微囊0.05g加入10mL磷酸緩衝液(pH7.4)中，並在37℃條件下混合。過濾後凝集素的捕獲效率為59％。
實驗實施例1槲寄生腸溶包衣顆粒的粒度分布。
按照實施例2的顆粒形成過程，混合含凝集素的槲寄生粉或水提取粉末150g，Avicel PH101 18g和磷酸氫鈣17g，然後噴霧粘合溶液(羥丙基甲基纖維素20g，水100mL和乙醇100mL)以製成顆粒，其作為種子懸浮於流化床包衣機內，接著噴霧包衣溶液1(Zein-DP 25g，蟲膠35g，80％乙醇180mL)以測量包衣顆粒1的粒度分布。此外，單層包衣顆粒用包衣溶液2(Eudragit L30 165mL，水30mL，三乙基乙酸5g)進行包衣，以測量包衣顆粒2的粒度分布，而測量結果表明80％以上的包衣顆粒均勻分布在30-40目範圍內(表1)。
表1槲寄生腸溶包衣槲寄生顆粒的粒度分布(％)

實驗實施例2腸溶包衣顆粒和片劑在人工胃液和人工腸液中的洗脫率測量了來自實驗實施例1的腸溶包衣顆粒1和2以及按照實施例3-2製備的槲寄生腸溶包衣片劑在人工胃酸和人工腸酸中的洗脫率。按照韓國藥典第七次修訂本第一溶出實驗，並利用旋轉樣品管法，每15分鐘取樣一次達1小時，然後每30分鐘取樣一次，對試樣進行分析。換言之，將包衣顆粒1和2各自放入100mL人工胃液(pH 1.2，NaCl-HCl緩衝液)和人工腸液(pH 6.8，磷酸緩衝液)中，並37℃、100rpm轉速攪拌，以在固定時間內用BCA法測量經過濾的凝集素的濃度。在水中測量洗脫率不需要混合，所以材料放置在水中一定時間後取出測定。結果見圖2。在腸溶包衣顆粒1和2的情況下，它們在人工胃液中沒有流出，但在人工腸液中它們在30分鐘內就會流出。此外為了在水中洗脫50％，需要1周以上的時間。因此，包衣顆粒可以應用於糖漿、汁液、飲料、乳、乳酪等。在腸溶包衣片劑的情況下，在人工胃酸中需要5.5小時以洗脫50％，而在人工腸液中則需要1小時以洗脫50％。
實驗實施例3藻酸鹽雙層微囊的表面結構和粒度分布使用光散射粒子分析測定按照實施例4-3所製備的含凝集素的藻酸鹽雙層微囊，當CaCl2和藻酸鈉的濃度減小時平均顆粒大小也減小(表2)。
由4％的藻酸鈉溶液和0.2M的CaCl2製備而成的藻酸鈉雙層微囊在室溫下完全乾躁後，用掃描SEM觀察，微囊顆粒呈球形(圖1)。
表2含凝集素的藻酸鹽雙層微囊的顆粒大小

實驗實施例4洗脫自藻酸鹽雙層微囊的凝集素在人工胃液和人工腸液中測量了來自實施例4-3的含凝集素的藻酸鹽雙層微囊的洗脫率。按照韓國藥典第七次修訂本第一溶出實驗，並利用旋轉樣品管法，每30分鐘對試樣進行分析。即將藻酸鹽雙層微囊1g分別放入100mL含有蛋白酶和脂酶的人工胃液(pH1.4，NaCl-HCl緩衝液)和人工腸液(pH7.4，磷酸緩衝液)中，37℃下50rpm混合。接著，在固定時間內對其進行過濾，並加入TritonX-100以破壞脂質體並用BCA法測量凝集素。凝集素從藻酸鹽雙層微囊中的洗脫率在人工胃液中6小時後是31％，而在人工腸液中6小時後是85％。
實驗實施例5腸溶包衣藥物體外對癌細胞的抗癌活性將來自實驗實施例2的槲寄生腸溶包衣顆粒的洗脫液和來自實驗實施例4的藻酸鹽雙層微囊的洗脫液在人工腸液中處理六小時，然後通過MTT分析法分析其抗癌活性。包衣顆粒的樣品濃度被換算成在製備該顆粒時所使用的槲寄生重量，而藻酸鹽雙層微囊的樣品濃度被換算成在製備脂質體時所用的凝集素的量。
癌細胞培養在96孔板上，加入各種濃度的樣品，48小時後，使用MTT法檢測細胞的生長情況以得到IC50(抑制濃度)，其是殺死50％癌細胞時的樣品濃度值。
根據如表3所示的結果，在腸溶包衣顆粒的情況下，在包衣過程後IC50值會增加，這意味著在包衣過程或洗脫期間它可能會有一點活性損失，然而腸溶包衣顆粒顯示出對口腔癌、咽癌、子宮頸癌、胃癌、肝癌、乳癌、骨髓性白血病等都有抗癌活性，這值得我們注意。同樣，在藻酸鹽雙層微囊的情況下，IC50值類似地增加，所以在製備或洗脫過程中可能有一定的活性損失，但藻酸鹽雙層微囊對癌細胞有顯著的抗癌活性。
表3樣品對各種癌細胞的細胞毒性(IC50)


權利要求
1.一種用於含凝集素的天然產物的腸溶包衣的組合物，其包括甘露醇115g作為賦形劑，Avicel PH 101 18g，磷酸氫鈣17g，羥丙基甲基纖維素20g作為粘合劑溶液，水100mL，乙醇100mL，Zein-DP 25g作為包衣溶液，蟲膠35g和80％的乙醇180mL。
2.根據權利要求1所述的組合物，其中所述賦形劑包括甘露醇、澱粉、乳糖和水或葡萄糖和PV K-30，微晶纖維素和水或乳糖、甘露醇、交聯羧甲基纖維素鈉、羥丙基纖維素和70％乙醇，或澱粉、乳糖、藻酸鈉和水或甘露醇和白糖。
3.根據權利要求1所述的組合物，其中包衣溶液由包衣材料組成，所述包衣材料可以單獨使用或聯合使用，並且所述包衣材料利用玉米蛋白提取物和其人工加工材料、大豆蛋白、小麥蛋白和其人工加工材料及其衍生物、甲基丙烯酸共聚物、羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯(HPMCP)、醋酸羥丙基甲基纖維素琥珀酸酯(HPMCAS)、鄰苯二甲酸醋酸纖維素、聚醋酸乙烯鄰苯二甲酸酯、藻酸鹽、蟲膠、羧乙烯基聚合物、羧甲基纖維素、羥丙基纖維素、乙基纖維素、甲基纖維素、殼多糖、殼多糖酸、利用殼多糖或殼多糖酸加工成的材料、明膠、角叉菜膠、果膠、瓜爾豆膠、刺槐豆膠、黃原膠、結冷膠、阿拉伯樹膠、Kollicoat MAE 30 DP、有6-12碳原子的中鏈甘油三酯。
4.根據權利要求1所述的組合物，其中含凝集素的天然產物是槲寄生。
5.一種用於含凝集素的腸溶包衣微囊的組合物，其包括PLGA/CH2Cl24mL、1％聚乙烯醇50mL、司盤80 2mL作為表面活性劑、食用油48mL、1-4％的藻酸鈉溶液8mL和0.02-0.2M的CaCl2溶液60mL。
全文摘要
本發明通過製備一種用於含凝集素的槲寄生提取物的腸溶包衣藥物的有效組合物和通過製備一種用於以凝集素為主要成分的腸溶包衣微囊的有效組合物而完成。本發明解決了口服給藥在消化系統中的不穩定性問題，並且提高了藥物療效、藥物治療效果、有助於醫藥工業。
文檔編號A61K36/185GK1805735SQ200480016142
公開日2006年7月19日 申請日期2004年3月19日 優先權日2003年6月12日
發明者樸源琫, 柳秀妍 申請人:樸源琫, 柳秀妍