系列低分子魚精蛋白模擬肽及其應用的製作方法

2023-06-06 07:53:56

系列低分子魚精蛋白模擬肽及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及人為設計並通過人工合成的方式製備的系列魚精蛋白模擬肽，該系列多肽分子特徵是由9-20個鹼性胺基酸組成，通過人工合成的方式製備成為直鏈多肽分子。本發明闡明的系列多肽分子具有替代魚精蛋白拮抗肝素的抗凝血作用從而引起血漿凝集，本發明可應用在臨床及生物醫藥領域用於取代魚精蛋白對肝素的拮抗作用。
【專利說明】系列低分子魚精蛋白模擬肽及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及人為設計並通過人工合成的方式製備含有胺基酸組成的直鏈多肽分子，其組成包含9至20個鹼性胺基酸主要由精氨酸(Arg或R)組成的多肽分子。本發明闡述的多肽分子具有替代魚精蛋白在血液中對肝素的中和與拮抗作用，可用於臨床上消除或中和血液中肝素的作用從而引起血漿凝集，本發明屬於生物醫藥領域。
技術背景
[0002]生物體的遺傳基因被存儲在多聚核苷酸鏈上，遺傳基因編碼著執行生物學功能的蛋白質。生物體內的蛋白質多種多樣，它們行使著各種生物學功能維持生命活動。蛋白質的種類雖然多不勝舉，但它們基本上都是由20個自然界存在的天然胺基酸組成。由於胺基酸的組成和排列順序的差異導致了蛋白質的千差萬別。一般來說，含有50個以上胺基酸的分子被稱為蛋白質，般超過10個胺基酸的肽鏈被稱為多肽，少於10個胺基酸的肽鏈被稱做寡肽。目前發現最小的功能小肽只有2個胺基酸。
[0003]由於人類基因組計劃的完成和人類蛋白組計劃的開展，已有越來越多的蛋白質功能片段被發現並被作為藥物應用到生物醫藥領域中來。現已在臨床上得到應用的多肽藥物有「催產素」、「胸腺肽α 1」、「胸腺五肽」等，有在天然肽鏈的基礎上進行人工改構製備成為用於治療消化道出血和肢端肥大症的多肽藥物「奧曲肽」和抗凝血作用的「水蛭肽」等。蛋白質中的功能片段常常能篩選到含有幾十個或小到只有二個胺基酸組成的多肽片段，它們為人工合成多肽功能片段並將它們投入應用奠定了基礎。
[0004]1963年美國洛克菲勒大學的Robert Bruce Merrifield教授建立了固相多肽合成法，這是一種革命性的有機固相合成法，它可快捷，簡便高效的合成多肽，在此基礎上為多肽機械自動化合成奠定了基礎並在60年代末年世界上首次出現多肽自動合成儀的雛形，隨著技術進步及對多肽研究的需求，多肽合成儀的種類從合成量上分，可分為微克級、毫克級、克級和公斤級；從功能上分，可分為研究型、小試型、中試型、普通生產型和GMP生產型；從自動化程度上分，可分為全自動、半自動和手動型；從通道上分，可分為單通道的和多通道合成儀。R.Merrifield教授因此獲得1984年諾貝爾化學獎。
[0005]如今多肽合成已成為一種商業化技術服務項目，可按照客戶的需求進行多肽合成及多肽修飾等服務。

【發明內容】

[0006]心血管疾病患者在實施心外循環或支架介入的手術之前需向血管中注射抗凝藥肝素，以避免在手術過程中產生血栓。但在手術完成後需要及時消除血管中的肝素避免發生流血不止的惡性事件。目前臨床上用於拮抗肝素的唯一藥物是魚精蛋白，到目前為止還未有其它可拮抗肝素的魚精蛋白替代藥物出現。 [0007]使用魚精蛋白的缺點或弊端:
[0008]1.魚精蛋白是從鮭魚、鱒魚、鯡魚的成熟精子的細胞核中提取的蛋白，它包含的是一類蛋白分子群，其分子量在8000道爾頓以下，主要分子區間在4000-6000道爾頓範圍，因此嚴格地說魚精蛋白不是單一分子的純蛋白製品；
[0009]2.由於魚精蛋白成品是非均一態的分子群，因此其拮抗肝素的作用量隨製備魚精蛋白的批次不同而不同，其質量難以達到均一性及一致性；
[0010]3.魚精蛋白是從魚的成熟精子中提取，從生產原料的資源角度限制並制約了魚精蛋白的出產。
[0011]4.魚精蛋白是外源大分子蛋白，人體會對其產生過敏反應，尤其對再次使用魚精蛋白的病人可能會造成重大醫療事故，存在臨床使用的風險。
[0012]鑑於以上問題，本發明闡述通過人為設計並人工合成的方式製備可取代魚精蛋白的多肽分子(魚精蛋白模擬肽)，使得魚精蛋白模擬肽具有以下優勢可取代魚精蛋白在臨床上的應用:
[0013]1.本發明闡述的魚精蛋白模擬肽是人為設計的多肽分子，是由單純天然鹼性胺基酸組成的多肽分子，具有明確的胺基酸組成及分子序列；
[0014]2.魚精蛋白模擬肽通過人工合成的方式在短時間、大批量、高純度地製備完成，不僅擺脫了使用天然魚類資源的問題又滿足了臨床大批量需求的需要。
[0015]3.本發明闡述的 魚精蛋白模擬肽的分子量比魚精蛋白小，其分子量在1000-2000之間，分子單一，肽純度可達>99%，達到肽類藥物製備的國際純度標準，降低了臨床使用的致敏率，因此比使用魚精蛋白具有更好的安全性。
[0016]4.由於魚精蛋白模擬肽是由單一分子構成，因此在質量標準的建立及檢測、中和肝素的使用劑量將更加嚴謹和精確。
【具體實施方式】
[0017]為更進一步闡述本發明為達成預定發明目的所採取的技術手段及功效，以下結合實施例對依據本發明提出的對多肽產物的設計方式和具體應用實施方式、特徵及其功效做以下說明。
[0018]1963年美國科學家R.B.Merrifield發明創立了將目的肽的羧基端胺基酸的羧基端(C端)固定在不溶性樹脂上，樹脂上結合的胺基酸的氨基端(N端)與有待連接的胺基酸的羧基端進行縮合反應達到延長肽鏈的固相合成法。多肽合成的順序是從多肽的羧基端(C端)開始逐個胺基酸縮合連接向肽段的氨基端(N端)方向逐個延伸。當進行胺基酸的羧基接合反應時要將其氨基和側鏈基團保護起來避免發生反應，目前常用的有叔丁氧羰基(Boc)保護法和芴甲氧羰基(Fmoc)保護法，因此每連接上一個胺基酸就要經歷一次以結合在固相載體上的胺基酸作為氨基的脫保護基並同過量的下一個有待連接的胺基酸的活化羧基發生縮合反應延長肽鏈。通過這樣的步驟反覆多次地進行下去，即達到縮合一>洗滌一>去保護一> 中和和洗滌一>下一輪縮合(再接上一個胺基酸)，直至達到所需要合成的肽鏈長度。多肽合成完成後再將合成的多肽產物從固相樹脂上裂解下來，經過高效液相色譜的純化最終得到合成產物。基於以上的原理，多肽合成可以是手工操作合成，也可以採用多肽合成儀經過輸入合成序列和程序自動化合成。
[0019]目前多肽合成的商業服務可根據客戶的特定要求提供合成產物，在此只著重闡述多肽分子的胺基酸序列設計和應用。關於多肽合成的具體細節和原理在此不再累敘，請參見由盛樹力主編，科學技術文獻出版社(1998年)出版的「多肽激素的當代理論和應用」一書。
[0020]實施例1
[0021]試驗目的:
[0022]檢測合成的系列鏈長魚精蛋白模擬肽在體外對血漿中肝素抗凝的拮抗作用。所合成的多肽系列及對肝素的中和作用如下:
[0023]實驗原理:
[0024]本次實驗主要是針對7種小分子魚精蛋白模擬肽拮抗肝素的活性進行實驗。肝素拮抗劑的原理是魚精蛋白所帶正電荷中和與抗凝血酶III(AT-1II)結合的肝素的負電荷，從而把抗凝血酶III(AT-1II)釋放出來，活化II a、IXa、Xa、XIa、XIIa凝血因子，促使凝血激活酶的形成；使凝血酶原變成凝血酶，加速纖維蛋白原變成纖維蛋白。
[0025]實驗材料:
[0026]採用固相合成的方式合成系列多肽如標識所示，系列魚精蛋白拮抗肽(R9、R15、R467、R779、R1081、R1092、R1145)，純度均> 98%，批號20130321，水溶性良好，水溶分裝後
經冷凍乾燥呈白色絮狀物。
[0027]肝素鈉，國藥集團化學試劑有限公司，批號F20110919，比活150U/mg
[0028]硫酸魚精蛋白注射液，生產廠家:北京悅康凱悅製藥有限公司，國藥準字H11020246。09121002，有效期至 2015.09。
[0029]紐西蘭兔2隻，大鼠5隻，購自軍事醫學科學院實驗動物中心。
[0030]新鮮人全血來源於研究室內部，女性成年健康自願者。
[0031]實驗步驟:
[0032]1.準確稱取一定量的肝素鈉0.02571g，加入生理鹽水12.86ml，充分混合均勻，配置肝素鈉的濃度為:2mg/ml ;取肝素拮抗肽(R3、R5、R7、R9、R15和R20)各一瓶，加入生理鹽水，肝素拮抗肽系列化合物的終濃度為lmg/ml。
[0033]2.實驗管中，取50mL EP管4隻，分為2組，分別加入ImL和2mL的2mg/ml的肝素鈉(活性為≥150U/mg)，全血加入EP管刻度，即每毫升全血中肝素的量為6U和12U，混合均勻。另取2ml EP管，每管中加入Iml的全血，設為不含肝素的空白對照。
[0034]3.取上述每管中含肝素6U組EP管，加入系列濃度的不同分子大小的魚精蛋白模擬肽，混合均勻，計時，放入37°C水浴箱中孵育，每間隔10秒傾斜一次EP管，觀察血液是否凝固。記錄血凝時間。
[0035]數據處理:
[0036]記錄肝素抗凝血。加入系列魚精蛋白模擬肽後的凝集時間，並與非肝素抗凝的血漿凝集試驗設為對照凝集時間，計算各凝集試驗的平均值，以加入模擬肽的nmol濃度比上中和IIU肝素作為模擬肽的抗肝素能力指數(抗肝素能力指數=多肽/肝素，nmol/U)。
[0037]實驗結果:
[0038]表1.大鼠肝素化全血中系列魚精蛋白模擬肽體外中和肝素作用試驗結果
[0039]
【權利要求】
1.本發明闡述的系列多肽分子，其特徵為由9-20個鹼性胺基酸組成的直鏈多肽分子，包括由精氨酸(Arg，R)或賴氨酸(Lys，K)或組氨酸(His，H)組成的直鏈多肽分子。
2.本發明闡述的多肽分子包含9至20個鹼性胺基酸的多肽分子，它們可以是由9-20個任意鹼性氨酸組成的多肽分子。
3.本發明闡述的多肽分子包含9至20個鹼性胺基酸的多肽分子，它們可以是由9-20個單純精氨酸組成的多肽分子，可以是其中任意一個精胺基酸被替換為組氨酸(His或H)的多肽分子。
4.本發明闡述的多肽分子包含9至20個鹼性胺基酸的多肽分子，它們可以是由9-20個賴氨酸組成的多肽分子，可以是其中任意一個賴胺基酸被替換為組氨酸(His或H)的多肽分子。
5.本發明闡述的多肽分子包含9至20個鹼性胺基酸的多肽分子，它們可以是由9-20個組氨酸組成的多肽分子。
6.本發明所闡述的系列多肽分子具有替代魚精蛋白在臨床用以中和、消除或拮抗血液中肝素的作用從而引起血漿凝集。
7.本發明所闡述的系列多肽分子在臨床中替代魚精蛋白的作用，用於對肝素的拮抗相關領 域。
【文檔編號】A61P7/04GK103739674SQ201310109830
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年4月1日 優先權日:2013年4月1日
【發明者】竇桂芳, 韓蘇, 孟志雲, 朱曉霞, 甘慧, 顧若蘭, 吳卓娜, 劉桃雲, 李儉 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院野戰輸血研究所, 韓蘇