腸道病毒CoxA16核酸螢光定量RT-PCR檢測試劑盒及檢測方法

2023-06-06 16:20:46 1

專利名稱：：腸道病毒CoxA16核酸螢光定量RT-PCR檢測試劑盒及檢測方法
技術領域：
：本發明涉及一種腸道病毒柯薩奇A16型(CoxA16)核酸焚光定量RT-PCR檢測試劑盒及檢測方法，可應用於手足口病等暴發疫情的實驗室應急;險測。(二)
背景技術：
：手足口病(HandfootmouthdiseaseHFMD)是嬰幼兒常見的傳染病，臨床上以發熱和手、足、口腔等部位出現皮滲、潰瘍等表現為主，個別患者可引起心肌炎、肺水腫、無菌性腦膜腦炎等致命性併發症，手足口病是全球性傳染病，世界大部分地區均有此病流行的報導。手足口病一般是由腸道病毒引起的一種急性傳染病，近年中國手足口病的爆發流行引起了全球的關注，衛生部已將手足口病納入國家丙類法定報告傳染病，通過網絡直報系統對疫情進行監測。由於HFMD是由多種人腸道病毒感染引起，其中以EV71及CoxA16型最為常見，為了對該病迅速查明病因，及時採取控制措施，急需進行實驗室快速診斷，但腸道病毒傳統的檢測方法是病毒分離和中和法定型，繁瑣費時，不適合早期診斷。(三)
發明內容本發明目的是提供一種手足口病感染實驗室應急檢測的腸道病毒CoxAl6型螢光RT-PCR糹企測試劑盒及檢測方法。本發明採用的技術方案是腸道病毒CoxA16核酸螢光定量RT-PCR檢測試劑盒，所述焚光定量RT-PCR檢測試劑盒的上下遊引物和特異性探針序列如下上遊引物CA16YGF:5，-GGGAATTTCTTTAGCCGTGC-3，下遊引物CA16YGR:5，-CCCATCAARTCAATGTCCC-3，特異性^果針COXA16PB:5'-ACAATGCCCACCACGGGTACACA-3，引物CA16YGR序列中，鹼基R為A或G的兼併鹼基，此處為引物的突變位點，就是說該處有些病毒是A,有些是G。而在引物的合成工藝過程中，其合成原理是到這個位點時，原料各加一半也就是加一半A,加一半G。本試劑盒中關鍵組分為引物和探針序列，此外還包括dNTP,MgCl2，RNase抑制劑，AMV逆轉錄酶，Taq酶等，這些組分對於本領域技術人員來說屬於公知常識，可根據需要選用。本發明還涉及一種腸道病毒CoxA16核酸焚光定量RT-PCR檢測方法，所述方法包括(1)根據腸道病毒CoxA16基因序列，設計上下遊引物和特異性探針序列如下CA16YGF:5，-GGGAATTTCTTTAGCCGTGC-3'CA16YGR:5'畫CCCATCAARTCAATGTCCC-3'COXA16PB:5，-ACAATGCCCACCACGGGTACACA-3'引物CA16YGR序列中，鹼基R為A或G的兼併鹼基。(2)提取待測樣品RNA,以待測樣品RNA為模板、在包括步驟(1)所述引物和探針序列的RT-PCR反應體系中進行RT-PCR反應；(3)對RT-PCR反應產物進行焚光檢測，根據螢光檢測的最低Ct值和最高焚光強度判斷結果，若螢光RT-PCR反應呈陽性，則待測樣品含有腸道病毒CoxA16核酸。本發明關鍵在於引物和探針序列的設計，RT-PCR反應體系組成、反r件選擇和反應結果判斷均可按本領域常規方法進行。優選的，所述RT-PCR反應體系終濃度組成如下RT-PCR緩衝液終濃度為lx0.1U/fiL0.1U/^iL各1.60(xM0.80(iMXXng/|uLExTaqHSRTEnzymeMixII上遊與下遊引物探針模板RNADEPC水補足至25juL。所述RT-PCR緩衝液為onestepRT-PCR緩沖液，其終濃度為1x,是指緩沖液各組分在反應體系中的終濃度與1xonestepRT-PCR緩衝液中各組分的濃度相同。通常採用反應體系1/2體積的2xonestepRT-PCR緩衝液。1xonestepRT-PCRbuffer的具體組成參照Takara公司的onestepPrimeScriptRT-PCR(PerfectRealtime)，Code:DRR064A。所述RT-PCR反應條件為42°C30min,95°C2min進行逆轉錄，然後95。C5s,51°C35s,在5rC進行單點焚光檢測，共進行40個循環。所述樣品RNA提取可按常規方法進行，如採用德國QIAGEN公司的RNeasyMiniKit或其它試劑盒，按照試劑盒說明書進行提取。手足口病是由多種人腸道病毒感染引起，其中以EV71及CoxA16型最為常見，對手足口病爆發疫情儘早作出實驗室確診是及時採取防控措施與對診治療的關鍵。腸道病毒檢測傳統的方法是採用細胞培養進行病毒分離，然後用腸道病毒組合血清進行型別鑑定，該方法雖然正確可靠，但繁雜耗時，不適應早期應急診斷。近年來，隨著分子生物學技術的發展，採用RT-PCR技術對腸道病毒進行診斷國內外已有報導，它具有靈敏度高，特異性強，所需時間短等優點，目前已在腸道病毒的核S吏;險測中得到應用，但其岸企測時間仍需6~7h，且容易由於PCR擴增產物汙染而產生假陽性。近幾年發展起來的以特異性螢光探針為特點的螢光定量PCR技術，實行完全閉管式操作，不僅能大大減少擴增產物汙染的機會，而且較常規RT-PCR技術，無論從敏感性，特異性與速度上都更具有優勢，當然它對引物和探針的設計也提出了更高的要求。本申請發明人從美國的NCBI基因庫上下載了近二十年來世界各地的腸道CoxA16毒林，對其進行了同源性比較，在CoxA16的VPl區設計若干對引物與Taqman探針，對該區域進行特異性擴增，從中篩選出最佳的引物和探針，並對螢光RT-PCR方法進行優化，驗證其敏感性、特異性和重複性。經腸道病毒標準抹、CoxA16毒抹與近期手足口病爆發疫情疑似患者臨床樣本的檢測比較，該方法具有高特異性，只能檢出腸道病毒CoxA16型，與其他腸道病毒如柯薩奇A組CoxA4、CoxA16、CoxA21、CoxB5、艾苛病毒E6、E30、EV71、POLIOI型等毒林均無交叉反應，而且比常規RT-PCR法更敏感、快速和簡便。腸道病毒CoxA16的RT-PCR檢測敏感度在l.OTCIDso左右，從病毒核酸提取、RT-PCR反應與電泳，整個過程大約需6~7h左右，而採用本方法從核酸提取至完成檢測，僅需3h左右，能同時完成多個疑似患者臨床樣本的高通量檢測，敏感度達0.1TCID5Q,比普通PCR的靈敏度高IO倍左右，可直接從手足口病患者的腦脊液、糞便、皰滲液等臨床樣本中檢測腸道病毒CoxA16核酸。用建立的新方法，對近期浙江省疑似手足口病爆發疫情疑似患者80份臨床樣本進行實驗室早期快速診斷，獲得了令人滿意的結果，為該病及時採取控制措施發揮了很好的作用。本發明的有益效果主要體現在本發明方法對腸道病毒CoxA16的檢測有高度的特異性，與其他腸道病毒EV71、CoxA4、CoxA21、E6、E30、CoxB5、POLIO等病毒無交叉反應；本發明方法檢測的靈敏度達0.1TCID5。，可直接從疑似手足口病患者的腦脊液、皰滲液和糞i"更等標本中檢測腸道病毒CoxA16核酸，從病毒核酸提取至完成檢測僅需3h左右；本發明方法是一種快速檢測腸道病毒CoxA16特異、敏感的方法，非常適用於手足口病等由腸道病毒CoxA16感染引起突發疫情的實驗室早期診斷。(四)圖1為焚光RT-PCR法檢測腸道病毒CoxA16的靈敏度；AE分別代表不同的病毒濃度，從A至E依次為1000、100、10、1、0.1TCID50;圖2為焚光RT-PCR法檢測手足口病疑似患者臨床樣本中腸道病毒CoxA16核酸；A:腸道CoxA16陽性對照，B至I:手足口病疑似患者臨床才羊本的4全測。(五)具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述,但本發明的保護範圍並不僅限於此實施例1:1材#+與方法1.1病毒株與臨床標本腸道病毒EV71、柯薩奇A組(Cox)CoxA4、CoxA16、CoxA21、柯薩奇B5、E6、E30、POLIO1型等病毒抹來源於中國醫學科學院、北京生物製品研究所和浙江省疾病預防控制中心分離株。臨床樣本來源於近期浙江省手足口病爆發疫情疑似患者的腦脊液、皰滲液、糞便等，樣本採集後帶冰運送到實驗室。1.2引物與探針從GenBank上下載不同年份和地區的腸道病毒CoxA16基因序列，用生物學軟體進行同源性比較，在VP1區設計特異性引物和TaqMan探針，序列為CA16YGF:5，誦GGGAATTTCTTTAGCCGTGC-3'CA16YGR:5，誦CCCATCAARTCAATGTCCC-3'COXA16PB:5，-ACAATGCCCACCACGGGTACACA-3'引物和探針委託上海基康生物工程有限公司合成。1.3病毒定量標準與病毒RNA的提取以腸道病毒CoxA16為標準毒抹，用人橫紋肌瘤細胞(RD)進行病毒效價滴定(112.2TCID5。/ml)後作為參考株，將其稀釋至1000、100、10、1、0.1、0.01TCID5o每個反應管。病毒腦A的提取採用德國QIAGEN公司的ReansyMiniKit,按試劑盒說明書提取，得到病毒RNA(103ng/)iU，備用。1.4螢光RT-PCR反應體系和條件的優化試劑盒選用Takara,i^司的onestepPrimeScriptRT-PCR(PerfectRealtime),Code:DRR064A。按說明書操作，反應體系為25|^1,其中2xonestepRT-PCR緩衝液12.5ul,ExTaqHS(5U/|ul)0.5ul,RTEnzymeMixII(5U/|ul)0.5ul,上遊與下遊引物(20jamol/L)各0,8探針(20(imol/L)0.4才莫板脂A8nl，DEPC水補足25]dl。反應條件為42°C30min,95°C2min進行逆轉錄，然後95。C5s,51°C35s,在51。C進行單點螢光檢測，共進;f於40個循環。結果判斷選擇焚光檢測模式FAM,萸光基線調整取315個循環的螢光信號平均值，閾值設定以閾值線剛好超過正常陰性對照品的最高點，樣本呈典型的擴增曲線，判斷為陽性。無典型的擴增曲線，判斷為陰性。體系的優化試驗，在以相同濃度陽性核酸為模板的反應體系中，引物濃度從0.10~1.00pM,探針濃度從0.10~0.50pM,採用矩陣法優選引物和探針的最佳濃度，根據最低Ct值和最高螢光強度增加值(ARn)選擇最佳引物和探針濃度。1.5常規RT-PCRA應腸道病毒CoxA16RT-PCR引物序列，CoxA16畫S(上遊)5、-ATTGGTGCTCCCACTACAGC-3、CoxAl6-A(下遊)；5、-TCAGTGTTGGCAGCTGTAGG-3、擴增片斷208bp。採用TAKARA公司onestepRT-kit(code:DRR024A),按試劑盒說明書操作，反應體系為25(al，其中10xRT-PCR緩衝液2.5ul,MgC122.5ul(25mM)，dNTP混合物(各10mM)2.5|iil,RNase抑制劑(40U/V1)0.5AMV酶(5U/|ul)0.5ul,Taq酶(5U/|iil)0.5ul,上遊與下遊引物(20pM)各0.5fi1,模板RNA8iul，DEPC水4.5|til。反應條件為50。C30min,95°C3min進行逆轉錄,然後95。C20s,50°C25s，72°C30s進行擴增，40個循環後轉入72。C10min,取8(il產物電泳後判斷有無特異性條帶(208bp)。1.6螢光RT-PCR特異性、敏感性和重複性試驗選擇腸道病毒CoxA16型毒抹，柯薩奇A組CoxA4、CoxA21、柯薩奇B5、艾柯病毒E6、E30、EV71、POLIO1型和近期手足口爆發疫情疑似患者的腦脊液、皰滲液和糞便等臨床樣本，對上述病毒抹和樣本分別提取核酸，用腸道病毒CoxA16螢光RT-PCR方法進行檢測，驗證方法的特異性；對已標定TCID5Q的腸道病毒CoxA16型(112.2TCID5。/ml)稀釋後分別提取RNA,平行進行螢光RT-PCR與RT-PCR反應，比較其靈敏度。此外，對每一個濃度的病毒稀釋液作5次重複檢測，得到的Ct值計算標準差，-驗證方法的重複性。2結果2.1螢光RT-PCR反應體系及條件採用TAKARA公司的一步法焚光RT-PCR試劑盒，總反應體系為25(il。矩陣法優選後引物最佳濃度均為0.64pM,探針最佳濃度為0.32^M,模板RNA8最後用DEPC水補至25|ul。用MJResearchOption2螢光檢測系統進行檢測，反應參數為42°C30min逆轉錄，95°C變性2min,以95。C5s,51°C35s擴增40個循環，在51。C進行單點螢光檢測，可獲得最低Ct值和最高螢光強度。2.2特異性試驗本發明建立的螢光RT-PCR方法對腸道病毒CoxA16具有較好的特異性，對其他腸道病毒如CoxA4、CoxA21、E6、E30、COXB5、POLIO1型等無交叉反應。2.3敏感性試驗對腸道病毒CoxA16毒林，採用RD細胞進行病毒效價測定(112.2TCID50/ml),然後稀釋成1000、100、10、1、0.1、0.01TCID50,提取病毒RNA，分別用螢光RT-PCR與常規RT-PCR方法進行檢測，結果螢光RT-PCR方法檢測敏感性達到0.1TCID5。，RT-PCR方法檢測敏感性達1.0TCID5o，焚光RT-PCR方法比常規RT-PCR方法的靈敏度高10倍左右(見圖1)。2.4重複性試驗腸道病毒CoxA16毒株按10倍梯度稀釋成3個不同的濃度，對每一個濃度的樣本作5個重複檢測，結果不同核酸濃度各自的檢測Ct值標準差在0.11~0.31之間，具有較好的重複性(表1)。表1螢光RT-PCR法檢測腸道病毒CoxA16的重複性試驗tableseeoriginaldocumentpage122.5臨床樣本的檢測從近期浙江省各地報告的手足口爆發疫情疑似患者的腦脊液、糞便和皰滲液共80份臨床樣本中直接提耳又病毒RNA,用本發明腸道病毒CoxA16型螢光RT-PCR方法和普通RT-PCR方法(見操作1.5)同時才企測，結果本發明腸道病毒CoxA16螢光RT-PCR方法4企測出腸道CoxA16核酸陽性8份，普通RT-PCR法檢測出CoxA16核酸陽性6份，本發明腸道病毒CoxA16螢光RT-PCR方法比普通RT-PCR法檢測CoxA16的陽性率高。本發明腸道病毒CoxA16螢光RT-PCR方法用於臨床樣本檢測的驗證在4個平行實驗室進行，均獲得了滿意的結果，圖2顯示的是臨床樣本的檢測圖譜。序列表—ST25SEQUENCELISTING浙江省疾病預防控制中心腸道病毒CoxA16核酸螢光定量RT-PCR檢測試劑盒及檢測方法3Patentlnversion3.41<211〉20〈212〉DNA〈213〉Unknown〈220〉人工序列1gggaatttctttagccgtgc20<210〉2<211〉19DNAUnknown<220〉人工序列<400〉2cccatcaartcaatgtccc19<210〉323腿Unknown人工序列<400〉3acaatgcccaccacgggtacaca2權利要求1.腸道病毒CoxA16核酸螢光定量RT-PCR檢測試劑盒，其特徵在於所述螢光定量RT-PCR檢測試劑盒的上下遊引物和特異性探針序列如下CA16YGF5』-GGGAATTTCTTTAGCCGTGC-3』CA16YGR5』-CCCATCAARTCAATGTCCC-3』COXA16PB5』-ACAATGCCCACCACGGGTACACA-3』引物CA16YGR序列中，R為A或G。2.—種腸道病毒CoxA16核酸螢光定量RT-PCR檢測方法，所述方法包括(1)根據腸道病毒CoxA16基因序列，設計上下遊引物和特異性探針序列如下CA16YGF:5，-GGGAATTTCTTTAGCCGTGC-3'CA16YGR:5，畫CCCATCAARTCAATGTCCC畫3'COXA16PB:5'-ACAATGCCCACCACGGGTACACA-3'引物CA16YGR序列中，R為A或G。(2)提取待測樣品RNA,以待測樣品RNA為才莫板、在包括步驟(1)所述51物和探針序列的RT-PCR反應體系中進行RT-PCR反應；(3)對RT-PCR反應產物進行螢光檢測，根據螢光檢測的最低Ct值和最高螢光強度判斷結果，若螢光RT-PCR反應呈陽性，則待測樣品含有腸道病毒CoxA16核酸。3.如權利要求2所述的方法，其特徵在於所述RT-PCR反應體系終濃度組成如下RT-PCR緩衝液終濃度為lxformulaseeoriginaldocumentpage3上遊與下遊引物各1.60iaM探針0.80模板RNA10~105ng/LDEPC水補足至25|uL。4.如權利要求2所述的方法，其特徵在於所述RT-PCR反應條件為42°C30min，95°C2min進行逆轉錄，然後95°C5s,51°C35s,在51。C進行單點螢光糹企測，共進行40個循環。全文摘要本發明提供了一種腸道病毒柯薩奇A16型(CoxA16)核酸螢光定量RT-PCR檢測試劑盒及檢測方法。所述螢光定量RT-PCR檢測試劑盒的上下遊引物和特異性探針序列如下上遊引物CA16YGF5』-GGGAATTTCTTTAGCCGTGC-3』；下遊引物CA16YGR5』-CCCATCAARTCAATGTCCC-3』；特異性探針COXA16PB5』-ACAATGCCCACCACGGGTACACA-3』；本發明方法對腸道病毒CoxA16的檢測有高度的特異性，與其他腸道病毒無交叉反應，且靈敏度達0.1TCID50，可直接從疑似手足口病患者的腦脊液、皰疹液和糞便等標本中檢測腸道病毒CoxA16核酸，從病毒核酸提取至完成檢測僅需3h左右，非常適用於手足口病等由腸道病毒CoxA16感染引起突發疫情的實驗室早期診斷。文檔編號C12Q1/68GK101407847SQ20081012145公開日2009年4月15日申請日期2008年10月13日優先權日2008年10月13日發明者嚴菊英,燕馮,盧亦愚,徐昌平,寅陳申請人:浙江省疾病預防控制中心