脂質體組合物的製作方法

2023-06-05 23:17:26 4

專利名稱：：脂質體組合物的製作方法脂質體組合物發明領域本發明涉及使用作為遞送載體、有二價陽離子骨架的脂質體的治療組合物和方法。二價陽離子骨架保護治療劑。所述的脂質體任選地包含脂質體外表面上的親和部分通過靶組織用於有效結合和內化。脂質體為了空間穩定性和延長循環任選地亦包含親水聚合物表面衣層。發明背景脂質體用於各種治療目的，特別地，用於通過脂質體的全身施用載送治療劑至耙細胞。由於各種原因，可能需要使用脂質體保護治療劑。為了開拓雙膦酸類藥物的治療作用，藥物分布必須以使治療劑可有效地特定地與治療目標的靼表面相互作用的方式進行改變。因此，需要提供包含治療劑可被其保護的二價陽離子骨架的治療性脂質體組合物。發明概述一方面，本發明包括用於哺乳動物個體的基於脂質體的治療方法，其包括給個體全身施用脂質體，脂質體包含(i)有效的二價陽離子骨架和(ii)治療劑。二價陽離子骨架提供對治療劑的保護，否則治療劑一旦引入體內有可能從傳統脂質體製劑中滲漏出來。另一方面，本發明包括用於哺乳動物個體的基於脂質體治療的方法，其包括給個體全身施用脂質體，脂質體包含(i)二價陽離子骨架、(ii)治療劑、(iii)用於空間穩定性和延長循環的親水聚合物衣層、和(iv)任選的親和部分，其有效地特異性地結合至治療目標的粑表面。親水聚合物衣層是由共價連接至脂質體中的表面脂質成分的聚合物鏈組成。在一個實施方案中，二價陽離子骨架包含二價陽離子，諸如鈣離子、鋅離子、鎂離子。在一個實施方案中，在治療劑,皮施用至靶區處，親和部分是有效地特異性與耙區處受體結合的配體，且脂質體包括包封形式的治療劑。該實施方案的實施例是實體瘤的治療，在實體腫瘤處親和部分對特異性地與肺瘤特異性抗原結合是有效的，脂質體具有約10至約500mn之間的平均粒度，並包含包封的藥物。在一個實施方案中，二價陽離子骨架包含陽離子脂質。這些脂質包括甾醇、醯基或二醯基鏈，其中脂質整體上帶淨正電荷。示例性的脂質包括1，2-二醯基-3-三曱基銨-丙烷(DOTAP)、二曱基二-十八烷基銨(DDAB)、N-[1-(2，3，-二-十四烷基氧基)丙基]-N，N-二甲基-N-羥基乙基溴化銨(DMRIE);]\-[1-(2，3，-二油基氧基)丙基]-N，N-二曱基-N-羥基乙基澳化銨(DORIE);N-[l-(2，3-二油基氧基)丙基-N，N，N-三甲基溴化銨(DOTMA);3卩[N-(N'，N'-二甲基氨基乙烷)氨基甲醯基膽固醇(DC-Chol);發明詳述l.脂質體的組成基於脂質體治療中使用的脂質體有至少一個具有外表面的外雙層。應當理解脂質體可包含另外的雙層。外雙層是分別由內部和外部脂質層的雙層組成的，每層由形成泡嚢的脂質組成，諸如磷脂和膽固醇，一般有二醯基疏水脂質尾端和極性頭部基團。脂質體主要是由這類形成泡嚢的脂質組成的。脂質體包含有效地保護治療劑在其,iL^露與其^N互作用前不滲漏的二價陽離子。二價陽離子骨架通過包封藥物降低了治療劑跨過脂質體雙層的通透性。二價陽離子骨架幫助包封高度可溶的治療劑。另外，二價陽離子骨架可促進更有效地遞送治療劑至腫瘤。在一個實施方案中，加至脂質體中的鈣離子幫助保留活性藥物不在與靶反應之前分散。被施用於靶細胞或區域的治療劑被包封到脂質體中。本文使用的治療劑、化合物和藥物可互換使用。治療劑可依化合物的性質包封到脂質體的內部水相室或脂雙層中。被包封的治療劑可以是可被包封到脂質泡嚢中的大量治療劑中的任何一種，包括可穩定地包裹到泡嚢的水溶性室中的水溶性成分、穩定地分配在泡嚢的脂相中的親脂性化合物、或可穩定連接的例如通過與泡嚢外表面靜電連接的親脂化合物。示例性的水溶性化合物包括雙膦酸類藥物。治療劑的實例是取代的烷基二膦酸，特別是式I的雜芳基烷基二膦酸及其鹽R1——CHP03H2—R2P03H2其中Rl是包含如2至4個N-原子或1或2個N-原子以及1個O-或S-原子的雜原子的5-元雜芳基，且其是未取代的或被低級烷基、苯基或被低級垸基、低級烷氧基和/或卣素取代的苯基、或被低級烷氧基、羥基、二-低級烷基M、低級烷硫基和/或滷素C-取代、和/或在能夠被低級烷基、低級烷氧基和/或囟素取代的N-原子處N-取代，且R2是氫、羥基、氨基、低級烷硫基或囟素，特別是所述化合物的製備、包含它們的藥物組合物、及其用作藥物的用途。包含2至4個N-原子或1或2個N-原子及1個O-或S-原子的雜原子的5-元雜芳基的實施例是咪唑基例如咪唑-l-基、咪唑-2-基或咪唑-4-基，吡唑基例如吡唑-l-基或吡唑-3-基，噻唑基例如蓉唑-2-基或噻唑-4-基，或不太優選的噁唑基例如喁唑-2-基或鳴唑-4-基，異噴、唑基例如異噁唑-3-基或異巧悉唑-4-基，三唑基例如1H-l，2，4-三唑-l-基、4H-l，2，4-三唑-3-基或4H-l，2，4-三唑-4-基或2H-l，2，3-三唑-4-基，四唑基例如四唑-5-基，蓉二唑基例如1，2，5-噻二唑-3-基，和噍二唑基例如1,3，4-喁二唑-2-基。這些基團可包含一個或多個相同或不同的、優選為一個或兩個相同或不同的選自開頭提及的基團的取代基。如所指出的未取代的或取代的基團Rl，例如是未取代的或被苯基或如指出的被取代的苯基C-取代的咪唑-2-基或咪唑-4-基，或被d-C4烷基例如曱基C-或N-取代，且一般為咪峻-2-基、l-d-d烷基咪唑-2-基諸如l-甲基咪唑-2-基、或2-或5-d-C4烷基咪唑-4-基諸如2-或5-甲基咪唑-4-基、未取代的瘞哇基，例如，噻唑-2-基或未取代的或被C廣C4烷基諸如甲基取代的1H-l，2，4-三唑基、例如l-C廣C4烷基-lH-l，2，4-三唑-5-基諸如l-甲基-lH-l，2,4-三唑-5-基、或咪唑-l-基、吡唑-l-基、1H-l，2，4-三峻-l-基、4H-l，2，4-三唑-4-基或四唑-l-基、未取代的或被苯基或如指出的被取代的苯基或被d-C4烷基諸如甲基C-取代，例如咪唑-l-基、2-，4-或5-C廣C4烷基咪唑-l-基諸如2-,4-或5-甲基咪唑-l-基、吡唑-l-基、3-或4-C廣C4烷基吡唑-l-基諸如3-或4-曱基吡唑-l-基、1H-l，2，4-四唑-l-基、3-d-Ct烷基-lH-l，2，4-三唑-l-基諸如3-甲基-lH-l，2，4-三唑-l-基、4H-l，2，4-三哇-l-基、3畫d-C4烷基-4H-1，2，4-三唑畫4畫基諸如3-甲基-4H-1，2，4-三唑-4-基或lH-l，2，4-四喳-l-基。下文中基團和化合物的術語"低級"將被理解為以下的基本意義，包含最多達7個(含7個)碳原子、優選地達4個(含4個)碳原子。一般術語有例如以下的意義低級烷基是例如d-C4烷基諸如甲基、乙基、丙基或丁基，且亦是異丁基、仲-丁基或叔-丁基，並還可以是Cs-C7烷基諸如戊基、己基或庚基。苯基-低級烷基是例如苯基-d-C4烷基，優選地l-苯基-d-C4烷基諸如節基。低級烷氧基是例如d-C4烷氧基諸如甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、丁氧基、異丁氧基、仲丁氧基或叔丁氧基。二-低級烷基氨基是例如二-d-C4烷基M諸如二甲基氨基、二乙基氨基、N-乙基-N-甲基氨基、二丙基氨基、N-甲基-N-丙基氨基或二丁基氨基。低級烷硫基是例如d-C4烷硫基諸如甲硫基、乙硫基、丙硫基或丁硫基，及異丁硫基、仲丁硫基或叔丁硫基。滷素是例如有原子序數達35含35的卣素，諸如氟、氯或溴。式I化合物的鹽特別是其與藥物可接受鹼的鹽，諸如由Ia、Ib、IIa和lib族金屬例如鹼金屬鹽、優選鈉或鉀鹽、鹼土金屬鹽優選鉤或鎂鹽、銅、鋁或鋅鹽衍生的的非毒性金屬鹽，及與氨或有機胺或季銨鹼諸如無羥基或c-羥基化的脂肪族胺、優選單-、二-、或三-低級烷基胺的銨鹽，例如，甲基胺、乙基胺、二甲基胺或二乙基胺、單-、二-、或三(羥基-低級烷基)胺諸如乙醇胺、二乙醇胺或三乙醇胺、三(羥基甲基)氨基甲烷或2-羥基-叔-丁基胺或N-(羥基-低級烷基)-N，N-二-低級烷基胺或N-(聚羥基-低級烷基)-N-低級烷基胺諸如2-(二曱基M)乙醇或D-葡糖胺或脂肪族季銨氫氧化物，例如四丁基銨氫氧化物。關於這一點，亦應提及式I化合物也可以內鹽形式獲得，條件是Rl基團有足夠的鹼性。這些化合物因此亦可通過用強質子酸諸如鹽酸、硫酸、磺酸、例如甲磺酸或p-曱苯磺酸、或M磺酸例如N-環己基M磺酸轉化成相應的酸加成鹽。在一個實施方案中，治療劑是式I化合物及其鹽，特別是內鹽和其與鹼的藥物可接受的鹽。其中Rl是咪唑基、吡唑基、2H-l，2，3-三唑基、1H-l,2，4-三唑基或4H-l，2，4-三唑基、四唑基、，懲唑基、異悉唑基、噴、二唑基、噻唑基或噻二唑基，其是未取代的或被一個或兩個選自低級烷基、低級烷氧基、苯基或被一個或兩個選自低級烷基、低級烷氧基、和/或卣素、羥基、二-低級烷基氨基、低級烷硫基和/或卣素依次取代的苯基C-取代，和/或在能夠被未取代的或被一個或兩個選自低級烷基、低級烷氧基和/或卣素取代的低級烷基或苯基-低級烷基取代的N-原子處N-取代；且R2是氫、羥基、氨基、低級烷硫基或滷素。在一個實施方案中，治療劑是式I化合物及其鹽，特別是內鹽和其與鹼的藥物可接受的鹽。其中Rl是咪唑基、吡唑基、2H-l，2，3-三唑基或4H-l，2，4-三唑基、四哇基、喁唑基、異鳴唑基、鳴二峻基、瘞唑基或瘞二唑基，其是未取代的或被一個或兩個選自低級烷基、低級烷氧基、苯基或被一個或兩個選自低級烷基、低級烷氧基和/或囟素、羥基、二-低級烷基氨基、低級烷硫基和/或卣素取代的苯基C-取代，和/或在能夠被未取代的或被一個或兩個選自低級烷基、低級烷氧基和/或卣素取代的低級烷基或苯基-低級烷基取代的N-原子處N-取代；且R2是氫、羥基、氨基、低級烷硫基或滷素。在一個實施方案中，治療劑是式I化合物及其鹽，特別是內鹽及其與鹼的藥物可接受的鹽。其中R1是咪唑基，諸如咪唑-l-基、咪唑-2-基或咪喳-4-基、4H-l，2，4-三唑基諸如4H-l，2，4-三唑畫4畫基、或噢唑基諸如噢唑-2畫基，其是未取代的或被一個或兩個選自Crd烷基諸如甲基、d-C4烷氧基諸如曱氧基、苯基、羥基、二-C廣C4烷基氨基諸如二甲基氨基或二乙基氨基、d-C4烷硫基諸如甲硫基、和/或原子序數大至35含35的卣素諸如氯C-取代，和/或在能夠被C廣Q烷基諸如曱基、或苯基-C廣C4烷基諸如苄基取代的N-原子處N-取代；且R2優選地是羥基或不太優選地為氫或氨基。在一個實施方案中，治療劑是式I化合物及其鹽，特別是其藥物可接受的鹽。其中Rl是未取代的或被苯基C-取代咪唑-2-或-4基或被d-Ct烷基諸如甲基C-取代或N-取代的，例如，咪唑-2-基、l-d-C4烷基咪唑-2-基諸如l-甲基咪唑-2-基、或2-或5-CrC4烷基咪唑-4-基諸如2-或5-甲基咪哇-4-基、或未取代的噻唑基，例如未取代的或被d-C4烷基諸如甲基取代的瘞喳-2-基、或是lH-l，2，4-瘞唑基，例如ld-C4烷基-lH-l，2，4-三唑-5-基諸如l-甲基-l，2，4-三唑-5-基，且R2是羥基或不太優選地是氫。在一個實施方案中，治療劑是式I的化合物及其鹽，特別是其藥物可接受的鹽。其中Rl是未取代的或被苯基或d-C4烷基諸如甲基取代的C取代的咪唑-l-基、吡唑-l-基、lH-l，2，4-三唑-l-基、4H-l，2，4-三唑-4-基或四峻-l-基，例如，咪峻-l-基、2-，4-，或5-C廣C4烷基咪唑誦l-基諸如2-，4-或5-甲基咪唑-l-基、p比峻-1-基、3-或4-d-C4烷基吡唑-l-基諸如3-或4-曱基吡哇-l-基、lH畫l，2，4-四唑-l-基、3畫d畫C4烷基-lH訓l，2，4-三唑-l-基諸如3-甲基-lH-l，2，4-三唑-l-基、4H-l，2，4-三唑-l-基、3-CrC4烷基-4H-l，2，4-三唑-4-基諸如3-甲基-4H-l，2，4-三唑-4-基或1H-四唑-l-基，且R2是羥基或不太優選地是氫。在一個實施方案中，治療劑是式I化合物及其鹽，特別是其藥物可接受的鹽。其中Rl是未取代的或被d-C4烷基諸如甲基取代的咪唑基,例如，l-曱基咪唑-2-基、咪唑-4-基或2-或5-甲基咪唑-4-基，且R2是羥基或不太優選地是氫。在本發明優選的實施方案中，脂質體包含用於治療實體腫瘤諸如唑來膦酸的包封的藥物。脂質體的外層表面可包含由親水聚合物鏈組成的親水聚合物的表面衣層，其優選地緊密堆積形成有效保護脂質體表面成分的刷狀衣層。根據本發明，親水聚合物鏈與脂質體脂質化學連接。脂質體外層表面可包含親和性部分，有效地與靶特異性地結合，例如，基於脂質體治療目標的生物表面諸如細胞膜、細胞骨架、組織或靼表面或區域。親和部分通過共價連接與脂質體外表面結合至脂質體中的表面脂質成分和/或親水聚合物衣。親和部分是有效特異性結合的配體，且與靶上載的配體結合分子有高親和性。例如，在一個實施方案中，親和部分與胂瘤特異性抗原和/或實體腫瘤中過度表達的受體結合是有效的，且在另一個實施方案中，親和部分與在炎症部位的細胞結合是有效的。在另一個實施方案中，親和部分是維生素、多肽或多糖或蛋白質效應器。本發明的脂質體是用於施用治療劑至靶。治療劑^L包封於脂質體內。本發明的脂質體組合物主要是由形成泡嚢的脂質組成的。這樣的形成泡嚢的脂質是如下的一種(a)能在水中自發形成雙層泡嚢的，可作範例的是磷脂，或(b)被穩定地加入到脂質雙層中，其疏水部分與雙層膜的內部、疏水區接觸，且其頭部定位朝向泡嚢的外部和內部、極性表面。此類型的泡嚢形成脂質優選地是有一般為醯基鏈的兩個烴鏈，和不管是極性或非極性的頭部的脂質。但是，其他包含四個烴基鏈的磷脂，諸如四肉豆蔻基心磷脂也是適合的。有許多合成的泡囊形成脂質和天然存在的泡囊形成脂質，包括磷脂，諸如磷脂醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺、磷脂酸、磷脂醯肌醇和鞘磷脂，其中烴鏈的一般長度在約14-22個碳原子，且有可變的不飽和度。上文描述的其醯基鏈有可變的飽和度的脂質和磷脂可商購獲得或根據已經公布的方法製備。其他適合的脂質包括糖脂和甾醇諸如膽固醇或膽固醇衍生物。單獨或聯合用於本發明的優選的二醯基鏈脂質包括二醯基甘油，諸如，磷脂醯膽鹼(PC)、磷脂醯乙醇胺(PE)、磷脂醯甘油(PG)、磷脂醯絲氨酸(PS)、磚脂酸(PA)、磷脂醯肌醇(PI)、鞘磷脂(SPM)、心磷脂等。這些脂質優選地用作泡嚢形成脂質，主要的脂質體成分，並用在下文描述的衍生的脂質中。另外，泡嚢形成脂質^f皮選擇用於實現特定的流動性或剛性，以控制脂質體在血清中的穩定性，並控制脂質體中包封成分的釋放速率。脂質體的剛性，如通過泡嚢形成脂質測定的，如將要描述的亦可在脂質體與靶細胞的融合中起作用。有更剛性的脂質雙層，或液晶雙層的脂質體，是通過加入相對剛性的脂質，例如有相對高的相轉變溫度，例如高至60。C的脂質實現的。剛性的、即飽和的脂質對在脂質雙層中更大的膜剛性起作用。其他脂質成分，諸如膽固醇也是已知對脂質雙層結構中的膜剛性起作用。本發明的脂質體可包含由與脂質體表面脂質連接的聚合物鏈組成的親水聚合物衣層。這些親水聚合物鏈被加到脂質體，包括約l-20摩爾百分數之間的親水聚合物-脂質結合物。適合用於聚合物衣層的親水聚合物包括聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯甲基醚、聚甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚羥基丙基噁唑啉、聚羥基丙基甲基丙烯醯胺、聚甲基丙烯醯胺、聚二甲基丙烯醯胺、聚羥基丙基甲基丙烯酸酯、聚羥基乙基丙烯酸酯、羥基甲基纖維素、羥基乙基纖維素、聚乙二醇、聚甘油和聚天冬醯胺、透明質酸。在優選的實施方案中，親水聚合物是聚乙二醇(PEG),優選地是分子量在500-10000道爾頓之間的PEG鏈，更優選地在2000-10000道爾頓之間，且最優選地在1000-5000道爾頓之間。在另一個優選的實施方案中，親水聚合物是聚甘油(PG)，優選地是分子量在400-2000道爾頓之間的PG鏈，更優選地在500-1000道爾頓之間，且最優選地在600-700道爾頓之間。本發明的脂質體組合物可包含親和性部分。親和性部分與靶特異性結合一般是有效的，即，生物表面諸如靶細胞表面或膜、細胞表面受體、細胞骨架、斑塊區等。如將要描述的，親和部分通過與脂質體脂質不論與磷脂或是膽固醇直接連接、或通過短聚合物鏈連接與脂質體表面結合。在一個實施方案中，親和部分是與在靶區的受體特異性結合有效的配體，更特異性地，用於與在靶細胞上的受體結合的配體。適合此目的的配體的非限制性實例列於表1中。表1tableseeoriginaldocumentpage14在本發明的一個實施方案中，表l中列舉的配體可祐使用將脂質體靶向於特定的靶細胞。例如，與DSPE的頭部連接或與由DSPE衍生的短PEG鏈的尾端連接的葉酸鹽配體可被加至脂質體中。"短"PEG鏈，如本文使用的意思是有選擇的長度(分子量)的特定PEG鏈以便當加至脂質體中時配體可通過親水聚合物鏈的表面衣層被遮擋或保護。被加至脂質體中的表面結合的葉酸鹽配體與內皮細胞上的葉酸鹽受體結合是有效的，用於包封治療劑施用至靶細胞，例如，用於上皮癌治療的肺瘤活性劑的施用。親和部分是有細胞結合活性且有效地與配體竟爭受體位點的短肽。配體-受體細胞結合事件的抑制作用導致感染過程的停止。包含包封劑的脂質泡嚢是按照熟知的方法製備的，諸如上文描述的那些，一般地，脂質膜的7jC合作用、反相蒸發、溶劑稀釋、清潔劑透析法、凍融和微嚢化。要遞送的化合物在親脂化合物的情況下可被包含在有機基質中，或在水溶性治療劑的情況下可包含在水合基質中。或者，治療劑可在施用給個體前裝栽到預先形成的泡嚢中。II.脂質體的製備A.可釋放聚合物衣層的製備親水性聚合物鏈通過連接與脂質體相連，該連接可響應於所選擇的刺激而斷裂。在一個實施方案中，連接是肽、酯或二硫鍵。肽-連接的化合物是通過例如將聚烷基醚諸如PEG與脂質胺偶聯而製備。封端PEG是用羰基二咪唑偶聯劑被激活以形成活化的咪唑化合物。活化的PEG然後與所示的示例性三肽的N-末端胺偶聯。所述肽的J^&基團然後可通過傳統的碳二亞胺偶聯劑，諸如二環己基碳二亞胺(DCC)被用於偶聯脂質胺基團。酯連接的化合物可通過例如偶聯脂質酸諸如磷脂酸與聚烷基醚的末端醇基團，使用醇通過酸肝偶聯劑而製備。或者，包含內酯鍵和適當端基的短的連接片段，諸如伯胺基團，可通過醯胺或氨基甲酸酯連接用於將聚烷基醚與泡嚢形成性脂質偶聯。B.親和部分的連接如上文所述，本發明的脂質體可包含與PEG-包衣脂質體的表面相連接的親和部分。親和部分是依照該部分的性質，通過與脂質體脂質表面成分直接相連或通過短的間隔臂或帶與脂質體連接。可有多種方法例如親和部分，用於將分子與脂質泡嚢表面連接。在一個優選的方法中，親和部分是通過下文所述的偶聯反應與脂質偶聯以形成親和部分-脂質結合物。該結合物被加至脂質溶液中用於脂質體的形成。在另一個方法中，用於親和部分共價連接的被激活的泡嚢形成性脂質被加入到脂質體中。通常，部分與間隔臂的連接可通過衍生化泡嚢形成性脂質而實現，一般地DSPE，與有反應性末端基團的親水聚合物諸如PEG用於親和部分的連接。用於將配體與活化的PEG鏈連接的方法在本領域中有所描述(Allen等人，1995;Zalipsky，1993;Zalipsky，1994;Zalipsky，1995a;Zalipsky，1995b)。在這些方法中，mPEG的惰性末端甲氧基被換以適合偶聯反應的反應性功能團，諸如氨基或肼基。端基功能化的PEG被與脂質連接，一般地DSPE。功能化的PEG-DSPE衍生物被用於脂質體形成並且所需要的配體在脂質體形成之前或之後被連接到PEG鏈的反應性端。部分的連接亦可通過用有活性末端基團的親水聚合物諸如PEG衍生化膽固醇用於親和部分連接而實現。用於配體與活化的PEG鏈連接的方法在本領域有所描述(Guo，W.，Lee，T.，Sudimack,J.，和Lee,R.J.脂質體通過葉酸-PEG-膽固醇的受體耙向遞送，(2000)/.hj^so附e及m.，10:179-195)。C.脂質體製備脂質體可通過各種技術製備，諸如Szoka等人，1980中詳細描述的那些。多室泡嚢(MLV)可通過簡單的脂質-膜水合技術製備。在該方法中，上文詳述的這種類型的脂質體形成脂質混合物溶解於適合的有機溶劑中，在容器中蒸發以形成薄膜，其然後被7K基質覆蓋。形成MLV的脂質膜水合物粒度一般在約0.1至10微米之間。本發明的用於製作融合脂質體的脂質成分優選以以下述摩爾比存在約70-95%的泡嚢形成脂質、1-20%的用親水聚合物鏈^"生化的脂質、和0.1-5%的連接親和部分的脂質。一個示例性的製劑包含80-95%摩爾百分數的磷脂醯膽鹼、1-20%摩爾百分數的PEG-DTP-DSPE、和0.1-5%摩爾百分數的親和部分-DSPE。可包含在製劑中的膽固醇摩爾百分數約為161-50%之間。本發明的另一個適合於製備融合脂質體的方法是由Uster等人，1996描述的。在該方法中，有包封的治療劑的脂質體是從泡嚢形成脂質製備的。預製的脂質體被加至含親和部分-DSPE結合物和/或PEG-衍生化的脂質結合物的濃縮分散體溶液中，並在有效實現膠束脂質結合物插入到預製的脂質體中的條件下孵育。又一個適合本發明脂質體製備的脂質體製備方法是溶劑注入法。在該方法中，脂質混合物，溶解在溶劑中，優選為乙醇或DMSO，在攪拌下被注入到7jc相基質中以形成脂質體。該溶劑通過適當的技術諸如透析或蒸發被除去，然後脂質體被製成所需的粒度。該方法實現了相對高的包封效率。親水性治療劑通過將活性劑包括在7jc相7jc合混合物中被包封到脂質體中。疏水的治療劑在薄膜形成之前通過將活性劑包含在脂質中或在注入到水相基質中以前溶解在脂質溶劑中被包封在脂質體中。脂質體優選地被製備成具有基本上在所選粒度範圍內的均勻的粒度，一般在約10至約500nm，優選地50至約300nm，且更優選地80至約200腿。當需要時，脂質體可通過諸如蒸發或凍幹被乾燥，並在任何所需的溶劑中重混懸。在脂質體,皮凍幹的情況下，非還原糖可在凍幹前、或在脂質體配製期間被加入以提供穩定性。一種這樣的糖是蔗糖。有二價陽離子骨架的脂質體可通過在脂質體製備期間加入包含二價陽離子的溶劑而製備。有二價陽離子骨架的脂質體在施用於個體之前亦可通過用適當的包含二價陽離子的溶劑重溶凍幹脂質體而製備。已發現具有跨膜濃度梯度的本發明脂質體可在一種或多種糖的存在下貯存在其脫水條件下被脫水，接著再7JC合，且該濃度梯度則用於產生跨膜電位，其將荷載二價陽離子進入脂質體，並形成藥物-二價陽離子骨架。當使用脫水脂質體時，再7jC合通過簡單加入二價陽離子的水溶液實現，例如氯化鉤、含二價陽離子的緩衝溶液至脂質體中，並允許其再水合併形成藥物-二價陽離子骨架。脂質體可通過溶液輕輕渦旋被重混懸至水溶液中。可在適合於脂質體及其內容物的組合物的室溫下或在其他溫度下進行再水合。III.治療方法一方面，本發明包括用於哺乳動物個體的基於脂質體治療的方法，其包括給個體全身施用包含(i)二價陽離子骨架和(ii)治療劑的脂質體。二價陽離子骨架提供了治療劑的保護，否則治療劑可能在貨架上及一旦i^身體從傳統脂質體中滲漏。另一方面，本發明包括用於哺乳動物個體的基於脂質體治療的方法，其包括給個體全身施用包含(i)二價陽離子骨架、(ii)治療劑、(iii)用於穩定性和延長循環的親水聚合物衣層、和(iv)任選的有效地特異性結合至治療目標的耙表面的親和部分的脂質體。疏水聚合物衣層是由與脂質體中的表面脂質成分共價連接的聚合物鏈組成的。施用的脂質體被允許全身循環直至實現了脂質體所需的生物分布，藉此暴露親和劑至乾表面。在優選的實施方案中，脂質體被用於實體腫瘤的治療。脂質體包括包封形式的抗腫瘤藥物並通過有效與腫瘤特異性抗原特異性結合的親和部分被靶向於腫瘤區域。例如，脂質體可通過包含用於增殖性腫瘤內皮細胞上表達的Flk-1，2受體的選擇性連接的脂質體中的VEGF配體被靶向於腫瘤血管內皮細胞。在此實施方案中，脂質體製成粒度在約10-200nm之間，優選地50-150nm且最優選地80-120nm。在此粒度範圍的脂質體已顯示能夠通過存在於腫瘤血管的內皮細胞內襯中存在的"間隙，，i^肺瘤(Yuan等人，1995)。在一個實施方案中，從式I化合物中選擇治療劑。式I化合物及其鹽具有有價值的藥理學性質。特別地，它們對溫血動物的鈣代謝有顯著的調控作用。更特別地，在大鼠中它們起到顯著的骨吸收的抑制作用，如在ActaEndrocinol.78，613-24(1975)中描述的試驗方法中證實的，通過在皮下施用劑量範圍從約0.01至1.0mg/kg後PTH-謙導的血清鉀水平的升高的方法，以及在TPTX(曱狀腺曱狀旁腺切除的)大鼠模型中通過皮下施用劑量約0.0003至l.Omg後維生素D3誘導的高釣血症的方法。由Walker256肺瘤誘導的腫瘤鈣血症在口服施用約1.0至100mg/kg的劑量後被同樣地抑制。另外，在根據Newbould，Brit.J.Pharmacology21，127(1963)和根據Kaibara等人，J.Exp.Med.159，1388-96(1984)的試驗方法中，當以約0.001至l.Omg/kg的劑量皮下施用時，式I的化合物及其鹽對有佐劑性關節炎的大鼠中的關節炎病症的發展產生顯著的抑制作用。它們因此特別地適合用作治療與釣代謝損傷相關疾病的藥物，例如關節的炎性病症、關節軟骨中的退行性過程、骨質疏鬆症、牙周炎、甲狀旁腺機能亢進、及血管和假體植入物中的釣沉積。在觀察到難溶性鉤鹽異常沉積的疾病如關節炎疾病例如強直性脊柱炎、神經炎、滑嚢炎、牙周炎和跟腱炎、纖維發育不良、骨關節病或動脈硬化，以及硬的身體組織的異常分解作用是主要症狀的那些疾病，例如遺傳性低磷脂酶症、關節軟骨的退行性狀態、不同種源的骨質疏鬆症、派傑氏病和骨營養不良性纖維化、及腫瘤誘導的溶骨性病症的治療中亦實現有利的結果。在脂質體施用後，例如，靜脈施用，及在充足的時間消逝後以允許脂質體分布至個體並外滲至肺瘤內，脂質體的親和部分提供結合和內化至粑細胞中。在一個實施方案中，親水表面衣層通過pH敏感性連接與脂質體連接，並且是在脂質體滲漏至腫瘤內後，由於腫瘤區域的低氧特性連接被斷開。從上文中，可以理解本發明的各種特性和目標是如何達到的。本發明的脂質體提供了靶向脂質體的方法。親水表面衣層減少了脂質體的吸收，實現長血液循環時間用於脂質體的分布。在分布後，與脂質體連接的親和部分允許與靶的多價顯露和結合。以下實施例闡釋了本發明的脂質體的製備、表徵、和使用。實施例絕對不是限制本發明的範圍。儘管本發明已描述了有關特別的實施方案，對本領域的技術人員顯然了解可進行各種變化和改變而不偏離本發明。實施例1770|Limol的磷脂醯膽鹼和330pmol的膽固醇溶解於二氯甲烷中。攪拌這些混合物以^^溶劑在真空下約36X:揮發以形成薄的乾燥的脂質膜。向該混合物中，加入唑來膦酸(110pmol)的15ml的蔗糖溶液並渦旋。單室脂質體通過使用超聲儀製備。藥物包嚢的效率是通過在適當的水相溶劑中透析一份脂質體過夜或在200,000xg下離心一份脂質體2小時測定的。之後脂質體部分溶於甲醇中，並通過標準方法使用高效液相色譜(HPLC)，諸如反相HPLC進行分析。實施例2將脂質(二硬脂醯磷脂醯膽鹼、聚甘油、膽固醇)溶於二氯甲烷中。該脂質溶液使用旋轉蒸發儀在真空下蒸發。在蒸發後，脂質殘渣在乾燥器中進一步乾燥過夜。唑來膦酸、蔗糖和氯化鈉溶解於去離子水中以達到所需的批濃度。然後，乾燥的脂質殘渣在唑來膦酸、蔗糖/NaCl溶液中被水化以形成多室脂質體(MLV)。通過0.2nm和O.linm的聚碳酸酯濾器擠壓降低MLV的粒度。5毫升的最終製劑填裝至玻璃小瓶並使用VIRTIS凍幹儀凍幹。凍幹的脂質體唑來膦酸在施用給個體前用鈣緩衝液重溶。實施例3陽離子磷脂、DPPC、葉酸-PEG-DSPE、膽固醇溶解於乙醇中。脂質醇混合物然後被^L在唑來膦^/蔗糖溶液中。大批的脂質體唑來膦酸然後通過0.2nM和0.1pM聚碳酸酯濾器擠出。在粒度降低後，然後將產物加熱至40'C在真空下蒸發掉有機溶劑然後通過0.22|uM濾器無菌過濾並凍幹。由HPLC法測定的藥物包封效率為約50%。實施例4將DSPC、PEG-膽固醇、葉酸-PEG-膽固醇溶解於乙醇中。脂質醇混合物然後分散在唑來膦酸/蔗糖溶液中。大批的脂質體唑來膦酸然後通過0.2|nM和O.lpM聚碳酸酯濾器擠出。在粒度降低後，然後將產物加熱至40。C在真空下蒸發掉有機溶劑並通過0.22jtM濾器無菌過濾並凍幹。權利要求1.給哺乳動物個體施用治療劑的方法，其包括給所述的個體全身施用包含含有治療劑的二價陽離子骨架的脂質體組合物。2.權利要求l的方法，其中所述的治療劑是水溶性的。3.權利要求2的方法，其中所述的治療劑是式I化合物和其可藥用鹽formulaseeoriginaldocumentpage2其中Rl是包含如2至4個N-原子或1或2個N-原子以及1個O-或S-原子的雜原子的5-元雜芳基，且其是未取代的或被低級烷基、苯基或被低級烷基、低級烷氧基和/或卣素取代的苯基、或被低級烷氧基、羥基、二-低級烷基氨基、低級烷硫基和/或卣素C-取代的、和/或在能夠被低級烷基、低級烷氧基和/或卣素取代的N-原子處N-取代，且R2是氫、羥基、氨基、低級烷石危基或離素。4.權利要求3的方法，其中所述的治療劑是唑來膦酸。5.權利要求l的方法，其中所述的二價陽離子骨架包含二價陽離子，諸如釣離子、鋅陽離子或鎂陽離子。6.權利要求l的方法，其中所述的二價陽離子骨架包含陽離子脂質。7.權利要求1的方法，其中所述的脂質體組合物具有約10至約500納米的平均粒度。8.權利要求1的方法，其中所述的脂質體組合物還包含親水性聚合物。9.權利要求l的方法，其中所述的脂質體組合物還包含親和性部分。10.給哺乳動物個體施用治療劑的方法，其包括給所述的個體全身施用包含含有治療劑的二價陽離子骨架的脂質體組合物。11.權利要求10的施用治療劑至靶細胞的方法，其中所述的親和性部分是有效地特異性與在靶細胞上的細胞表面受體結合的配體，且所述的脂質體還包含包封形式的治療劑。12.權利要求10的方法，其中所述的親和性部分有效地特異性地與胂瘤特異性抗原結合。13.權利要求10的方法，其中所述的治療劑是水溶性的。14.權利要求10的方法，其中所述的治療劑是式I化合物和其可藥用鹽formulaseeoriginaldocumentpage3其中Rl是包含如2至4個N-原子或1或2個N-原子以及1個O-或S-原子的雜原子的5-元雜芳基，且其是未取代的或被低級烷基、苯基或被低級烷基、低級烷氧基和/或卣素取代的苯基、或被低級烷氧基、羥基、二-低級烷基氨基、低級烷硫基和/或囟素C-取代、和/或在能夠被低級烷基、低級烷氧基和/或卣素取代的N-原子處N-取代，且R2是氫、羥基、氨基、低級烷硫基或卣素。15.斥又利要求10的方法，其中所述的治療劑是唑來膦酸。16.權利要求10的方法,其中所述的二價陽離子骨架包含二價陽離子，諸如釣離子、鋅陽離子或鎂陽離子。17.權利要求10的方法，其中所述的二價陽離子骨架包含陽離子脂質。18.權利要求10的方法，其中所述的脂質體組合物具有約10至約500納米的平均粒度。19.權利要求10的方法，其中所述的脂質體組合物還包含親水性聚合物。20.權利要求10的方法，其中所述的脂質體組合物還包含親和性部分。21.脂質體組合物，其包含含有治療劑的二價陽離子骨架。22.權利要求21的組合物，其中所述的治療劑是水溶性的。23.權利要求21的組合物，其中所述的治療劑是式I化合物和其可藥用鹽formulaseeoriginaldocumentpage0其中Rl是包含如2至4個N-原子或1或2個N-原子以及1個O-或S-原子的雜原子的5-元雜芳基，且其是未取代的或被低級烷基、苯基或被低級烷基、低級烷氧基和/或閨素取代的苯基、或被低級烷氧基、羥基、二-低級烷基M、低級烷硫基和/或卣素C-取代、和/或在能夠被低級烷基、低級烷氧基和/或滷素取代的N-原子處N-取代，且R2是氫、羥基、氨基、低級烷硫基或卣素。24.權利要求21的組合物，其中所述的治療劑是唑來膦酸。25.權利要求21的組合物，其中所述的二價陽離子骨架包含二價陽離子，諸如鈣離子、鋅陽離子或鎂陽離子。26.權利要求21的方法，其中所述的脂質體組合物還包含親水性聚合物。27.權利要求21的方法，其中所述的脂質體組合物還包含親和性部分。28.脂質體組合物，其包含(a)治療劑；(b)二價陽離子骨架；(c)親水性聚合物衣層；和(d)任選的親和性部分。29.權利要求28的脂質體組合物，其中所述的親和性部分是有效地特異性與在乾表面上的細胞表面受體結合的配體。30.權利要求28的脂質體組合物，其中所述的親和性部分有效地特異性地與肺瘤特異性抗原結合。31.權利要求28的脂質體組合物，其中所述的治療劑是水溶性的。32.權利要求28的脂質體組合物，其中所述的治療劑是式I化合物和其可藥用鹽formulaseeoriginaldocumentpage5其中Rl是包含如2至4個N-原子或1或2個N-原子以及1個O-或S-原子的雜原子的5-元雜芳基，且其是未取代的或被低級烷基、苯基或被低級烷基、低級烷氧基和/或卣素取代的苯基、或被低級烷氧基、羥基、二-低級烷基氨基、低級烷硫基和/或滷素C-取代、和/或在能夠被低級烷基、低級烷氧基和/或滷素取代的N-原子處N-取代，且R2是氫、羥基、氨基、低級烷硫基或卣素。33.權利要求28的脂質體組合物，其中所述的治療劑是唑來膦酸。34.權利要求28的脂質體組合物，其中所述的二價陽離子骨架包含二價陽離子，諸如鈣離子、鋅陽離子或鎂陽離子。35.權利要求28的脂質體組合物，其中所述的二價陽離子骨架包含陽離子脂質。36.權利要求28的脂質體組合物，其中所述的脂質體組合物具有約10至約500納米的平均粒度。全文摘要公開了哺乳動物個體的基於脂質體的治療方法。所述的方法使用脂質體和/或具有含有與治療所靶向的生物表面有效地特異性結合的親和性部分的外表面的脂質體和親水性聚合物衣層。親水性聚合物衣層由與表面脂質成分共價連接的聚合物鏈組成。在所需的脂質體生物分布實現後，親和劑結合於靶表面並幫助脂質體的內化。文檔編號A61K31/662GK101252912SQ200680031484公開日2008年8月27日申請日期2006年8月31日優先權日2005年9月1日發明者J·奧戈爾卡,J·張,S·庫馬爾,W·江申請人:諾瓦提斯公司