分泌表達蛋白酶的酵母菌培養方法
2023-06-06 13:50:46
專利名稱：分泌表達蛋白酶的酵母菌培養方法
技術領域：
本發明涉及一種分泌表達蛋白酶的酵母菌培養方法。
背景技術：
低聚甘露糖和低聚木糖因其雙歧因子效果好而被認為是功能低聚糖中的高端產品。木聚 糖酶和甘露聚糖酶是規模化生產這兩種低聚糖所必須的生物酶。為獲得高活性的木聚糖酶和甘露聚糖酶，人們嘗試了多種方式，特別是應用基因工程手 段，獲得各種重組菌株，來表達分泌酶蛋白。公開的文獻報導中，應用較多的是芽孢桿菌。近年來，有人採用畢赤酵母菌(Pp"^on;s')表達甘露聚糖酶和木聚糖酶。如文獻l應用重組 菌屍戸加化GS115-Atx製備木聚糖酶，認為以麩皮、牛肉膏等組成的有機培養基在甲醇誘導 並補加0.5%甘油，可以獲得最佳效果。文獻2、 3報導了甘露聚糖酶基因克隆在畢赤酵母中 的分泌表達。眾所周知，畢赤酵母(戶p氾tor&)屬於甲醇營養型酵母菌，能以甲醇為碳源生長，且表 達異源基因效率高，既具有原核表達系統操作簡單、表達高效、易於調控等特點，還具有真 核細胞特有的蛋白質修飾功能，在表達真核生物蛋白質方面具有獨特優越性，近年來受到廣 泛的關注。利用這類甲醇營養型酵母菌，特別是引入外源基因的重組甲醇營養型酵母菌，經 發酵培養，可以獲得多種蛋白酶及多肽的分泌表達，如文獻1 6所述的木聚糖酶、a-澱粉酶、 藻藍蛋白、重組人白介素ll、重組腸激酶、植酸酶等。高密度發酵是提高發酵產品、產量的--個非常有效的手段。為提高蛋白酶的分泌表達量 和提高蛋白酶活性，人們嘗試了多種方式，包括培養基的選擇、發酵工藝的改進等。除前述 文獻外，也有一些酵母菌培養工藝方面的研究報導。如文獻4利用甘油做碳源，待酵母菌生 長到一定生物量後，再使用甲醇誘導，表達藻藍蛋白，發酵期間根據甘油濃度、細胞乾重、 細胞光密度和藻藍蛋白含量的變化進行調控；文獻5在用巴斯德畢赤酵母工程菌Gsl15 /phyA n發酵製備植酸酶，採用了逐漸增加葡萄糖的補加方式來控制溶氧和還原糖濃度；文獻6在 畢赤酵母表達重組人白介素(rhIL-ll)的發酵過程中研究了間歇法、分批補料法和恆甲醇濃 度法，認為通過檢測甲醇濃度來控制甲醇補料可以使菌濃和rhIL-ll表達濃度達到最大；文獻 7則認為，在植酸酶發酵過程中，甲醇的變速補料方式為最優；文獻8用控制甲醇流加體積 為終體積分數l .0% 3 .0%的方式實現重組腸激酶在甲醇酵母中的高效衷達；而文獻9在 重組人血清白蛋白(rHSA) Pp^tor/表達系統中，研究了高密度培養時細胞生長、改變碳源 和誘導表達時溶氧的變化和調控規律，提出高密度培養時應通過流加底物速度、攪拌轉速、 通氣量和富氧培養來關聯控制發酵液溶氧水平。另外，文獻10提出了一種重組嗜甲醇酵母(特別是巴斯德畢赤酵母)發酵的改進方法， 即在重組嗜甲醇酵母外源基因產物的誘導表達階段，採用短碳鏈有機酸替代甘油，流加短碳 鏈有機酸一甲醇混合碳源，以促進菌體的生長和誘導外源基因的表達；文獻ll針對重組甲醇 營養型酵母發酵製備植酸酶，提出了採用了價格低廉的碳源、氮源以及變pH發酵技術實現 植酸酶的高密度表達，其變pH發酵技術通過在發酵前後的兩個階段改變碳源來實現。研究表明，重組畢赤酵母的高菌體密度發酵過程一般為二個階段菌體生長階段和蛋白 酶分泌表達階段。在菌體生長階段，酵母菌利用培養基中的碳源生長，待碳源完全消耗後進 入蛋白酶的分泌表達階段，此時，需要流加誘導碳源以誘導外源基因的表達。對於重組甲醇 營養型畢赤酵母來說，甲醇既是誘導劑又是碳源。然而，在已有的技術中，對於甲醇流加補料的控制方式，或者採用分批定量補加、或者 採樣檢測發酵液內補加料的含量、或者根據菌體濃度通過關聯攪拌轉速和通氣量來調節甲醇 的流加速度、富氧培養來關聯控制發酵液溶氧水平，並且多採用有機培養基。這些方式，在 實際發酵運行中，難以做到實時監控，採樣和工藝調整之間存在較長吋間的延遲，且操作煩 瑣、運行成本也比較高，難以發揮達到發酵工藝的最佳效果。而對於木聚糖酶或甘露聚糖酶的低成本高效分泌表達，目前尚缺少相應的技術。 參考文獻1劉明啟，等，重組畢赤酵母產木聚糖酶條件的優化[J],浙江大學學報(農業與生命科學版)， 2006， 022韋躍華，等，裡氏木黴內切-日-甘露聚糖酶基因在畢赤酵母中的表達，生物工程學報，2005， 113譚秀華，等，耐鹼性甘露聚糖酶基因的克隆及其在畢赤酵母中的表達，微生物學報，2005， 84勵建榮，等，重組巴斯德畢赤酵母工程菌發酵生產藻藍蛋白的研究[J]，中國食品學報，2006， 055葉冰，等，植酸酶畢赤酵母基因工程菌高密度發酵[J]，大連輕工業學院學報，2002， 03 6孫瑛，等，甲醇誘導模式對重組人白介素11發酵的影響[J]，生物技術，2006， 05 7李洪淼，等，重組巴斯德畢赤酵母高密度發酵表達植酸酶[J],中國生物工程雜誌，2005， Sl8談寧馨，等，重組腸激酶在甲醇酵母中高效表達的培養條件研究[J],蘭州大學學報(自然 科學版)，2003， 049周長林，等，重組Pichia pastori高密度培養和表達過程的溶氧調控[J]，藥物生物技術，2006， 010 ZL 03116034.4， 一種重組嗜甲醇酵母的發酵方法
發明內容
本發明基於前述事實，提出了一種分泌表達蛋白酶的酵母菌培養方法，用於重組甲醇營 養型畢赤酵母菌發酵製備蛋白酶，特別是甘露聚糖酶和木聚糖酶。本發明的技術方案是這樣實現的酵母菌的發酵培養基採用無機鹽培養基，其中包含有如下離子Cu2+、 Na+、 Mn2+、 Fe2+、 Zn2+、 Co3+、 K+、 Ca2+、 r、 CL.、 H十，和如下基團S042-、 M04—、 B033-、 OH—、 NH3—、 HP032—、 H2P03—、 P033—，以及葡萄糖、甘油、甲醇和氨水。發酵 培養包括酵母菌的生長期和蛋白酶的分泌表達期，兩個期分別使用不同的碳源，生長期以葡 萄糖或者甘油為碳源，以氨水為氮源，分泌表達期使用甲醇為碳源。在分泌表達期內，根據 發酵液溶氧值變化實時控制甲醇的流加補料，當溶氧值升高時流加甲醇，當溶氧值降低時停 止流加甲醇，同時用氨水調節發酵液pH值，可以使控制方式簡便、準確、即時，從而實現 蛋白酶的高效表達。本發明的優化技術方案是這樣的畢赤酵母菌優化的發酵培養基是基於如下成分與含量lL發酵液中主要含有硫酸鎂1.0 10.0g、硫酸鈣0.1 1.0g、硫酸氨1.0 10.0g、硫酸亞鐵0.02 0.20g、氫氧化鉀2.0 20.0g、磷酸3 30mL、葡萄糖/甘油3.0 30.0g,和硫酸銅0.05 0.50mg、 碘化鈉0.08 0.80mg、鉬酸鈉0.15 1.50mg、硫酸錳2.0 20.0mg、氯化鈷0.5 5.0mg、硼酸 0.02 0.20mg、硫酸鋅5.0 50.0mg，濃硫酸0.01 0.05mL、生物素0.2 2.0mg、氨節青黴素 5.0 50.0mg，以及甲醇和氨水。其中，氨水用來調節發酵過程中pH值，甲醇用於分泌表達 期的流加補料，流加補料的方式是通過發酵液溶氧值變化來進行實時控制，當溶氧值升高至 60%以上時開始流加甲醇，當溶氧值降低至10%以下時停止流加甲醇，此間，攪拌轉速、通 氣量等其它相關的發酵參數不隨之做實時調整。在發酵結束前，先停止甲醇流加，並在溶氧 值100X的情況下維持2 4h,再結束髮酵。本發明具體操作歩驟如下 (1)菌種培養，配製發酵培養基，接種前準備，接種。菌種培養過程如下從YPD上挑2 3個菌落到BMGY的一級種子培養基中培養12 24h，菌體OD6oo達至U 1.0，得到培養液；再取上述培養液到二級種子培養基BMGY中培養12 24h，菌體OD,達到7.0，即得到上罐種子液。配製發酵培養基過程如下以1L發酵液計算,先稱取微量無機鹽成分，包括硫酸銅0.05 0.50mg、碘化鈉0.08 0.80mg、鉬酸鈉0.15 1.50mg、硫酸錳2.0 20.0mg、氯化鈷0.5 5.0mg、 硼酸0.02 0.20mg、硫酸鋅5.0 50.0mg，加水溶解後配至100 200mL後加入濃硫酸0.01 0.05mL;再稱取主要無機鹽成分，包括硫酸鎂1.0 10.0g、硫酸鈣0.1 1.0g、硫酸氨1.0 10.0g、硫酸亞鐵0.02 0.20g、氫氧化鉀2.0 20.0g，加水溶解後配至500 600mL後加入磷酸3 30mL;上述兩組成分配製液混合後，加入葡萄糖/甘油3.0 30.0g、生物素0.2 2.0mg、氨 苄青黴素5.0 50.0mg，加水配至950mL， 12rC滅菌20min，冷卻待用。接種前的準備包括發酵罐系統及相關器械滅菌，連接好消泡劑和待流加的氨水、甲醇， 進行pH、溶氧電極校正。校.iH溶氧值為100%時，攪拌轉速、空氣流量及罐壓均取發酵過程 中的最大值參數值。在火焰圈保護下，接種上罐種子液，接種量為3 10%,控制pH6.0土0.05，調節發酵工 藝參數為預定值。(2) 生長期以葡萄糖或者甘油做為碳源， 一次性加入，按照預先設定的條件調整攪拌轉速和通氣量，培養12 24h。此時，發酵液溶氧值上升至80%以上，直至達到100%，菌濃 達到8% (W/V)以上。(3) 分泌表達期開始流加甲醇，用溶氧值進行實時調控，當發酵液溶氧值低於10% 時，停止流加甲醇；當溶氧值回升至60%以上時，開始流加甲醇。如此反覆。此間，攪拌轉 速和通氣量等發酵參數可以按照事先的預定和發酵的實際情況進行調整，不隨溶氧值調控甲 醇流加而變化。(4) 發酵過程中，用氨水調控發酵液pH值，控制為pH5.8 6.0，使用消泡劑對發酵液 進行消泡。(5) 下罐發酵結束前，先停止甲醇流加，在溶氧值100%的情況下維持2 4h，再結 束髮酵。發酵液用通用的方法分離出菌體後，用常規的純化方法，即可得到含有目的產物一 一蛋白酶液。與現有技術相比，本發明具有培養成本低廉、反應控制方式簡便準確、蛋白酶表達活性 高的特點。具體實施例下面結合實施例，對本發明作進一步說明。實施例的具體描述，對本發明的範圍不構成 任何限制。實施例1畢赤酵母發酵製備甘露聚糖酶所用的菌株為P. pastoris GS115/poly-man-B3，由廣州伯凱生物技術有限公司構建。從YPD上挑2—3個菌落到BMGY的一級種子培養基(300mL三角瓶裝30mL)中培養16h左右，菌體OD6oo達到1.0，再取2mL上述培養液到BMGY的二級種子培養基(10隻500mL三角瓶裝50mL)中培養16h，菌體0D6(X)達到7.0。以1L發酵液計算，先稱取微量無機鹽成分，包括硫酸銅0.08mg、碘化鈉0.12mg、鉬酸鈉0.45mg、硫酸錳8.0mg、氯化鈷1.5mg、硼酸0.08mg、硫酸鋅10mg，加水溶解後配至150mL 後加入濃硫酸0.05mL;再稱取主要無機鹽成分，包括硫酸鎂6.0g、硫酸鈣0.6g、硫酸氨4.0g、 硫酸亞鐵0.10g、氫氧化鉀8.0g，加水溶解後配至600mL後加入磷酸10mL;上述兩組成分配 制液混合後，加入葡萄糖12.0g、生物素0.8mg、氨苄青黴素10.0mg，加水配至950mL， 121 "滅菌20min，冷卻待用。裝好pH、溶氧及消泡電極，將上述培養基倒入發酵罐中，12rC下滅菌20min，連接好 消泡劑和待流加的氨水、甲醇，進行溶氧電極校正。校正溶氧值為100%時，攪拌轉速、空 氣流量及罐壓均取發酵過程中的最大值參數值。在火焰圈保護下，接種上罐種子液，接種量為3 5%，控制pH6.0士0.05,調節發酵工 藝參數為預定值通風量3L/min，攪拌轉速330r/min、罐壓0.4個大氣壓、培養溫度30。C。菌體經過一段時間適應期後進入對數生長期，此間，菌體以葡萄糖做為碳源，發酵液pH 用流加氨水來自動調控在6.0±0.05，使用消泡劑對發酵液進行消泡。培養18 24h，此時， 發酵液溶氧值上升至80%以上，直至達到100%，菌濃達到8% (W/V)以上。此時，開始流加甲醇，用溶氧值進行實時調控，設定調控範圍為當發酵液溶氧值低於 10%時，停止流加甲醇；當溶氧值回升至60%以上時，開始流加甲醇。如此反覆。此間，攪 拌轉速、通氣量、溫度及罐壓按照事先的預定和發酵的實際情況進行調整，不隨溶氧值調控 甲醇流加而變化，發酵液pH值用氨水自動調控在6.0 ± 0.05 。發酵進行96 120h後，可以結束。結束前，先停止甲醇流加，在溶氧值100%的情況下 維持2h，再結束髮酵。下罐後的發酵液分離出菌體，檢測清液中的甘露聚糖酶活性，酶活達到18000U/mL。每分鐘生成lmiK)LD-甘露糖所需的酶量定義為一個酶活單位(U)。實施例2畢赤酵母發酵製備木聚糖酶所用的菌株為P. pastoris GS115/poly-xyl-B5，由廣州伯凱生物技術有限公司構建。 用BMGY的培養基完成種子培養後，按照3 5%的接種量接種發酵罐。發酵培養基同 前。滅菌，連接好消泡劑和待流加的氨水、甲醇，進行溶氧電極校正。在3L/min， 330r/min、 30'C下發酵。生長期內，菌體以葡萄糖做為碳源。培養18 24h後，發酵液溶氧值上升至80 %以上，此時，開始流加甲醇，用溶氧值進行實時調控，設定調控範圍為當發酵液溶氧值 低於10%時，停止流加甲醇；當溶氧值回升至60%以上時，開始流加甲醇。發酵液pH值用 氨水自動調控在6.0±0.05。發酵進行96h後，先停止甲醇流加，在溶氧值100%的情況下維 持2h，再下罐，分離出菌體後，檢測清液中的木聚糖酶活性，酶活達到12000U/mL。每分鐘 生成lpmoL木糖所需的酶量定義為一個酶活單位(U)。 _
權利要求
1. 一種分泌表達蛋白酶的酵母菌培養方法其特徵在於採用無機鹽培養基對甲醇營養型酵母進行發酵培養，發酵培養包括酵母菌的生長期和蛋白酶的分泌表達期，在蛋白酶的分泌表達期內根據發酵液溶氧值變化實時控制甲醇的流加補料，用氨水調節發酵液pH值，從而實現白酶的高效表達。
2. 如權利要求1所述，其特徵在於所述無機鹽培養基中包含有如下離子Cu2+、 Na+、 Mg2+、 Mn2+、 Fe2+、 Zn2+、 Co3+、 K+、 Ca2+、 I—、 CU、 H+，和如下基團S042—、 M(V、 B033—、 OH—、 NH3+、 HP032-、 H2P03-、 PO -，以及葡萄糖、甘油、甲醇和氨水。
3. 如權利要求l所述，其特徵在於所述的發酵培養的兩個期使用不同的碳源，酵母菌的 生長期使用的碳源是葡萄糖或者甘油或者是兩種的混合物，蛋白酶的分泌表達期使用的碳源 是甲醇。
4. 如權利要求1所述，其特徵在於所述的甲醇流加補料方式是根據發酵液溶氧值變化來 進行實時控制，當溶氧值升高時流加甲醇，當溶氧值降低時停止流加甲醇。
5. 如權利要求1和2所述，其特徵在於所述的無機鹽培養基以氨水為氮源、並以氨水來 調節發酵液的pH值，以葡萄糖、甘油和甲醇為碳源。
6. 如權利要求1和2所述，其特徵在於所述的優化的培養基是基於如下成分與含量1L 發酵液中主要含有硫酸鎂1.0 10.0g、硫酸鈣0.1 1.0g、硫酸氨1.0 10.0g、硫酸亞鐵0.02 0.20g、氫氧化鉀2.0 20.0g、磷酸3 30mL、葡萄糖/甘油3.0 30.0g，和硫酸銅0.05 0.50mg、 碘化鈉0.08 0.80mg、鉬酸鈉0.15 1.50mg、硫酸錳2.0 20.0mg、氯化鈷0.5 5.0mg、硼酸 0.02 0.20mg、硫酸鋅5.0 50.0mg，濃硫酸0.01 0.05mL、生物素0.2 2.0mg、氨節青黴素 5.0 50.0mg，以及甲醇和氨水。
7. 如權利要求1和4所述，其特徵在於所述的甲醇流加補料方式是根據發酵液溶氧值變 化來進行實時控制，當溶氧值升高至60%以上時開始流加甲醇，當溶氧值降低至10%以下時 停止流加甲醇。
8. 如權利要求l，其特徵在於所述的優化的甲醇營養型酵母菌為畢赤酵母菌，可以是野 生型的，也可以是重組型的。
9. 如權利要求l，其特徵在於所述的培養方法，可以用於蛋白酶的分泌表達，特別是木 聚糖酶和甘露聚糖酶的分泌表達。
全文摘要
本發明提供了一種分泌表達蛋白酶的酵母菌培養方法，其特徵在於採用無機鹽培養基對重組甲醇營養型酵母進行發酵培養，發酵培養包括酵母菌的生長期和蛋白酶的分泌表達期，在蛋白酶的分泌表達期內根據發酵液溶氧值變化實時控制甲醇的流加補料，用氨水調節發酵液pH值，從而實現蛋白酶的高效表達。與現有技術相比，本發明具有培養成本低廉、反應控制方式簡便準確、蛋白酶表達活性高的特點。
文檔編號C12N1/32GK101270339SQ200710027210
公開日2008年9月24日 申請日期2007年3月20日 優先權日2007年3月20日
發明者吳道貧, 雷 張, 王玉亭 申請人:廣州伯凱生物技術有限公司;華南理工大學