一種玉米wip1基因啟動子及其應用的製作方法
2023-06-06 11:39:56 3
專利名稱：一種玉米wip1基因啟動子及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於植物基因工程領域，具體涉及一種玉米wipl基因啟動子及其應用。
背景技術：
植物啟動子控制植物基因的表達。外源基因在轉基因植物中的表達強度也取決於外源基因前面的啟動子強度。啟動子可分為組成型、誘導型和組織特異啟動子。組成型啟動子可以使基因在植物中的所有部位和不同發育階段都表達。目前應用最為廣泛的此類啟動子包括來自菸草花葉病毒的355啟動子、玉米泛素基因的WDiquitin啟動子、水稻肌動蛋白基因的Actin啟動子。組織特異啟動子使目的基因僅在植物特定的器官或組織表達， 如玉米加13啟動子使目的基因僅在花粉中表達(Hanson DD et al.，1989)。誘導型啟動子在信號刺激下而具有轉錄活性。RD29A啟動子能夠驅動目的基因在乾旱等脅迫條件下的表達，廣泛應用於抗逆植物基因工程(Yamaguchi-Shinozaki，K. &Shinozaki, K.，1993).隨著抗病蟲基因越來越多的應用於農作物，使得作物產量得到了大幅度的提高。為了提高這些抗病蟲基因在轉基因作物中的表達，多是使用異源組成型啟動子調控表達，比如CaMV35S， 因此直接從禾穀類作物克隆高效表達的啟動子具有重要的應用價值。目前自然界共發現四大類蛋白酶抑制劑，包括絲氨酸蛋白酶抑制劑、巰基蛋白酶抑制劑、金屬蛋白酶抑制劑和酸性蛋白酶抑制劑。其中絲氨酸蛋白酶抑制劑又可分為 Kunitz, Bowman-Birk, PI-I和PI-II四個家族。Bowman-Birk族的獨特分子特徵是其分子中有兩個獨立的結合位點。玉米的一個基因wipl (wound-induced protein)是從玉米胚芽鞘cDNA的差顯庫裡篩選得到的一個基因，受傷誘導表達，同各種Bowman-Birk族蛋白有 30%的同源性(Rohrmeier T and Lehle L，1993)。該基因在創傷誘導15min時開始表達， 60min表達達到頂峰，不受3，5-D，ABA, BAP, IAA和methyl jasmonate脅迫誘導，在胚芽鞘中試驗，發現受傷之後，信號從受傷處向上傳遞(Eckelkamp C et al.，1993)。目前在植物基因工程中所用的、能較強地啟動基因轉錄的啟動子主要局限於花椰菜花葉病毒35S啟動子、水稻actin啟動子和玉米ubiquitin啟動子。進行多基因轉化時使用相同的啟動子容易產生基因沉默。需要發掘更多的具有強活性的啟動子，以進行植物遺傳操作。而發掘植物源性的啟動子，特別是親緣關係較近的啟動子，在植物體內啟動基因表達直至產生基因產物就顯得尤為重要。
發明內容
為了解決上述問題，本發明的目的在於提供一種具有高效啟動活性的玉米wipl 基因啟動子Zmpwipl及其應用。本發明啟動子的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，序列全長1442bp。根據植物順式調控元件資料庫(PLACE)的搜索，本發明所提供的啟動子區域含有多個TATA box.ff box 禾口 GCC boxο本發明技術人員應當理解根據SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列，對其替換、缺失或增加一個或幾個核苷酸，獲得具有相同功能的核苷酸序列，例如，在非應答元件或作用元件，替換一個或幾個鹼基。本領域技術人員還可以根據SEQ ID No. 1的序列獲得啟動基因表達的DNA功能片段。因此，本發明所述的啟動子還包括SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列經替換、缺失或增加一個或幾個核苷酸，如將SEQ ID No. 1所示的序列的5』端缺失掉約200bp， 而衍生的具有控制基因表達的DNA功能片段。本領域技術人員可以理解的是，本發明的啟動子還包括由SEQ ID No. 1產生的具有相同功能的DNA片段。所述的具有相同功能的DNA片段核苷酸序列與SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列的同源性至少大於90%、甚至95%、甚至98%的衍生的具有啟動子基本元件，能啟動基因表達的DNA片段。在本發明的一個實施方案中，將SEQ ID No. 1所示的序列分別進行5』端的IMbp、 211bp或511bp的缺失，而獲得具有啟動子功能的衍生出的啟動子。本領域技術人員可以將本發明啟動子用於構建表達載體。此外還可以將目的基因可操作地連接到本發明的啟動子之下，構建得到表達盒，進一步可將該表達盒導入植物表達載體，獲得重組表達載體。因此，本發明還包括由上述啟動子構建的表達盒，以及含有上述表達載體或表達盒的表達載體或重組載體。本發明啟動子可以用於製備轉基因植物。比如，通過農桿菌介導、基因槍法以及花粉管通道等方式獲得轉基因植物。從而可以通過引入抗蟲、抗病等基因，培育出抗蟲、抗病植物，提高植物抗蟲和/或抗病活性。本發明的啟動子可用於製備本領域公知的轉基因植物，用於控制外源或內源基因的表達，所述植物可為雙子葉植物或單子葉植物，優選的植物為單子葉植物，更優選為玉米、水稻、小麥、高粱等單子葉植物，最優選為玉米。將本發明的各個啟動子構建成GUS融合表達載體，並轉化菸草和擬南芥。GUS組織化學染色和GUS酶活性的測定結果均表明，本發明提供的啟動子能啟動GUS基因的表達，具有啟動子活性。
圖1為玉米wipl啟動子的PCR擴增。圖2為含玉米wipl啟動子表達載體構建圖。圖3為ZmWipl啟動子缺失片段示意圖。圖4為生長4周的轉基因擬南芥葉片⑶S染色分析結果。圖5為生長4周的轉基因擬南芥中的⑶S活性的定量分析結果。圖6為生長4周的轉基因菸草⑶S染色分析結果
具體實施例方式以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。實施例1玉米wipl啟動子克隆及序列分析將GenBank登錄的Zmwipl基因的序列(登錄號X71396)在maizesequence網站上進行比對分析，得到包含此基因序列的Bac序列AC206573。根據此Bac序列設計引物擴增 Zmwipl的啟動子序列。設計引物為正向引物5' ATCTGCAGGGCTCCGTTCTACTTGACT 3' (SEQ ID No. 3) ,5'端引入PstI 酶切位點，反向引物5' TGGATCCGGTCTCGGACGAGCTGTTCTT3『 (SEQ ID No. 4),5'端引入BamHl酶切位點。通過PCR擴增從玉米自交系綜31的基因組DNA 上擴增Zmwipl基因的啟動子序列，得到1737bp PCR產物(圖1)，測序後的序列如SEQ ID No. 2所示。PCR反應體系
ddH20
10 xPCR緩衝液 dNTP(lOmM) 上遊引物(10 μΜ)下遊引物(10 μΜ)
權利要求
1.一種玉米Wipl基因啟動子，其為DSEQ ID No. 1所示的核苷酸組成的DNA片段；或2) SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列經替換、缺失或增加一個或幾個核苷酸，由1)衍生的具有啟動基因表達的DNA功能片段。
2.根據權利要求1所述的啟動子，其特徵在於，所述的DNA功能片段為SEQID No. 1所示的核苷酸序列5，端缺失lMbp、211bp或511bp所衍生的DNA片段。
3.含有權利要求1或2所述啟動子構建的表達盒。
4.含有權利要求1或2所述啟動子的植物表達載體。
5.權利要求1或2所述的啟動子在製備轉基因植物中的應用。
6.根據權利要求5所述的應用，其特徵在於，所述植物為單子葉植物。
7.根據權利要求6所述的應用，其特徵在於，所述的植物為玉米、水稻、小麥、大豆、高梁。
全文摘要
本發明涉及一種玉米wip1基因啟動子及其應用，該啟動子為SEQ ID No.1所示的核苷酸序列組成的DNA片段或SEQ ID No.1所示的核苷酸序列經替換、缺失或增加一個或幾個核苷酸，由1)衍生的具有啟動基因表達的DNA功能片段。轉化菸草和擬南芥試驗結果表明，本發明的啟動子可以啟動GUS基因的表達，具備啟動子活性，可應用於玉米、水稻等作物的遺傳改良和產業化研究。
文檔編號A01H5/00GK102399779SQ201110329378
公開日2012年4月4日 申請日期2011年10月26日 優先權日2011年10月26日
發明者劉允軍, 張生學, 王國英, 練雲 申請人:中國農業科學院作物科學研究所