一種己烯雌酚抗體的製備方法

2023-06-25 20:33:21 1

專利名稱：一種己烯雌酚抗體的製備方法
技術領域：
本發明涉及抗體的製備領域，具體涉及一種己烯雌酚抗體的製備方法。
背景技術：
己烯雌酚(Diethylstilbestrol，DES)是一種人工合成雌激素。化學名為1，2_雙 (4-羥苯基)-1，2_ 二乙基乙烯。其物理性質為無色結晶或白色結晶性粉末，在乙醇、乙醚、 氯仿、脂肪油或強鹼溶液中溶解，在水中幾乎不溶。化學結構見式(I)。 式(I)DES可以增加動物的體重和蛋白質沉積，而減少脂肪的沉積。在農業上曾經被用作 促生長劑。由於DES有致癌以及雌激素樣作用等毒性，我國1999年制定的《中華人民共和 國動物及動物源食品殘留監控計劃》規定豬肉及畜禽中己烯雌酚為不得檢出。DES殘留的 檢測方法主要包括理化方法和快速篩選檢測方法。篩選方法的最好選擇之一是基於DES抗 體的ELISA快速檢測試劑盒。目前用於檢測DES殘留的試劑盒大多依賴進口，價格昂貴，檢 測成本高。由於DES物質本身難溶於水、易氧化變質、代謝物與原形無交叉反應、存在順反 異構等特點，這就使得DES快速檢測ELISA試劑盒的研製存在一定困難，特別是對抗體的特 異性與親和力要求高。因此，製備抗DES高親和力的特異性抗體對於開發DES快速免疫學 檢測試劑盒非常有意義。

發明內容
本發明的目的在於根據現有己烯雌酚檢測中存在的檢測難度大、檢測成本高的問 題，提供一種己烯雌酚(DES)抗體的製備方法，通過該方法製得的己烯雌酚可用於製備己 烯雌酚快速檢測ELISA試劑盒。本發明目的通過以下技術方案予以實現一種己烯雌酚抗體的製備方法，包括如下步驟(1)己烯雌酚與4-溴丁酸己酯反 應，在己烯雌酚的一二酚羥基上引入酯鍵，經皂化水解暴露羧基，合成己烯雌酚人工半抗 原；(2)用混合酸酐法通過己烯雌酚人工半抗原與牛血清蛋白(BSA)上的氨基反應，得到己 烯雌酚人工免疫原；(3)將己烯雌酚人工免疫原與佐劑乳化後對家兔進行皮下注射，當抗 體效價穩定時放血、分離血清，得到己烯雌酚抗體；其中，首次免疫時，所用佐劑為弗氏完全 佐劑，不是首次免疫時，所用佐劑為弗氏不完全佐劑。上述製備方法步驟(3)中所述皮下注射是對家兔背部脊椎兩側多點皮下注射，所述皮下注射己烯雌酚人工免疫原的量為50μ g，0. lmL，每4周注射一次。本發明製備方法製得的己烯雌酚抗體的評價方法為間接ELISA實驗，其包被原的 製備方法是己烯雌酚與4-溴丁酸己酯反應，在己烯雌酚的一二酚羥基上引入酯鍵，經皂 化水解暴露羧基，合成己烯雌酚人工半抗原；(2)用混合酸酐法通過己烯雌酚人工半抗原 與雞卵清白蛋白(OVA)，得到己烯雌酚包被原。實驗中的二抗是辣根過氧化物酶(HRP)標記 的羊抗兔IgG，檢測底物是過氧化氫和鹽酸四甲基聯苯胺(TMB · 2HC1)。動物機體對外源物質的免疫應答要求免疫抗原必須具備T細胞表位和B細胞表 位。而己烯雌酚是小分子物質只能作為抗原決定簇而不能直接用作免疫原，需將其與大分 子載體蛋白交聯才能刺激機體產生特異性抗體。但己烯雌酚本身不溶於水而且易氧化同時 又沒有能與蛋白交聯的基團，因此需要首先合成能與蛋白交聯但又能保持己烯雌酚抗原決 定簇的半抗原。蛋白質與半抗原的交聯不僅大大增加了抗原的分子量，更重要的是利用其 強烈的免疫原性誘導動物產生免疫應答。通常蛋白質的結構越複雜，與被免疫的動物親緣 性小，免疫原性越好。由於牛血清蛋白(BSA)免疫原性高、性質穩定、溶解性好、廉價易得應 用較多，因此本發明採用BSA作為免疫原的載體蛋白。本發明的基本原理是利用一系列化學反應將己烯雌酚與免疫原性好的BSA連接， 利用BSA的免疫原性引起機體的免疫應答。己烯雌酚作為抗原決定簇被抗原遞呈細胞識別 與捕獲，並提呈給T細胞並使之活化，活化的T細胞可協助B細胞克隆活化、分裂、增殖，從 而分泌針對己烯雌酚抗原決定簇的抗體。因此本發明己烯雌酚抗體可用於製備己烯雌酚的 ELISA試劑盒。在間接ELISA檢測己烯雌酚時，用與BSA同源性遠的OVA可屏蔽BSA本身產 生的抗體的影響，保證了檢測的特異性。與現有技術相比，本發明具有如下有益效果(1)本發明己烯雌酚抗體的製備方法簡便，成本低廉，製備得到的己烯雌酚抗體的 特異性強，抗體效價高，間接ELISA實驗的效價達100萬以上，用於己烯雌酚的免疫檢測時， 易於推廣應用；(2)本發明己烯雌酚抗體的製備方法先將己烯雌酚製備成能與蛋白交聯又能保持 抗原決定簇的半抗原，再製備成抗原，解決了己烯雌酚本身不溶於水、易氧化，又沒有能與 蛋白交聯的基團的問題，合成了既能與蛋白交聯又能保持己烯雌酚抗原決定簇的半抗原， 半抗原與蛋白質交聯不僅大大增加了抗原的分子量，還利用其強烈的免疫原性誘導動物產 生免疫應答；(3)本發明製備方法使用牛血清蛋白(BSA)作為免疫原的載體蛋白，免疫原性高、 性質穩定、溶解性好、價廉易得，可降低製備己烯雌酚抗體的成本。


圖1為己烯雌酚對照品的HPLC譜圖；圖2為反應液的HPLC譜圖；圖3為產物DES-MEBE的HPLC譜圖；圖4為水解產物DES-MEBE的HPLC譜圖；
圖5為己烯雌酚人工半抗原合成路線圖；
圖6為己烯雌酚人工抗原合成路線4
圖7為己烯雌酚間接競爭ELISA標準曲線圖。
具體實施例方式以下結合實施例來進一步解釋本發明，但實施例並不對本發明做任何形式的限定。實施例1半抗原負載試劑的製備將無水碳酸鉀和中性氧化鋁加入蒸餾水中，使碳酸鉀、中 性氧化鋁與水分別為1 3(w/v)和1 2( 八)，60 701磁力攪拌111後在601烘箱烘 幹，使用前於130 140°C活化3h。己烯雌酚-單-丁酸乙酯基-醚(DES-mono-ethylbutyrate-ether，DES-MEBE) 的製備依次將25mL色譜純丙酮、0. 55g DES、1. 86g負載試劑、0. 15mL 4-溴丁酸乙酯加入 三口燒瓶，在避光、水浴、N2保護的條件下回流8h。用高效液相色譜(high performance liquid chromatography, HPLC)法監控反應的進程。HPLC 條件BDS-C18 色譜柱，5 μ m， 4.6X250mm;流動相甲醇-水(75 25，ν/ν)；流速1. OmL/min ；柱溫25°C ；進樣量 10 μ L。DES半抗原合成有關的HPLC譜圖，見圖1 4。與DES對照品的HPLC譜圖(圖1)相 比較，反應液的HPLC譜圖(圖2)除了在5min、9min出現兩個分別為trans_DES和cis_DES 的峰以外，在21min還有一個很明顯的峰，經鑑定是trans-DES-MEBE，由於cis-DES-MEBE為 副產物切濃度低，所以未見其峰。反應完畢後將反應液過濾，濾液旋轉蒸發濃縮至約5mL。 用薄層色譜(thin layer chromatography, TLC)法將濃縮濾液中的反應產物分離成上中 下3點。收集中點區域矽膠，用50mL甲醇提取3次，合併甲醇提取液，減壓過濾，濾液旋 轉蒸乾，剩餘的物質即為DES-MEBE。經過TLC分離甲醇提取後，HPLC譜圖(圖3)上出現 trans-DES-MEBE (15min)和cis-DES-MEBE (22min)兩個峰(加大了流動相中甲醇的比例)。DES半抗原的製備將得到的DES-MEBE轉入水中，然後向其中逐滴加入lmol/L的 NaOH溶液至固體全部溶解，過濾，濾液用lmol/L HCL沉澱，將過濾物烘乾即得半抗原己烯 雌酚-單-羧基丙基-醚(DES-mono-carboxyproxyl-ether, DES-MCPE)(圖 4)。人工半抗原的合成路線見圖5。實施例2 採用混合酸酐法將DES-MCPE分別與載體蛋白BSA (免疫原)或OVA (包被原)交 聯。首先將DES-MCPE活化精確稱取35. Omg DES-MCPE溶於ImL無水二氧六環中，加2入 18 μ L三正丁胺，4°C攪拌反應20min後再加入13 μ L氯甲酸異丁酯4°C攪拌反應30min。蛋 白質溶液的製備將蛋白質(BSA IlOmg或0VA70mg)溶於3mL 二氧六環，加入3mL蒸餾水和 66 μ Llmol/L NaOH。DES-MCPE與載體蛋白交聯將DES-MCPE活化液緩慢加入蛋白質溶液 中，用lmol/L NaOH控制pH值在8.0左右。滴加完畢後，4°C避光攪拌反應過夜。反應完畢， 將反應液裝入經過處理的透析袋中，用IOOOmL透析液4°C透析，每12h更換一次透析液。收 集透析後的反應液，根據體積估算濃度後，按每隻ImL分裝在1. 5mL的塑料離心管中，-20°C 凍存。人工抗原的合成路線見圖6。實施例3選體重為3. 5kg左右的健康雄性紐西蘭大白兔，觀察一周。用無菌生理鹽水將免 疫原稀釋至0. 5mg · ml/1濃度，用0. IOmL (50 μ g免疫原)的劑量在免疫前將免疫原與等體積弗氏完全佐劑充分混勻乳化後，進行家兔背部脊椎兩側多點皮下注射。每4周進行一次 加強免疫，加強免疫時，免疫原用弗氏不完全佐劑進行乳化。分別於2次免疫後第10天於 耳緣靜脈採血1 2ml，離心分離血清，用間接ELISA檢測抗體效價。待血清效價穩定後，大 量採集抗血清。血清效價的計算方法陰性對照0D450值記為N，陽性對照OD45tl值記為P， 當P/N≥2且P-N > 0. 2時判為陽性，保持陽性的最大稀釋比例為抗體效價。本發明製備 的抗體效價可達100萬以上。實施例4己烯雌酚抗體評價方法為間接ELISA實驗，其包被原首先利用DES與40溴丁酸 己酯反應，在DES的一個酚羥基上引入酯鍵，然後經皂化水解暴露羧基，從而合成人工半抗 原，再用混合酸酐法通過半抗原上的羧基與雞卵清白蛋白(OVA)結合，二抗是辣根過氧化 物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG，檢測底物是過氧化氫和鹽酸四甲基聯苯胺，四參數模型標準 曲線的擬合是利用Bio-Tek公司的KCjimior軟體完成的。精確稱取DES標準對照品IOOmg置於IOOml棕色容量瓶中，以甲醇定容。臨用前 用40體積％的甲醇水溶液配製成所需的0、0· 01、0· 05、0· 1、0· 5、1、5、50μ g · L-1 —系列標
準濃度。用碳酸緩衝液(pH 9.6,0. 05mol .L—1)將包被原稀釋至50 μ g ^r1,按每孔100 μ 1 加到酶標板孔內，放入溼盒中置37°C水浴鍋內孵育Ih後，移至4°C過夜，同時做空白對照； 用PBST (pH 7. 4)洗滌酶標板2次，再用PBS (pH 7. 4)洗滌1次，於吸水紙上拍幹；將含10% 脫脂奶粉的封閉液按照每孔250μ 1加入到酶標板孔內，放入溼盒中37°C孵育Ih ；洗滌同 前；用含0. 2wt%明膠的PBS稀釋抗血清後每孔加90 μ 1，間接競爭ELISA每孔加入10 μ 1 DES標準液，間接ELISA在每孔加入10 μ 1空白稀釋液，37°C孵育lh，同時做空白對照及陰 性對照；洗滌同前；將酶標二抗按每孔100 μ 1加入到酶標板孔內，37°C孵育Ih ；洗滌同前； 按每孔100 μ 1加入新鮮配製的底物液後，室溫孵育IOmin ；按每孔100 μ 1加入終止液，顯 色反應即終止。終止後，以空白對照調零用酶標儀測0D450值。用KCjimior軟體進行4 參數非線性回歸，建立檢測DES的間接競爭ELISA標準曲線(圖7)。標準曲線的IC50在 0. 71 1. 0μ g/L，線性範圍在0. 01 50μ g/L，R2在0. 9952 0. 9978。獲得各標準濃度 下Β/Β0的批內變異係數在0.52% 22. 48%，批間變異係數在2. 64% 19.51%。交叉反 應實驗表明，本發明製備的抗體對與DES結構相似的人工合成二苯乙烯類雌激素藥物己烷 雌酚(HEX)和雙烯雌酚(DIEN)的交叉反應率分別為8.5%和38.5%，與天然雌激素類藥物 雌二醇(E2)和乙炔雌二醇(EE2)以及L-酪氨酸(Tyr)的交叉反應均小於0. 001 %。
權利要求
一種己烯雌酚抗體的製備方法，其特徵在於包括如下步驟(1)己烯雌酚與4 溴丁酸己酯反應，經皂化水解暴露羧基，合成己烯雌酚人工半抗原；(2)用混合酸酐法通過己烯雌酚人工半抗原與牛血清蛋白反應，得到己烯雌酚人工免疫原；(3)將己烯雌酚人工免疫原與弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑乳化後對家兔進行皮下注射，當抗體效價穩定時分離血清，得到己烯雌酚抗體。
2.根據權利要求1所述的己烯雌酚抗體的製備方法，其特徵在於步驟(3)中所述皮下 注射是對家兔背部脊椎兩側多點皮下注射。
3.根據權利要求2所述的己烯雌酚抗體的製備方法，其特徵在於所述皮下注射己烯雌 酚人工免疫原的量為50μβ，0. lmL，每4周注射一次。
全文摘要
本發明公開了一種己烯雌酚抗體的製備方法。本發明己烯雌酚抗體的製備方法包括如下步驟(1)己烯雌酚與4-溴丁酸己酯反應，經皂化水解暴露羧基，合成己烯雌酚人工半抗原；(2)用混合酸酐法通過己烯雌酚人工半抗原與牛血清蛋白反應，得到己烯雌酚人工免疫原；(3)將己烯雌酚人工免疫原與弗氏完全佐劑(首次免疫)或弗氏不完全佐劑乳化後對家兔進行皮下注射，當抗體效價穩定時分離血清，得到己烯雌酚抗體。本發明己烯雌酚抗體的製備方法簡便，成本低廉，製備得到的己烯雌酚抗體的特異性強，抗體效價高，間接ELISA實驗的效價達100萬以上，用於己烯雌酚的免疫檢測時，可降低檢測成本，易於推廣應用。
文檔編號C07K16/06GK101914157SQ20101021894
公開日2010年12月15日 申請日期2010年7月6日 優先權日2010年7月6日
發明者劉雅紅, 單國強, 嶽磊 申請人:華南農業大學