一種鑑別轉基因水稻中外源轉基因和受體內源基因的方法
2023-06-25 23:09:41
專利名稱：一種鑑別轉基因水稻中外源轉基因和受體內源基因的方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域。具體為在來源於植物的野生型基因中引入若干SNP位點，將修飾後的該基因克隆於表達載體並轉化水稻，從而獲得轉基因植物。而後可利用SNP 位點來區別轉基因植物中相同等位基因的外源性與內源性。
背景技術：
轉基因技術已成為目前發展最迅猛的現代技術之一。從1996年的170萬公頃到 2009年的1. 34億公頃，轉基因作物在13年間耕種面積增長了 80倍(Clive James, 2009)。 轉基因技術廣泛發展和利用的同時，各國及國際社會也在不斷加強其生物安全評價研究與實施，例如在1992年召開的聯合國環境與發展大會籤署了兩個綱領性文件——《21世紀議程》和《生物多樣性公約》，並於2000年經多國籤署了《卡塔赫納生物安全議定書》。轉基因植物生物安全評價的內容之一是對目標轉基因進行分子生物學檢測及跟蹤。所以針對目標基因序列進行PCR擴增、測序或Southern blot可以有效地檢測外源基因。隨著對安全性要求的提高，為了有效降低轉基因對環境及食品帶來的風險，並提高消費者的接受程度，越來越多的研究及發明開始利用植物來源的甚至受體植物自身來源的外源基因來改良作物以增加產量、改良品質，提高非生物及生物脅迫能力。但是，由於轉基因來源於受體，即受體本身含有該基因，因此利用常規方法難於鑑別內源和外源基因。另一方面，出於食品安全性的考慮，無標記基因轉化系統發展迅速。常用基因如糖類分解代謝酶基因(Pawan K J, 2002)、β -葡萄糖苷酸酶基因(Pawan K J, 2002)、綠/ 黃/紅色螢光蛋白基因(Pawan K J, 2002)、葉綠素合成酶基因(Cough K C, 2001)、化合物解毒酶基因(Daniel H, 2001; Scott P B, 2003)及天門冬氨酸激酶基因(Pawan K J, 2002)等。剔除標記基因的機制主要為同源重組或在分離世代選擇無標記的個體。農桿菌介導的雙T-DNA轉化方法是將目標基因與篩選標記基因分別克隆在兩個T-DNA上用來轉化外殖體，基因槍共轉化法是用兩個以上質粒/DNA片段同時轟擊轉化外植體，兩者目的均是在轉基因植株後代有性繁殖過程中經遺傳重組及人工選擇將攜帶標記基因的植株剔除，從而篩選出無選擇標記基因的轉基因植株後代。但當外源基因是供體來源的基因時，剔除標記基因後的轉基因植株中的目標基因將難以進行分子檢測及跟蹤。此外，將野生型等位基因轉化植物突變體後，在轉化植株及其自交後代中可利用引起功能變化的序列差異鑑定外源基因，如PCR檢測。但是，當將轉化事件通過有性雜交轉育至其它野生型遺傳背景中後，由於野生型遺傳背景含有該轉基因對應的內源基因，因此無法區分植物基因組本身的內源基因與導入的外源基因。迅猛發展的第三代分子標記單核苷酸多態性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)標記技記術是一種高通量、低成本、可機械操作的分型方法，為解決上述多種問題提供了技術依據。高通量快速檢測平臺的建立使其應用更加廣泛。與SSR分子標記相比，以Taqman real-time PCR為基礎的SNP檢測平臺可使用384孔板一次檢測1 百萬個樣品，真正達到高通量、低成本(Guptaet al. 2008)。如果在轉化植物之前向目標
3基因內部引入SNP標記，利用Taqman real-time PCR技術對轉基因植株及其後代進行檢測，不僅能區分轉化植株中內、外源基因，還可區分目標基因的純合及雜合狀態。
發明內容
本發明解決了植物轉化受體來源的外源轉基因的檢測問題，屬於生物技術領域。 具體為在來源於轉化受體的野生型基因中引入若干SNP位點，但不改變所編碼胺基酸序列，然後將修飾後的該基因克隆於表達載體並轉化植物，從而獲得轉基因植物。而後可利用 SNP位點來區別轉基因植株中相同等位基因的外源性與內源性。本方法可以應用於回交轉育材料中外源基因的檢測，也可應用於與標記基因分離後轉基因植株中外源基因的檢測。本發明依次通過下列步驟實現
1.設計併合成含有目標位點突變的引物，對目標基因進行PCR擴增，在不改變胺基酸序列的同時向目標基因引入SNP位點。2.將含有SNP突變位點的目標基因構建至表達載體。3.用上述轉化載體轉化受體植物。4.利用Real-Time PCR方法(TaqMan探針)檢測轉基因植物中目標基因中的SNP 位點。5.將上述轉基因植株中轉化事件通過有性雜交轉育至其它背景中，利用 Real-Time PCR儀器結合TaqMan探針法檢測新育成品系/種中目標基因中的SNP位點，並判斷該位點的純合或雜合狀態。本發明方法所涉及的引物合成技術、植物葉片總DNA提取技術、PCR技術、載體構建技術、Southern blot技術、植物遺傳轉化技術以及利用Real-Time PCR儀器進行的SNP 檢測技術(TaqMan探針)均為公知技術。篩選/標記基因即紅色螢光蛋白基因的編碼序列可在NCBI資料庫中查閱。
本發明的優點是
1.與SSR等第二代分子標記相比，本發明利用的SNP標記是一種高通量、低成本、可機械操作的分型方法。使用針對核酸中不同多態性序列的螢光Taqman探針，它們在PCR擴增中被水解釋放螢光信號，只有與靶序列完全匹配的探針才能被相應的切割。利用多通道 real-time PCR儀檢測結果，可以便捷地判斷核酸多態性。以hqman real-time PCR為基礎的SNP檢測平臺可使用384孔板一次檢測1百萬個樣品。在轉化植物之前向目標基因內部引入SNP標記，可以便捷地檢測、區分轉化植株中內、外源基因。2.當外源基因是供體來源的基因時，可使用本發明檢測並跟蹤剔除標記基因後的轉基因植株中的外源目標基因。3.轉化受體來源的野生型基因轉化植物後，可用本發明檢測外源基因的存在與否。將轉基因通過有性雜交轉育至野生型遺傳背景中後，可以使用本發明檢測外源基因是否存在並加以跟蹤。
圖IA顯示了實施例1中的不育系水稻植株花器官形態學觀察示意圖。圖IB顯示了實施例1中的不育系水稻植株上不能形成正常花粉。
圖2顯示了實施例1中5^激缺失片段及引物位置示意圖。圖3顯示了實施例4中經農桿菌轉化後獲得的螢光愈傷組織。圖4顯示了實施例4中經農桿菌轉化後獲得的再生植株。
圖5顯示了實施例5中部分轉基因植株的Southern blot鑑定(N 陰性對照，Marker: 分子量標準；P 以轉化質粒作為陽性對照)。圖6顯示了實施例6中轉基因苗SNP檢測結果。圖中圓點表示FAM螢光檢測(含 SNP位點，純合)；三角型表示VIC螢光檢測(不含SNP位點)；正方型表示FAM和VIC同時檢測(含SNP位點，雜合)；差號表示不能判斷。
具體實施例方式下文結合實施例和附圖具體描述本發明的技術方案，但不限於此。實施例1 遺傳轉化材料的創製
利用化學誘變的方法處理野生型水稻品種武運粳7號，創製水稻突變體庫，從中篩選水稻核隱性雄性不育突變體 sl，該突變體在突變位點處於純合狀態。突變的水稻植株不能形成花粉。附圖IA顯示了水稻核隱性不育突變體5^激植株稻穗及花器官形態學表現。 附圖IB顯示了水稻突變體植株上不能形成花粉。與野生型等位基因1 相比，突變等位基因rns激缺失了 3102個鹼基。利用引起二者功能差異的核苷酸序列差異設計PCR引物對二者擴增，可判斷該位點的基因型。具體方法如下。在 ^^基因缺失序列設計一條反向引物Cyp-test-3，引物序列為 5' -AAGGTGTAGAAGCGGAAGAGGATGG-3 『；在缺失片段兩側設計一對引物，正向引物名稱為 Cyp-test-5，其序列為5' - GAGAACGAATTGGTCAATGGCCGA -3'；反向引物名稱為 Cyp-WT， 其序列為5' -GAAAATAGTGCTCTTATGGATTGACCT-3 『。在突變體中由引物 Cyp_test_5 和 Cyp-test-3擴增出片段，在其對應的野生型水稻中由引物Cyp-test-5和Cyp-WT擴增出567bp片段，在雜合體中兩片段均能擴增出。附圖2為 ^^缺失片段及引物位置示意圖。實施例2 向野生型0sCYP704B2等位基因(含自身內源啟動子及終止子)中引入3 個SNP
利用軟體I^rimer 5設計引物，在不改變目標基因《sCT/^i^a 所編碼的胺基酸的同時引入3個單核苷酸突變，分別由第1468、1470和1473位鹼基的G轉換為C。設計併合成含有目標位點突變的引物，對目標基因進行PCR擴增，從而將SNP位點引入目標基因。所述引物序列為5 』 -aggcgcgccgtttaacaggtggaagacaaggtggtgagg3 』(含一個限制性內切酶 AscI 識別位點)和 5，-catgcgacggtcacggtgcggtccttcgacaagtactc-3，(內含 3 個 SNP 位點)。修飾後的《sCT/^i^a 核苷酸序列見SEQ ID NO: 1，其中SNP由方框標出。修飾前後的AsCT/^似似基因所編碼的胺基酸序列100%匹配，修飾後AsCT/^似似基因編碼的胺基酸序列見 SEQ ID NO:2。實施例3 將含有SNP突變位點的目標基因構建至表達載體。將修飾後的flsCT/^^a 基因克隆於植物表達載體中，與報告/篩選標記基因即紅色螢光蛋白基因相串連，該基因表達的紅色螢光蛋白用於篩選轉化愈傷組織及水稻轉基因植株。
實施例4 獲得轉基因水稻植株
將實施例3中轉化載體用電擊法導入農桿菌菌株AGLO中，而後轉化由實施例1中的水稻不育系誘導的愈傷組織。利用紅色螢光蛋白對轉化愈傷組織進行篩選，附圖3為含有外源基因的愈傷組織，然後將其分化再生出表達外源基因的轉化植株(附圖4)。實施例5 轉基因植株的Southern Blot檢測
對Ttl代轉基因水稻基因組DNA進行Southern Blot檢測，以鑑定外源基因在水稻轉化受體中的整合情況。取實施例4中Ttl代轉基因水稻植株葉片，抽取總DNA。以紅色滎光蛋白基因序列中的526bp核苷酸片段為探針，選用NEB公司的Ih I限制性內切酶進行消化反應。酶切反應體系為200ul，其中含基因組DNA15ug、NE Buffer 20ul、BSA 2ul、損a I 4ul (20 U/ul)，用無離子水將體系補足至200 ul後，37°C溫育他。附圖5為部分轉基因植株 Southern Blot檢測結果。結果表明外源基因已整合至受體水稻基因組中。實施例6 檢測轉基因水稻中0sCYP704B2基因中的SNP
取實施例4中Ttl代轉基因水稻植株葉片，抽取總DNA，在Real-Time PCR儀上利用 TaqMan探針法對0sCYP704B2基因中的SNP位點進行檢測。探針及引物序列如下
1.正向引物Wang-3SNP_FGACTGGCTTGTCGAGTACTTGT,
2.反向引物Wang-3SNP_RTGTAGGAGGTGAAAGGCATGTC ，
3.探針1:CCGTCCTGTCCTTCG NFQ (用於檢測不含SNP位點的樣品)，
4.探針2:CACGGTGCGGTCCT NFQ (用於檢測含有SNP位點的樣品)。SNP檢測結果顯示，在轉基因水稻受體中存在3個目標SNP (附圖6)。 序列表(SEQUENCE LISTING)
北京未名凱拓作物設計中心有限公司
北京凱拓迪恩生物技術研發中心有限責任公司 一種鑑別轉基因水稻中外源轉基因和受體內源基因的方法 2
PatentIn version 3.3 1 3808 DNA
lYMiOryza sativa) 1
aggtggaagacaaggtggtgaggattgggagggctacctatggcagggtagtgaagaggc60aggcaatgagagctctcttcagacttacattggatgctgacagtaacaaaagcctgtagg120ttttgatactcttgattgattgtttatttagttacctagtatcttcagtaacagatgaga180gatttattcagcaaatgctccggtttgctcgaaggttgtaataagagtgtgggcaagaat240caaggtcaatccataagagcactattttcatgctcttctgatcttggtttcagacttgtt300tcagtgttgacattggttatttctcaattcattcgagtatttgttgttacatcacaaagg360ataagttctatagaaaaaatcttccttttcaagtgatgttctttaattttctgtagaatt420gtgccctgcaatttctcaaatctttgatagatggcttatttgtattgactggaaaagaaa480ttagttgtcaataactagaagctttagagatgcaaagtattggatatatcttggcaatag540tattttatattgcttgtttatgtgagaatgttttaactagatggcaactgatttctggga600caaaatcgcttctacaatagcattttatggaactcgtactcgtcgatagcatttcttgga660tttgggtgtttgtaaatggcatttcttggattttctcttcattaaaatagcctattcaga720tgaagtagaattcaggtgaagtagaaaccaactactttgggttcacaatttatatttctt780ttgaggataccccatttcattttagttgtcatcaaagactagacaatatcgacagaaaat840ggtaagcctggtttcagttggtgacaatttaacagaattcagatggatatggttctgata900ttagaaggtggcatacctttagtcgctgcaaacgcttcagttatctgaacaaaacaacga960acttggctgagcaggggaaaaaaatactgtagcattcattttgtgtttacatgagtaacg1020attcttttctaggtggacag3. C 3. C 3.3.3.3.3.gaaaactaaagctaagatccaactcctaag1080ggtgttaggttagggacaccatatgaatgagacaatcttaattcttggtcacacaaagat1140tgtctcaaggttggtagcatcagtgcccaatatatcacctaactatgccatccaaaatgc1200tacatagcatctcttgtagactgaacccttcatgaagagccccatggaggaagctcatgc1260aatgccagtgacatcattcttcccagtagcaggaatccacaagctcatagctatcttcct1320tgttgtcctctatggatcttggtccacaagtggagcctgaggaaccagaaagggccaaga1380tcatggccaatcatcggcgcgacagtggagcaactgaagaactaccacaggatgcatgac1440tggcttgtcgagtacttgtcgaaggaccgcaccgtgaccgtcgacatgcctttcacctcc1500tacacctacattgccgacccggtgaacgtcgagcatgtcctgaagaccaacttcaccaat1560taccccaaggtaaaagaaccataggatcttcagtgtactgtaaaatgtgccttgcacagt1620actaacactg3. C 3. C 3.3.3.3.3.3.tgtctgaaaatatgcagggtgaagtgtacaggtcttacat1680ggatgtgctgctcggtgatggcatattcaatgccgacggcgagatgtggaggaagcaaag1740gaagacggcgagcttcgagtttgcctccaagaacttgagagacttcagcactgtggtgtt1800cagggagtactccctgaagctatcaagcattctgagccaagcatgcaaggccggcagagt1860tgtagacatgcaggtaaccaactgaattccttgcctaatacctaaacatttcttgagaaa1920ccaaattgttcagaattctgatgcaagaac 3.3. C C 3.3.3.3. tcaggaattgttcatgagga1980tgacactggactcgatctgcaaggtcgggtttggggttgagatcgggacgctgtcacctg2040atctcccggagaacagctttgcccaggcattcgacgctgccaacatcatcgtcacgctgc2100ggttcatcgatcctctgtggcgtctgaagaagttcttgcacgtcggatcagaggctctcc2160tcgagcagagcatgaagctggttgatgacttcacctacagcgtgatccgccgccgcaagg2220ctgagatcttgcaggctcgagccagcggcaagcaagagaaggtgatccttcctctcttgc2280tcaaagaatcagtagaactgaactgacatggtaatggtgatgatcagatcggaaaaggtt2340ttgtttcttgatatcgttgatttgtaatggcgagcagatcaagcacgacatactgtcgcg2400gttcatcgagctcggggaggccggcggcgacgaggggggcggcagcttcggggacgacaa2460gagcctccgcgacgtggtgctcaacttcgtgatcgccgggcgtgacacgacggcgacgac2520gctgtcgtggttcacgtacatggcgatgacgcacccggccgtcgccgacaagctccggcg2580cgagctggccgcgttcgaggatgagcgcgcgcgcgaggagggcgtcgcgctcgccgacgc2640cgccggcgaggcgtcgttcgCggCgCgCgtggcgcagttcgcgtcgctgctgagctacga2700CgCggtggggaagctggtgtacctgcacgcgtgcgtgacggagacgctccgcctctaccc2760ggcggtgccgcaggaccccaaggggatcgtggaggacgacgtgctccccgacggcaccaa2820ggtgcgcgccggcgggatggtgacgtacgtgccctactccatggggaggatggagtacaa2880
7ctggggccccgacgcggcgagcttccggccggagcggtggctcagcggcgacggcggcgc2940gttccggaacgcgtcgccgttcaagttcaccgcgttccaggccgggccgcggatctgcct3000cggcaaggactccgcctacctccagatgaagatggcgctcgccatcctcttccgcttcta3060caccttcgacctcgtcgaggaccaccccgtcaagtaccggatgatgaccatcctctccat3120ggctcacggcctcaaggtccgcgtctccacctccgtctgacccccgccgccgctcgccgg3180cagccgcgccgccgccgcccgtatcgcttaccggagtagtaaataagcctatgtaatctg3240gtttgaatttgaaatttgaatgtaccatgtttgattctaggatttgttggtcctagaccc3300tgcttgaaacggtgcgaatttcatctaaatggttgagaaattttatcgaaagctgttcca3360ttctacgctacaaatggtgggactggatttaaacattggcgacgtggacaaggccgtatc3420accatgtttgcacatttttaaacctgtaatctggtttgaatttgaatgtaccatgacacc3480atgtttgcaaaactttacatgaatgtttgagaaaaaatatggagaactgttcaattagta3540tgcgtttaaaatgggactggatttaaacattggcgacgtggacaaggctagtggactgag3600actctgagatgttgcggaagtcggggacgcagcggcggcagccgccggcgtggcggcggt3660gccggagcctgcgacacatcaagcagatgcacgcggtgatggcgctccggggcttcctct3720ccgatccctccgagctccgcgagctccttttcgcctccgccgtcgcggtccgcggcgcca3780tcgcgcacgcctacctcgtgttcgacca3808
2 544 PRT
lYMiOryza sativa) 2
Met Lys Ser Pro Met Glu Glu 15
Phe Pro Val Ala Gly lie His 20
Leu Ser Trp lie Leu Val His 35
Pro Arg Ser Trp Pro lie lie 5055
Tyr His Arg Met His Asp Trp 6570
Thr Val Thr Val Asp Met Pro 85
Pro Val Asn Val Glu His Val 100
Lys Gly Glu Val Tyr Arg Ser 115
lie Phe Asn Ala Asp Gly Glu 130135
Ala His
Lys
Lys
40
Gly
Tyr 120 Met
Leu
25
Trp
Ala Met Pro 10
lie Ala lie Ser Leu Arg
Ala
Leu Val
Phe Thr
Leu Lys 105 Met
Thr Val Glu
Ser
90
Thr
Tyr
75
Tyr
Asp Trp Arg Lys
Glu 60 Leu
Thr
Phe
Val
Phe
Asn
45
Gln
Asn Val Leu
Gln 140
Tyr
Thr
Leu 125 Arg
Thr Ser 15
Leu Val 30
Gln Lys
Leu Lys Ser Lys Asp
Phe
Val
Gly
Asn
Arg 80 Asp
lie Ala 95
Asn Tyr Pro 110
Gly Asp Gly Lys Thr AlaSet Phe Glu Phe Ala Set Lys ASh Leu Arg Asp Phe SetThr Val Val145150155160Phe Arg GluTyr Set Leu Lys Leu Set Set Ile Leu Set Gln Ala Cys165170175Lys Ala Gly Arg Val Val Asp Met Gln Glu Leu Phe Met Arg MetThr180185190Leu Asp Set Ile Cys Lys Val Gly Phe Gly Val Glu Ile GlyThr Leu195200205Set Pro Asp Leu Pro Glu ASh Set Phe Ala Gln Ala Phe Asp Ala Ala2lo215220ASh Ile Ile Val Thr Leu Arg Phe Ile Asp Pro LeuTrio Arg Leu Lys225230235240Lys Phe Leu HiS Val Gly Set Glu Ala Leu Leu Glu Gln Set Met Lys245250255Leu Val Asp Asp PheThrTyr Set Val Ile Arg Arg Arg Lys Ala Glu260265270Ile Leu Gln Ala Arg Ala Set Gly Lys Gln Glu Lys Ile Lys HiS Asp275280285Ile Leu Set Arg Phe Ile Glu Leu Gly Glu Ala Gly Gly Asp Glu Gly290295300Gly Gly Set Phe Gly Asp Asp Lys Set Leu Arg Asp Val Val Leu ASh305310315320Phe Val Ile Ala Gly Arg AspThrThr AlaThrThr Leu SetTrio Phe325330335ThrTyr Met Ala MetThr HiS Pro Ala Val Ala Asp Lys Leu Arg Arg340345350Glu Leu Ala Ala Phe Glu Asp Glu Arg Ala Arg Glu Glu Gly Val Ala355360365Leu Ala Asp Ala Ala Gly Glu Ala Set Phe Ala Ala Arg Val Ala Gln370375380Phe Ala Set Leu Leu SetTyr Asp Ala Val Gly Lys Leu ValTyr Leu385390395400HiS Ala Cys ValThr GluThr Leu Arg LeuTyr Pro Ala Val Pro Gln4054lo415Asp Pro Lys Gly Ile Val Glu Asp Asp Val Leu Pro Asp GlyThr Lys420425430Val Arg Ala Gly Gly Met ValThrTyr Val ProTyr Set Met Gly Arg435440445Met GluTyr AShTrio Gly Pro Asp Ala Ala Set Phe Arg Pro Glu Arg
權利要求
1.一種有效的辨別轉基因水稻中內源基因和相對應外源基因的方法，該方法包括以下步驟a)構建水稻核隱性雄性不育突變體，b)鑑定外源轉基因的SNP位點，c)檢測並跟蹤由含有1.1所述SNP的轉基因水稻與其它水稻品種/系雜交後代中的SNP。
2.權力要求1中所述核雄性不育突變體為水稻突變體。
3.權力要求1中所述SNP檢測方法，該方法是在RealTime PCR儀上利用Taqman 法進行的，具體為根據轉化受體自身的野生型基因(內源)與轉基因(外源)在SNP位點的差異設計特異性探針及引物，在Real Time PCR儀上進行檢測，從而區分內源及外源基因。
4.經權力要求1、2和3檢測及驗證的轉基因水稻。
5.權力要示4中所述的水稻轉化體中，含有人工引入的SNP的野生型外源基因與其對應的功能缺失型突變體產生功能互補。
全文摘要
本發明提供了水稻轉化受體來源的外源轉基因的檢測方法。屬於生物技術領域。具體為在來源於轉化受體的野生型基因中引入若干SNP位點，但不改變胺基酸序列，將修飾後的基因克隆於表達載體並轉化水稻，從而獲得轉基因水稻。而後可利用SNP位點來區別轉基因植株中相同等位基因的外源性與內源性。本方法可以應用於轉基因水稻回交轉育材料中外源基因的檢測，也可應用於與標記基因分離後轉基因植株中外源基因的檢測。該發明不僅可以區分轉基因水稻中外源與相應的內源基因，而且可以判斷該位點的純合或雜合狀態。
文檔編號A01H5/00GK102154446SQ20101056358
公開日2011年8月17日 申請日期2010年11月29日 優先權日2010年11月29日
發明者萬向元, 周君莉, 王海洋, 鄧興旺 申請人:北京凱拓迪恩生物技術研發中心有限責任公司, 北京未名凱拓作物設計中心有限公司