用溶劑萃取法操作的低有機可萃取深層過濾器介質的製作方法

2023-06-26 05:23:21

用溶劑萃取法操作的低有機可萃取深層過濾器介質的製作方法
【專利摘要】本發明提供一種細胞培養進料、包括化學處理的絮凝進料的初步澄清深層過濾方法，所述進料包含感興趣的靶生物分子如mAb、哺乳動物細胞培養物或細菌細胞培養物，所述方法利用含有介質的初步澄清深層過濾器，所述介質具有顯著較低的衝洗要求，導致衝洗後較低水平的有機萃取物從介質中釋放，並且具有對預處理進料流增加的通量，無需使用初步澄清離心步驟或初步澄清切向流微量過濾步驟。用於流體細胞培養進料、包括化學處理的絮凝進料的初步澄清的初步澄清深層過濾裝置，含有具有可變孔隙評級的多孔層的多孔深層過濾器介質，並獲得在通過具有顯著較低衝洗要求的介質過濾的原料中測量的期望水平的總有機萃取物(1-3ppm)，所述進料含有絮凝的細胞碎片和/或具有約0.5μm至約200μm的顆粒大小分布的膠體微粒。還提供試劑盒和使用及製造該試劑盒的方法。
【專利說明】用溶劑萃取法操作的低有機可萃取深層過濾器介質
[0001] 相關申請
[0002] 本專利申請要求於2012年6月6日提交的美國臨時專利申請61/656,263以及 2012年6月27日提交的美國臨時專利申請61/664,999的優先權，其全部內容以其整體援 引加入。

【技術領域】
[0003] -般來說，本發明涉及用於細胞培養進料初步澄清的低有機可萃取介質。在某些 具體實施方案中，本發明提供細胞培養進料等的初步澄清深層過濾方法，其利用含有多孔 介質的初步澄清深層過濾裝置，所述介質具有顯著較低的衝洗要求，導致衝洗後較低水平 的有機萃取物從所述介質中釋放，並且具有對預處理進料流增加的通量，無需使用初步澄 清離心步驟或初步澄清切向流微量過濾步驟。

【背景技術】
[0004] 製備包括蛋白如單克隆抗體（mAb)在內的藥物級別的生物分子是一個複雜的制 備過程，包括設計用來製備用於患者的高質量產物的多種過濾、離心和色譜技術。細胞培養 收穫物和高固體原料的澄清可以是艱巨的任務，這是由於來自現代化生產批量生物反應器 的大體積收穫物25, 000L)和高細胞密度通常在隨後的色譜操作之前需要初步以及二 次澄清。因此，細胞收穫物和高固體原料如哺乳動物細胞和mAb的製備過程的收穫和澄清 方案是過去20年左右進行的許多演變和評價的產物。
[0005] 現在通常期望哺乳動物細胞培養物和mAb的收穫技術以高收率（>95% )和最小細 胞破裂的方式操作。隨著產物分子滴度增加，較高的細胞團和較大量的產物對下遊純化步 驟提出挑戰。較高的細胞密度在澄清和無菌過濾期間造成困難。較高的產物濃度一般導致 增加的雜質負荷且需要較大的色譜設備。因此，提高效率和通量形式的改良大受歡迎。
[0006] 進料、進料流、原料、細胞培養液等（包括高固體進料，例如含有mAb和哺乳動物細 胞培養原料的高固體進料）的初步澄清去除大量生物質，特別是全細胞和其他較大的細胞 碎片，然後二次澄清，去除較小的膠體顆粒以及損害下遊過濾器容量的其他顆粒。在mAb和 哺乳動物細胞培養液和原料的生產過程中，離心通常是初步澄清步驟。
[0007] mAb生產商投入了大量時間和精力增加原料的產物滴度。然而，雖然較高滴度增加 細胞培養生產率，但是其還產生具有較大量生物質和細胞碎片含量的原料。含有這樣較大 量生物質和細胞碎片的進料可以在離心後產生高濁度離心物（centrate)。高濁度離心物常 減少離心下遊使用的二次澄清深層過濾器和隨後的無菌過濾器的通量。減少的通量引起一 系列問題，從增加的加工成本到加工過程的偏差，這是由於過濾器的堵塞和長期加工延遲。 最後，使用離心初步澄清在運行之間需要廣泛的經過驗證的清潔程序以試圖減少批次和治 療性分子物質之間交叉汙染的風險。
[0008] 在期望於相對短的時間內加工多種產物的試驗或臨床規模的生物治療藥物生產 中，這特別有問題。離心清潔程序減慢試驗工廠轉換至生產不同生物分子的能力，並且大大 增加生產運行之間交叉汙染的風險。此外，在初步澄清步驟中，離心無法有效地從這些原料 去除所有微粒和細胞碎片，因此在離心步驟之後，隨後的色譜步驟之前需要利用深層過濾 的二次澄清步驟。
[0009] 或者，已證實連續過濾運行可用於從原料去除不同大小的細胞和細胞碎片，但是 通常體積通量限制應用於較小體積（〈1000L)，其中過濾器設備具有合理的大小。過濾的使 用大大減少交叉汙染的風險，並且在運行之間無需清潔和清潔驗證，這是由於過濾裝置的 一次性性質。不幸的是，低通量要求大量的過濾器單元，這可以減少過濾產量，因為每個連 續步驟通過過濾器裝置和設備的滯留體積造成部分進料溶液的損失。
[0010] 為了進一步提高澄清性能、通量和下遊過濾操作，已使用細胞培養收穫物的絮凝。 絮凝劑沉澱細胞、細胞碎片和蛋白，這是因為蛋白上的電荷與聚合物（例如聚電解質）上的 電荷的相互作用，產生不溶性複合體，並且隨後通過剩餘電荷相互作用或通過複合體上的 疏水斑塊橋接不溶性複合體以形成較大的簇集。為了去除這些大簇集，離心步驟或切向流 微濾是澄清的主要模式，然後進行二次澄清步驟，由此深層過濾廣泛用於在捕獲色譜步驟 之前澄清細胞培養液。因為離心不可以遞送不含顆粒的離心物，下遊需要進一步安裝深層 過濾器（二次深層過濾）和無菌過濾器。
[0011] 切向流微量過濾（也稱為交叉流微量過濾）與離心競爭從哺乳動物細胞培養物收 獲和澄清mAb和治療性產物。這種技術提供的一個優點是產生不含顆粒的收穫液，需要極 少的額外過濾。但是，用於細胞培養收穫物的切向流微量過濾膜常受到膜汙染問題（即無 法挽回的膜通量（flux)下降）的困擾，並且通常需要嚴格複雜的操作條件，並伴隨每次使 用之後對每個膜的完全清潔方案（對離心也是如此）。解決切向流微量過濾膜汙染問題的 一種方式是使用更親水的膜，其通常被認為較不容易受到顯著汙染。
[0012] 深層過濾器澄清介質廣泛用于澄清細胞培養進料，並證實具有減少濁度，去除一 些可溶雜質例如DNA、宿主細胞蛋白和內毒素的能力。深層過濾器澄清介質通常由纖維素 的纖維床材料、溼強度樹脂粘結劑和無機助濾劑例如硅藻土構成。樹脂粘結劑有助於賦予 溼強度，提供吸附電荷以結合雜質和使組合物（即纖維素和助濾劑）材料脫落最小化。矽 藻土為過濾器提供高表面積區域，並有助於吸收性能。然而，兩種成分（纖維素和樹脂粘結 齊U)已知有助於有機萃取物。因此，這些深層過濾器需要在用於減少有機萃取物之前被衝 洗，這可以是昂貴而費時的。基於現存過濾器的上述限制，存在開發具有顯著較低的衝洗要 求和對預處理進料流增加的通量的下一代深層過濾介質的需要。
[0013] 發明概述
[0014] 對於上述需要和與進料、進料流、原料、細胞培養液等的初步澄清工序相關的問 題，本發明通過使用初步澄清深層過濾工藝克服挑戰，所述初步澄清深層過濾工藝使用初 步澄清深度過濾裝置，其包含具有顯著較低的衝洗要求的多孔介質，導致衝洗後較低水平 的有機萃取物從介質中釋放，並且具有預處理進料流的增加通量。
[0015] 本發明還包括用於減少有機萃取物從初步澄清深層過濾介質中釋放的方法，由此 在衝洗後通過多孔介質過濾的進料中測量的有機萃取物的總水平約為l-3ppm，所述方法包 括：
[0016] a)提供具有多孔深層過濾器介質的深層過濾裝置；
[0017] b)用有機溶劑從所述介質中萃取；以及
[0018] C)以約10升/m2/小時至約600升/m2/小時的流速衝洗所述介質，由此在衝洗後 通過所述介質過濾的原料中測量的有機萃取物的總水平約為l_3ppm。
[0019] 本發明還包括使用初步澄清深層過濾裝置的初步澄清深層過濾方法，所述裝置包 含多孔介質，所述介質具有顯著較低的衝洗要求，導致衝洗後較低水平的有機萃取物從所 述介質中釋放：
[0020] a)提供具有多孔深層過濾器介質的初步澄清深層過濾裝置；
[0021] b)用有機溶劑從所述介質中萃取；
[0022] c)以約10升/m2/小時至約600升/m2/小時的流速衝洗所述介質，由此在衝洗後 通過所述介質過濾的原料中測量的有機萃取物的總水平約為l_3ppm ;以及
[0023] d)衝洗後使原料通過所述介質。
[0024] 本發明還包括用於含有感興趣的靶生物分子和多種細胞碎片及膠體微粒的進料、 進料流、原料、細胞培養液等的初步澄清的方法，無需使用使用初步澄清深層過濾的初步澄 清離心步驟或初步澄清切向流微量過濾步驟，所述初步澄清深層過濾包含多孔介質，所述 介質具有顯著較低的衝洗要求，導致衝洗後較低水平的有機萃取物從所述介質中釋放，所 述方法包含：
[0025] a)提供具有多孔介質的初步澄清深層過濾裝置，所述介質具有顯著較低的衝洗要 求，導致衝洗後較低水平的有機萃取物從所述介質中釋放；
[0026] b)提供含有感興趣的靶生物分子和多種細胞碎片和微粒的進料流，其中所述細胞 碎片和微粒具有約〇. 5 ii m至約200 ii m的顆粒大小分布；
[0027] c)使多孔深層過濾器介質與所述進料流接觸，由此所述深層過濾器介質能以約 10升/m2/小時至約300升/m2/小時的流速過濾具有約0. 5 ii m至約200 ii m的顆粒大小分 布的細胞碎片和微粒，由此在衝洗後通過所述介質過濾的原料流中測量的有機萃取物的總 水平約為l-3ppm;以及
[0028] d)從所述細胞碎片和微粒中分離所述感興趣的靶生物分子，無需使用初步澄清離 心步驟或初步澄清切向流微量過濾步驟。
[0029] 本發明進一步包含用於含有感興趣的靶生物分子或生物治療藥物的絮凝進料和 絮凝細胞碎片、材料以及膠體微粒的初步澄清的方法，其使用初步澄清深層過濾裝置，無需 使用初步澄清離心步驟或初步澄清切向流微量過濾步驟，所述方法包含：
[0030] a)提供含有多孔介質的深層過濾裝置，所述多孔介質具有顯著較低的衝洗要求， 導致衝洗後較低水平的有機萃取物從所述介質中釋放；
[0031] b)提供化學絮凝劑；
[0032] c)提供含有感興趣的靶生物分子和多種細胞材料、碎片以及膠體微粒的進料；
[0033] d)將所述化學絮凝劑與所述進料組合；
[0034] e)在所述進料中形成化學絮凝的細胞材料、碎片和膠體微粒，以及任選地化學絮 凝所述感興趣的靶生物分子；
[0035] f)使多孔深層過濾器介質與含有化學絮凝的細胞材料、碎片和膠體微粒的所述進 料接觸；以及
[0036] g)分離感興趣的絮凝的生物分子種類和多種絮凝的細胞材料，無需使用離心澄清 步驟或切向流微量過濾步驟，其中在衝洗後通過所述介質過濾的進料中測量的有機萃取物 的總水平約為l-3ppm。
[0037] 本發明請求保護用於減少來自初步澄清深層過濾器的有機萃取物的方法，其使用 具有初步澄清深層過濾裝置的萃取系統，所述初步澄清深層過濾裝置含有較低有機可萃取 介質。
[0038] 本發明請求保護無需使用初步澄清離心澄清步驟或初步澄清切向流微量過濾步 驟的初步澄清。所述深層過濾裝置能夠以約10升/m2/小時至約600升/m2/小時的流 速過濾含有具有約0. 5 ii m至200 ii m的顆粒大小分布的顆粒的高固體原料，直到TMP達 到20psi。本文教導的初步澄清深層過濾器介質包括用有機溶劑萃取的具有可變孔隙評 級（pore rating)的分級（graded)多孔層。萃取溶劑 HFE_72DE(3M? St. Paul, MN, USA 的 Novec? Engineered Fluid HFE-72DE)或其可能的替代（HFE-71DE、HCFC-141b、Vertrel MCA或Vertrel MCA+)之一均為用於經和碳氟化合物脂肪（grease)和油的溶劑。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0039] 併入並構成本說明書的一部分的【專利附圖】

【附圖說明】目前考慮的本發明的實施方案，並且與 說明一起用來解釋本發明的原理。
[0040] 圖認、川、1(：、10、^和1?示出根據本發明的初步澄清深層過濾器實施例的不同示 意方案，其中圖IAUC和IE示出具有至少7層的初步澄清深層過濾器，用於聚合物絮凝劑 (智能聚合物）處理的進料，圖IBUD和IF示出具有至少8層的初步澄清深層過濾器用於 化學處理的進料（酸處理）。
[0041] 圖2示出根據本發明的不同實施方案的具有不可萃取介質的初步澄清過濾器在 600升/m2/小時的工作流速的衝洗曲線。
[0042] 圖3示出根據本發明的多個實施方案的具有可萃取介質的初步澄清過濾器在600 升/m2/小時的工作流速的衝洗曲線。
[0043] 圖4示出根據本發明的多個實施方案的具有可萃取介質的初步澄清過濾器在100 升/m2/小時的工作流速的衝洗曲線。 具體實施方案
[0044] 無論上文或下文引用的所有出版物、專利和專利申請整體援引加入本文，與具體 並單獨地表明每個單獨的出版物、專利或專利申請援引加入本文相同。
[0045] 為了本說明書和所附權利要求書的目的，除非另有說明，無論是否明確指出，說明 書和權利要求書中使用的表示成分的數量、材料的百分比或比例、反應條件的所有數目以 及其他數值應理解為在所有情況下受到術語"約"修飾。術語"約"一般指認為等同於所列 舉的值（即，具有相同功能或結果）的一定範圍的數目。在許多情況下，術語"約"可以包 括最近的有效數字左右的數目。
[0046] 因此，除非有相反的指示，以下說明書和所附權利要求書中所示的數值參數為近 似值，其可以根據本發明追求獲得的期望特性而變化。至少，並且不試圖限制將等同原則應 用於權利要求的保護範圍，每個數值參數應當至少根據報導的有效數字的數目並通過應用 普通的捨入技術來理解。
[0047] 儘管示出本發明的廣泛範圍的數值範圍和參數為近似值，但是具體實例中所示的 數值儘可能精確地報導。但是，任何數值固有地包含在它們各自的測試測量中發現的標準 差所致的必需的某些誤差。此外，本文公開的所有範圍應理解為涵蓋其中包括的所有亞範 圍。例如，"1-10"的範圍包括最小值1和最大值10之間的任何和所有亞範圍（並且包括 最小值1和最大值10)，即具有等於或大於1的最小值以及等於或小於10的最大值的任何 和所有亞範圍，例如5. 5-10。
[0048] 在進一步詳細描述本發明之前，會定義許多術語。使用這些術語並不限制本發明 的範圍，而僅用來方便本發明的描述。
[0049] 如本文所用，單數形式"一個（a)"、"一個（an)"和"所述（the)"包括複數指代，除 非上下文另有明確指定。
[0050] 本文所用術語"感興趣的生物分子"可以是期望的靶分子，例如期望的感興趣的產 物或多肽（例如抗體），或者其可以是需要從含有期望的靶分子的樣品去除的不期望的實 體。這些不期望的實體包括但不限於例如選自下述的一或多種雜質：宿主細胞蛋白、DNA、 RNA、蛋白聚集物（aggregate)、細胞培養添加劑、病毒、內毒素、全細胞和細胞碎片。另外，感 興趣的生物分子也可以通過如本文所述的刺激響應性聚合物或化學處理（例如，酸處理） 結合併沉fe。
[0051] 本文所用術語"捕獲步驟"通常指用於將靶分子與刺激響應性聚合物或色譜樹脂 結合的方法，其產生含有所述靶分子和所述聚合物或樹脂的沉澱物的固相。典型地，隨後 利用洗脫步驟回收靶分子，所述洗脫步驟從固相去除靶分子，從而導致從一種或多種雜質 分離靶分子。在不同的實施方案中，所述捕獲步驟可以利用色譜介質如樹脂、膜或整體柱 (monolith)進行，或者利用聚合物如刺激響應性聚合物、聚電解質或結合靶分子的聚合物 進行。
[0052] 本文所用術語"細胞培養添加劑"指某種分子（例如非蛋白添加劑），其被添加到 細胞培養過程中以促進或改善細胞培養或發酵過程。在根據本發明的一些實施方案中，本 文所述刺激響應性聚合物結合併沉澱一或多種細胞培養添加劑。示例性的細胞培養添加劑 包括消泡劑、抗生素、染料和營養素。
[0053] 本文所用短語"細胞培養物"包括細胞、細胞碎片和膠體顆粒、感興趣的生物分子、 HCP 和 DNA。
[0054] 本文所用術語"色譜"指將感興趣的分析物（例如靶分子）從混合物中存在的其 他分子分離的任意種類的技術。通常，由於混合物的單個分子在移動相影響下遷移通過靜 止媒介的速率不同，或結合和洗脫過程不同，所述感興趣的分析物從其他分子中分離。
[0055] 術語"色譜樹脂"或"色譜介質"在本文中可互換使用，並且指任意種類的相（例 如固相），其將感興趣的分析物（例如靶分子）與混合物中存在的其他分子分離。通常，作 為在移動相的影響下，或者在結合和洗脫過程中，混合物中不同分子遷移通過靜止固相的 速率差異的結果，所關注的分析物從其他分子分離。不同類型的色譜介質的實例包括例如 陽離子交換樹脂、親和樹脂、陰離子交換樹脂、陰離子交換膜、疏水相互作用樹脂和離子交 換整體柱。
[0056] 本文所用術語"澄清步驟"通常指最初用於生物分子純化的一或多個步驟。所述 澄清步驟通常包含使用一或多個步驟去除細胞和/或細胞碎片，所述一個或多個步驟包括 任何以下單獨步驟或它們的各種組合，例如離心和深層過濾、沉澱、絮凝和沉降。在一些實 施方案中，本發明提供對常用於不同純化方案的傳統和澄清步驟的改進。澄清步驟通常包 括去除一或多種不期望的實體，並且通常在包括捕獲期望的靶分子的步驟之前進行。澄清 的另一方面是去除樣品中的可溶性和不溶性成分，所述成分後來可導致純化過程中的無菌 過濾器汙染，由此使得整個純化過程更經濟。
[0057] 在一些實施方案中，純化過程另外使用一或多個"色譜步驟"。典型地，如有必要， 這些步驟可在使用根據本發明的刺激響應性聚合物將靶分子從一或多種不期望的實體中 分離後進行。
[0058] 本文所用術語"組合物"、"溶液"或"樣品"指利用本文所述的一或多種刺激響應 性聚合物或化學處理（例如，酸處理）純化的靶分子或期望產物與一種或多種不期望的實 體或雜質的混合物。在一些實施方案中，所述樣品包含原料或細胞培養基，靶分子或期望的 產物分泌入所述培養基。在一些實施方案中，所述樣品包含靶分子（例如治療性蛋白或抗 體）與一或多種雜質（例如宿主細胞蛋白、DNA、RNA、脂質、細胞培養添加劑、細胞和細胞碎 片）。在一些實施方案中，所述樣品包含分泌到細胞培養基中的感興趣的靶分子。
[0059] 術語"中國倉鼠卵巢細胞蛋白"和"CHOP"在本文可互換使用，指來自中國倉鼠卵巢 ("CH0"）細胞培養物的宿主細胞蛋白（"HCP"）的混合物。HCP或CHOP通常作為雜質存 在於細胞培養基或裂解物（例如收穫的含有感興趣的蛋白或多肽（例如CHO細胞中表達的 抗體或免疫粘附素）的細胞培養液）中。通常，包含感興趣的蛋白的混合物中存在的CHOP 的量提供感興趣的蛋白的純度的度量。典型地，蛋白混合物中的CHOP的量以相對於混合物 中感興趣的蛋白的量的百萬分比表示。
[0060] 術語"汙染物"、"雜質"和"碎片"在本文中可互換使用，指任意外源或有害材料， 包括生物高分子例如DNA、RNA、一或多種宿主細胞蛋白（HCP或CHOP)、內毒素、病毒、脂質以 及一或多種添加劑，其可存在於含有感興趣的蛋白或多肽（例如抗體）的樣品中，使用根據 本發明的刺激響應性聚合物將所述蛋白或多肽從一或多種所述外源或有害分子中分離。在 一些實施方案中，本文所述的刺激響應性聚合物從含有感興趣的蛋白或多肽以及一或多種 雜質的樣品結合併沉澱所關注的蛋白或多肽。在其他實施方案中，本文所述的刺激響應性 聚合物結合併沉澱一或多種雜質，從而將感興趣的多肽或蛋白從一或多種雜質中分離。
[0061] 應當理解當所述宿主細胞為其他哺乳動物細胞類型、大腸桿菌、酵母細胞、昆蟲細 胞或植物細胞時，HCP指在宿主細胞的裂解物中找到的除靶蛋白之外的蛋白。
[0062] 本文所用術語"深層過濾器"（例如梯度-密度深層過濾器）在過濾器材料深度 內完成過濾。這類過濾器的常見類型是包含連接（或者固定）的隨機基質以形成流動通道 的複雜的曲折迷宮的過濾器。在這些過濾器中的顆粒分離通常由纖維基質截留或吸附至纖 維基質所致。用於細胞培養液和其他原料的生物加工的最常用的深層過濾器介質由纖維素 纖維、助濾劑如DE以及帶正電荷的樹脂粘結劑組成。不像絕對過濾器，深層過濾器介質在 整個多孔介質截留顆粒，允許截留大於和小於孔徑的顆粒。顆粒截留被認為包括通過疏水、 離子和其他相互作用來大小排阻和吸附。汙染機制可包括孔堵塞、濾餅形成和/或孔收縮。 深層過濾器是有利的，因為它們去除汙染物，並且還是一次性形式，從而消除了驗證問題。 [0063] 本文所用術語"可萃取的"指在適合的溶劑存在的情況下，汙染物能夠潛在地遷移 或從塑料和聚合物化合物中萃取入生物藥物或藥物製劑等，所述塑料和聚合物化合物例如 用於製造過濾器介質或膜、過濾器殼體介質或膜支撐層、環形墊圈或所述過濾器的任意其 它聚合成分。
[0064] 本文所用術語"萃取劑"通常指具有良好清洗性能的液體物質。它們增加的溶解 力、低表面張力、耐燃性和穩定性使得其很適合用於蒸氣脫脂應用。它們專門用於耐用地清 洗土壤的例如油、脂肪和蠟的媒介。包括HFE-71DE、HFE-72DE、HCFC-141b、Vertrel MCA或 Vertrel MCA+的溶劑均為用於烴和碳氟化合物脂肪和油的溶劑；所述溶劑還泡脹大多數彈 性體。高溶解力和低毒性使得它們成為破壞臭氧層化合物、氯化溶劑以及溴丙烷的理想替 代物。
[0065] 本文所用術語"絮凝"指向溶劑中添加本文所述的絮凝劑如聚合物或化學處理 (例如酸處理），從而去除一或多種懸浮的不溶性或可溶性雜質。必須將聚合物以允許自發 形成不溶性聚合體的濃度加入溶液，所述不溶性團聚體能通過典型的固液分離方法從溶液 中去除。
[0066] 在使用本文所述的刺激響應性聚合物從包含靶分子和一或多種雜質的組合物或 樣品中純化靶分子（例如感興趣的多肽或蛋白）的情況下，術語"分離（isolating)"，純 化"和"分離（separating)"在本文中可互換使用。在一些實施方案中，通過利用本文所述 的刺激響應性聚合物從樣品中去除（完全或部分）一或多種雜質，增加樣品中靶分子的純 度。在另一個實施方案中，通過將靶分子從樣品中的一或多種雜質中沉澱，增加樣品中靶分 子的純度。
[0067] 本文所用短語"低（low)或較低（lower)有機可萃取介質"指一種介質，當用有機 溶劑萃取時，導致萃取物的去除，所述萃取物能在誇張的時間和溫度條件下從材料中遷移 進入包括水的溶劑。
[0068] 本文所用術語"單克隆抗體"指獲自一群實質上均質的抗體的抗體，即構成該群的 各個抗體除了少量可能天然存在的突變之外是相同的。
[0069] 術語"百萬分之（parts per million) "或"ppm"在本文中可互換使用，指使用本 文所述的刺激響應性聚合物純化的期望的靶分子（例如靶蛋白或抗體）的純度的度量。相 應地，該度量可用於測量純化過程後存在的靶分子量，或測量不期望的實體的量。在一些實 施方案中，本文所用的單位" ppm"指以毫克/毫升計的感興趣的蛋白中的以納克/毫升計 的溶液中的雜質例如HCP或CHOP的量（即CHOP ppm = (CHOP ng/ml)八感興趣的蛋白mg/ ml))。當所述蛋白是乾燥的時（例如通過低壓凍幹法），ppm指（CHOP ng)/(感興趣的蛋白 mg))。
[0070] 術語多肽的"pi"或"等電點"在本文中可互換使用，指多肽的正電荷與其負電荷 平衡的PH值。pi可由多肽的胺基酸殘基或多肽攜帶的糖的唾液酸殘基的淨電荷計算而得， 或由等電點聚焦確定。
[0071] 本文所用術語"沉澱"指將結合（例如在具有感興趣的生物分子的複合物中）或 不結合聚合物或其他可溶性物質從水性和/或可溶性狀態改變成非水性的和/或不溶性狀 態。
[0072] 本文所用術語"孔徑"和"標稱（nominal)孔徑"指保留60-98%比率的大部分微 粒的孔徑。
[0073] 術語"多肽"或"蛋白"在本文中可互換使用，通常指具有多餘約10個胺基酸的肽 和蛋白。在一些實施方案中，本文所述的刺激響應性聚合物用於從與蛋白或多肽一同存在 於樣品中的一或多種不期望的實體中分離蛋白或多肽。在一些實施方案中，所述一或多種 實體是可以與被純化的蛋白或多肽一同存在於樣品中的一或多種雜質。如上討論，在一些 實施方案中，本文所述的刺激響應性聚合物在將刺激加入樣品時特異性地結合併沉澱感興 趣的蛋白或多肽。在其他實施方案中，在加入刺激時，本文所述的刺激響應性聚合物結合併 沉澱除感興趣的蛋白或多肽以外的實體，例如宿主細胞蛋白、DNA、病毒、全細胞、細胞碎片 和細胞培養添加劑。
[0074] 本文所用短語"初步澄清深層過濾器"指能夠去除全細胞和細胞碎片，從而伴隨著 含有感興趣的靶生物分子和多種細胞碎片以及膠體微粒的進料的初步澄清的過濾器，無需 使用初步澄清離心步驟或初步澄清切向流微量過濾步驟。
[0075] 術語"感興趣的蛋白"、"靶多肽"、"感興趣的多肽"和"靶蛋白"在本文中可互換使 用，通常指治療性蛋白或多肽，包括但不限於使用根據本發明的刺激響應性聚合物純化的 抗體。
[0076] 在一些實施方案中，使用本文所述的刺激響應性聚合物分離（isolate)、分離 (separate)或純化感興趣的多肽或蛋白的"純化步驟"可以是產生"均質"或"純"組合物 或樣品的總純化方法的一部分，本文所用的該術語是指組合物或樣品，其在包含感興趣的 蛋白的組合物中包含少於IOOppmHCP,或者少於90ppm，少於80ppm，少於70ppm，少於60ppm， 少於50ppm，少於40ppm，少於30ppm，少於20ppm，少於lOppm，少於5ppm，或少於3ppm HCP。 本文所用"初步澄清"包括用絮凝劑去除聚集的細胞生物質，包括尺寸大於約10微米（Pm) 的絮凝的細胞碎片和膠體微粒或較小的顆粒。
[0077] 本文所用術語"鹽"指通過酸和鹼的相互作用形成的化合物。可用於本文所述方法 中採用的不同緩衝液的不同的鹽包括但不限於乙酸鹽（例如乙酸鈉）、檸檬酸鹽（例如檸檬 酸鈉）、氯化物（例如氯化鈉）、硫酸鹽（例如硫酸鈉）或鉀鹽。本文所用術語"溶劑"通常 指能夠溶解或分散一或多種其他物質以提供溶液的液體物質。溶劑包括水性和有機溶劑， 其中有用的有機溶劑包括非極性溶劑、乙醇、甲醇、異丙醇、乙腈、己二醇、丙二醇和2, 2-硫 雙乙醇。
[0078] 術語"靶分子"、"靶生物分子"、"期望的靶分子"和"期望的靶生物分子"在本文中 可互換使用，通常指感興趣的多肽或產物，其被期望從一或多種不期望的實體中純化或分 離，所述不期望的實體例如可以存在於含有所述感興趣的多肽或產物的樣品中的一或多種 雜質。
[0079] 本文所用術語"通量"指通過過濾器過濾的體積。
[0080] 在本發明中，開放的分級層的使用允許較大的顆粒透過，並在過濾器的深層內被 捕獲，而不是收集在表面上。
[0081] 優勢是較高的通量，並且保留大的固體（約0. 5微米至約200微米），同時消除 了濾餅形成的問題。在初步澄清過濾器中使用開放孔為這些深層過濾器提供壓力的線性 增加，固體保留，而壓力沒有顯著增加，因此產生高通量。過濾器的結構尺寸結合層的優化 (孔徑和厚度）產生了卓越的過濾特性，其可以保留大量固體。
[0082] 在本發明中，開放的分級層的使用允許進料流中較大的絮凝顆粒透入過濾器深 層，並在過濾器的孔內被捕獲，而不是收集在表面上。本文提供的初步澄清深層過濾器這樣 設置："開放的"頂層構成所述深層過濾器的粗濾（prefiltration)區以捕獲較大的絮凝顆 粒，而底層構成精濾（polishing)區，其捕獲較小的殘留的聚集絮凝顆粒。
[0083] 具有該類型設置的初步澄清深層過濾器展現出如下優勢：（i)較高通量，（ii)較 大絮凝固體的保留，以及（iii)消除濾餅形成的問題。在本文教導的初步澄清過濾器中使 用所述開放孔提供壓力的線性增加，固體保留，而壓力沒有顯著增加，由此產生更高、更期 望的通量。
[0084] 根據本發明的初步澄清深層過濾器的實例如圖1A、1B、1C、1D、1E和IF所示，其中 圖1A、IC和IE示出具有至少7或8層的初步澄清深層過濾器，並在用聚合物絮凝劑（例如 智能聚合物或傳統絮凝劑）處理細胞培養進料時使用。
[0085] 圖IBUD和IF示出具有至少7層的初步澄清深層過濾器，並在用化學處理的進料 (例如酸處理）處理細胞培養進料時使用。
[0086] 圖IA所示的初步澄清深層過濾器示出當用聚合物絮凝劑（例如智能聚合物）處 理細胞培養進料時使用的初步澄清深層過濾器，其具有非織造纖維如聚丙烯的約100微米 標稱孔徑的兩（上）層，約0. 4cm厚，具有非織造纖維如聚丙烯的約50微米標稱孔徑的另 外兩層，約〇. 4cm厚，具有非織造纖維如聚丙烯的約25微米標稱孔徑的另外兩層，約0. 4cm 厚，然後約〇. 35cm厚的諸如纖維素（CE25)材料的單層，以及約0. 35cm厚的諸如硅藻土 (DE40)材料的另一單層。
[0087] 圖IB所示的初步澄清深層過濾器示出當化學處理（例如酸處理）細胞培養進 料時使用的初步澄清深層過濾器，其具有非織造纖維如聚丙烯的約25微米標稱孔徑的兩 (上）層，約0. 4cm厚，具有非織造纖維如聚丙烯的約10微米標稱孔徑的另外兩層，約0. 4cm 厚，具有非織造纖維如聚丙烯的約5微米標稱孔徑的另外兩層，約0. 4cm厚，然後約0. 35cm 厚的諸如纖維素（CE25)材料的單層，然後約0.35cm厚的諸如硅藻土（DE40)材料的另一單 層。可以選擇纖維素或硅藻土層作為最低（底）層。
[0088] 圖IC所示的初步澄清深層過濾器示出當用聚合物絮凝劑（例如智能聚合物）處 理細胞培養進料時使用的初步澄清深層過濾器，其具有包含非織造纖維如聚丙烯的約100 微米標稱孔徑的兩（上）層，約0. 4cm厚，具有非織造纖維如聚丙烯的約100微米標稱孔徑 的另外兩層，約〇. 4cm厚，具有包含非織造纖維如聚丙烯的約100微米標稱孔徑的另外兩 層，約0. 4cm厚，然後約8微米厚的非織造纖維如聚丙烯的單層（底部），約0. 2cm厚。
[0089] 圖ID所示的初步澄清深層過濾器示出當化學處理（例如酸處理）細胞培養進料 時使用的初步澄清深層過濾器，其具有包含非織造纖維如聚丙烯的約50微米標稱孔徑的 兩（上）層，約0. 4cm厚，具有非織造纖維如聚丙烯的約25微米標稱孔徑的另外兩層，約 0. 4cm厚，具有非織造纖維如聚丙烯的約10微米標稱孔徑的另外兩層，約0. 4cm厚，然後約 0. 35cm厚的諸如纖維素（CE25)材料的單層，然後約0. 35cm厚的諸如硅藻土（DE40)材料的 另一單層。可以選擇纖維素或硅藻土層作為最低（底）層。
[0090] 圖IE所示的初步澄清深層過濾器示出當用聚合物絮凝劑（例如智能聚合物）處 理細胞培養進料時使用的初步澄清深層過濾器，其具有包含非織造纖維如聚丙烯的約100 微米標稱孔徑的兩（上）層，約0. 4cm厚，具有非織造纖維如聚丙烯的約50微米標稱孔徑 的另外兩層，約〇. 4cm厚，具有包含非織造纖維如聚丙烯的約25微米標稱孔徑的另外兩層， 約0. 4cm厚，然後約0. 35cm厚的諸如纖維素（CE25)材料的單層，以及約0. 35cm厚的諸如 娃藻土（DE40)材料的另一單層。
[0091] 圖IF所示的初步澄清深層過濾器示出當化學處理（例如酸處理）細胞培養進料 時使用的初步澄清深層過濾器，其具有包含非織造纖維如聚丙烯的約35微米標稱孔徑的 兩（上）層，約0. 4cm厚，具有非織造纖維如聚丙烯的約15微米標稱孔徑的另外兩層，約 0. 4cm厚，具有包含非織造纖維如聚丙烯的約10微米標稱孔徑的另外兩層，約0. 4cm厚，然 後約0.35cm厚的諸如纖維素（CE25)材料的單層，然後約0.35cm厚的諸如硅藻土（DE40) 材料的另一單層。可以選擇纖維素或硅藻土層作為最低（底）層。
[0092] 本文中使用效率參數K描述對具體原料的固體含量歸一的過濾效率。參數K允許 對具有不同固體含量的進料的過濾進行有效比較。
[0093]以下提供的實施例用於向本領域技術人員提供關於如何製備本發明的組合物以 及如何實施本發明的方法的完整公開和描述，並且不是為了限制發明人考慮其發明的保護 範圍。已努力確保所用數字（例如量、溫度等）的準確度，但是應當考慮一些實驗誤差和偏 差。除非另有說明，溫度以攝氏度C計，化學反應在大氣壓或跨膜壓下進行，如本文所示，術 語"環境溫度"指約25°C，"環境壓力"指大氣壓。本發明將通過以下實施例進一步闡明，所 述實施例意在例示本發明。
[0094] 實施例
[0095] 實施例1
[0096] 圖2示出具有不可萃取介質的初步澄清過濾器在600升/m2/小時的工作流速的 衝洗曲線。
[0097] 在有代表性的實驗中，由非織造纖維、纖維素和硅藻土（DE)分級層或非織造纖維 分級層組成的深層過濾器在600升/m2/小時的流速下衝洗約100L/m2。如圖1所示，由非織 造纖維、纖維素和硅藻土（APC和BPC)分級層組成的深層過濾器的衝洗曲線具有約8-lOppm 的T0C，而由非織造纖維（CPC)分級層組成的深層過濾器具有約4ppm的TOC。對於約100L/ m2的衝洗體積，對照深層過濾器（DOHC)的TOC (ppm)為l-3ppm。
[0098] 實施例2
[0099] 圖3示出根據本發明的多個實施方案的具有可萃取介質的初步澄清過濾器在600 升/m2/小時的工作流速的衝洗曲線。
[0100] 在有代表性的實驗中，由可萃取的非織造纖維、纖維素和硅藻土（DE)分級層或可 萃取的非織造纖維分級層組成的深層過濾器在600升/m2/小時的流速下衝洗約100L/m2。 非織造纖維過濾器介質滾筒（直徑12. 5"，寬16"）用3M的氫碳氟化合物溶劑（HFE - 72E) 在TSC萃取器中萃取，噴霧時間1200min，乾燥時間1500min。對於約lOOL/m2的衝洗體積， 由非織造纖維、纖維素和硅藻土（APC和BPC)分級層組成的深層過濾器的衝洗曲線具有 約l_3ppm的T0C，而無衝洗體積時由非織造纖維（CPC)分級層組成的深層過濾器具有低於 Ippm的T0C。對於約100L/m2的衝洗體積，對照深層過濾器（DOHC)的TOC (ppm)為l-3ppm。 即使具有可萃取的非織造介質的APC和BPC深層過濾器具有與DOHC大概相同的lOOL/m2衝 洗體積，以達到目標的l_3ppm的T0C，APC和BPC的柱體積比DOHC多一倍，這表明衝洗體積 減少一半，這樣能顯著減少具有較高通量的初步澄清深層過濾器的整個過程的衝洗。
[0101] 實施例3
[0102] 圖4示出根據本發明的多個實施方案的具有可萃取介質的初步澄清過濾器在100 升/m2/小時的工作流速的衝洗曲線。
[0103] 在有代表性的實驗中，由可萃取的非織造纖維、纖維素和硅藻土（DE)或可萃取的 非織造纖維分級層組成的深層過濾器在600升/m2/小時的流速下衝洗約100L/m2。非織造 纖維過濾器介質滾筒（直徑12. 5"，寬16"）用3M的水化碳氟化合物溶劑（HFE - 72E)在TSC 萃取器中萃取，噴霧時間1200min，乾燥時間1500min。對於約90L/m2的衝洗體積，由非織造 纖維、纖維素和硅藻土（APC和BPC)分級層組成的深層過濾器的衝洗曲線具有約l-3ppm的 T0C，而無衝洗體積時由非織造纖維（CPC)分級層組成的深層過濾器具有低於Ippm的T0C。 對於約100171112的衝洗體積，對照深層過濾器（0011〇的1'0(：(--111)為1-3--111。
[0104] 實施例4
[0105] 用於可萃取的和不可萃取的非織造纖維的靜態浸泡實驗。
[0106] 在有代表性的實驗中，用水化碳氟化合物溶劑（Dupont的Vertrel MCA+，3M的 HFE - 72E)萃取非織造纖維介質的圓盤（disk)，浸泡時間1分鐘，80°C下乾燥時間1小時。 23cm2的可萃取的和不可萃取的非織造圓盤在50ml Milli-Q水中浸泡1小時，並分析總有 機萃取物（TOC)。所有可萃取樣品的TOC低於lppm，然而所有非織造可萃取樣品的TOC較 高。表1比較了可萃取的和不可萃取的非織造纖維的總有機萃取物（TOC)。
[0107] 表1可萃取和不可萃取介質的總有機萃取物（TOC)比較。
[0108]

【權利要求】
1. 用於減少從初步澄清深層過濾介質中釋放有機萃取物的方法，由此在衝洗後通過所 述介質過濾的進料中測量的有機萃取物的總水平約為l_3ppm，所述方法包括： a) 提供具有多孔深層過濾器介質的深層過濾裝置； b) 用有機溶劑從所述介質中萃取；以及 c) 以約10升/m2/小時至約600升/m2/小時的流速衝洗所述介質，由此衝洗後通過所 述介質過濾的原料中測量的有機萃取物的總水平約為1 _3ppm。
2. 權利要求1的方法，其中所述深層過濾器包含至少2個非織造纖維分級層。
3. 權利要求1的方法，其中所述萃取劑選自HFE-71DE、HFE-72DE、HCFC-141b、Vertrel MCA或Vertrel MCA+，所有溶劑均用於烴和碳氟化合物脂肪和油。
4. 權利要求1的方法，其中所述深層過濾器包含至少3個非織造纖維分級層。
5. 權利要求4的方法，其中所述分級層具有約0. 3cm至約3cm的總厚度。
6. 權利要求1的方法，其中所述細胞碎片和膠體微粒具有約0. 5 ii m至約200 ii m的顆 粒大小分布，以及大於約10 U m的平均顆粒大小。
7. 權利要求2的方法，其中所述深層過濾器介質包含非織造纖維、纖維素和硅藻土分 級層的複合物，所述分級層具有開放的標稱孔隙大小評級，足以過濾化學絮凝的原料。
8. 權利要求1的方法，其中所述感興趣的靶生物分子包括單克隆抗體（mAb)、多克隆抗 體和生物治療藥物。
9. 權利要求1的方法，其中所述化學絮凝劑是聚合物或酸。
10. 權利要求1的方法，其中所述化學絮凝劑是智能聚合物。
11. 權利要求10的方法，其中所述智能聚合物是改性聚胺。
12. 權利要求9的方法，其中所述酸是乙酸。
13. 權利要求4的方法，其中所述非織造纖維包含聚丙烯、聚乙烯、聚酯或尼龍。
14. 初步澄清深層過濾方法，其使用含有多孔介質的初步澄清深層過濾裝置，衝洗後具 有較低水平的有機萃取物從所述介質釋放，所述方法包含： a) 提供具有多孔深層過濾器介質的初步澄清深層過濾裝置； b) 用有機溶劑從所述介質中萃取；以及 c) 以約10升/m2/小時至約600升/m2/小時的流速衝洗所述介質， d) 產生較低有機可萃取介質，由此通過所述介質過濾的原料中測量的有機萃取物的總 水平約為l-3ppm;以及 d)使原料通過所述介質。
15. 權利要求14的方法，其中所述深層過濾器包含至少2個非織造纖維分級層。
16. 權利要求14的方法，其中所述萃取劑選自HFE-71DE、HFE-72DE、HCFC-141b、 Vertrel MCA或Vertrel MCA+，所有溶劑均用於經和碳氟化合物脂肪和油。
17. 權利要求14的方法，其中所述深層過濾器包含至少3個非織造纖維分級層。
18. 權利要求17的方法，其中所述分級層具有約0. 3cm至約3cm的總厚度。
19. 權利要求14的方法，其中所述細胞碎片和膠體微粒具有約0. 5 y m至約200 y m的 顆粒大小分布，以及大於約10 U m的平均顆粒大小。
20. 權利要求15的方法，其中所述深層過濾器介質包含非織造纖維、纖維素和硅藻土 分級層的複合物，所述分級層具有開放的標稱孔隙大小評級，足以過濾化學絮凝的原料。
21. 權利要求14的方法，其中所述感興趣的靶生物分子包括單克隆抗體（mAb)、多克隆 抗體和生物治療藥物。
22. 權利要求14的方法，其中所述化學絮凝劑是聚合物或酸。
23. 權利要求14的方法，其中所述化學絮凝劑是智能聚合物。
24. 權利要求23的方法，其中所述智能聚合物是改性聚胺。
25. 權利要求22的方法，其中所述酸是乙酸。
26. 權利要求14的方法，其中所述非織造纖維包含聚丙烯、聚乙烯、聚酯或尼龍。
【文檔編號】C12M1/12GK104334712SQ201380028257
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2013年6月6日 優先權日:2012年6月6日
【發明者】K-S·程, N·辛格 申請人:Emd密理博公司