一種加快多肽‑糖類體系美拉德反應進程的方法與流程

2023-06-12 19:47:56 1

本發明涉及美拉德反應領域，特別是一種利用聚能式超聲加快多肽-糖類體系美拉德反應進程的方法。

背景技術：

美拉德反應又稱為「非酶棕色化反應」，是法國化學家l.c.maillard在1912年提出的。目前美拉德反應廣泛存在於食品工業生產領域，由羰基化合物（還原糖類）和氨基化合物（胺基酸、蛋白質）在一定溫度下接枝結合，經過一系列複雜的反應最終生成棕色甚至是黑色的大分子物質——類黑精，所以美拉德反應又稱羰氨反應，整個反應過程不需要酶類參與就可逐步進行。

美拉德反應在食品領域很普遍。食品加工過程中美拉德反應，會造成胺基酸消耗、糖及蛋白質損失，致使食品營養價值下降，但該過程會賦予食品濃鬱的香味和愉悅的色澤，同時研究表明美拉德反應生成的主要產物（類黑精、還原酮類及一系列含氮、硫的揮發性雜環化合物）具有良好的抗氧化性、抗突變、抗癌、抗衰老、抗菌性、溶解性和乳化性等功能特性（美拉德反應研究進展，李亞麗，2012），如何合理利用和改進美拉德反應值得研究。

目前，美拉德反應主要採用溼法反應，以蛋白、胺基酸、肽等含氨基化合物和葡萄糖、木糖等含羰基化合物進行反應，反應溫度一般在90~130℃，反應時間從1h到8h不等。在食品加工過程中美拉德反應溫度高、時間長，然而長時間的高溫處理，不僅降低食品品質、破壞食品營養、消耗大量能源，也更容易產生大量具有神經毒性、遺傳毒性和潛在致癌性的對人體有害的化合物，如丙烯醯胺等（丙烯醯胺與類黑精生成量的相關性及其體外代謝初探，王亞君，2009）。如何縮短反應時間、降低反應溫度是改進美拉德反應的一個重要方向。

早在20世紀人們就發現超聲波可用於催化化學反應，其加快化學反應並非靠聲場與反應物的直接作用，而是通過超聲過程中產生的空化作用及其引起的衝擊波和微射流（超聲波在催化過程中的應用，於鳳文，2001）。空化作用是指原存在於液體中的氣泡受到聲場作用而振蕩、生長、崩潰、閉合的過程，氣泡崩潰瞬間可以在局部形成高溫和高壓，使局部原本緩慢的化學反應被瞬時催化而加快進程。氣泡崩潰產生高溫高壓的同時也會帶來強烈的衝擊波和微射流，加快分子運動、強化傳質過程，進而加快化學反應的進程。因此，利用超聲波有助於加快反應進程、降低反應溫度，有望彌補美拉德反應溫度高、時間長的缺點。目前已有超聲輔助美拉德反應的研究，主要集中於超聲輔助蛋白質-糖類體系美拉德反應，用於蛋白質改性等研究，對提升美拉德反應產物的抗氧化能力效果顯著（酪蛋白-葡聚糖接枝改性研究，劉娟，2008）。多肽參與的美拉德反應與蛋白質-糖類體系有很大的區別，多肽相比大分子蛋白反應活性更高，美拉德反應過程中能生成更多的類黑精物質，但是關於超聲輔助多肽-糖類體系美拉德反應，用以降低反應溫度和減少反應時間方面的研究目前還未見報導。

技術實現要素：

本發明的目的是為了克服美拉德反應溫度高、反應時間長的缺點，提供一種利用聚能式超聲技術加快美拉德反應進程、降低反應溫度的方法。

為了實現上述發明目的，技術方案如下：

聚能式超聲設備，主要由聚能式超聲探頭、超聲發生器、超聲作用室、控制器等組成。超聲探頭是超聲儀器與樣品的接觸界面，超聲發生器產生超聲，超聲作用室是樣品接受超聲作用的場所，控制器控制超聲發生器和超聲作用室，其中控制器通過線纜分別與超聲發生器和超聲作用室連接，超聲探頭通過線纜與超聲發生器連接。

一種加快多肽-糖類體系美拉德反應進程的方法，按照下述步驟進行：取燒杯加蒸餾水並調ph到6~8，90~100℃預熱整個超聲作用室和蒸餾水。升溫到位後，將草魚肉水解多肽和葡萄糖按7:1（質量比）加入各燒杯，迅速混勻後把燒杯放入超聲作用室，將超聲探頭浸沒於美拉德反應容器中，設置功率密度800~1200w/l、超聲頻率28khz後開動超聲發生器進行超聲作用。美拉德反應進行60min後取出燒杯，迅速冰浴降溫以終止美拉德反應，取樣以備測定。

草魚肉水解多肽乾燥粉末的製備方法，按照下述步驟進行：

將草魚肉用絞肉機絞成魚糜，取草魚魚糜按液固比4ml/g用蒸餾水溶解，在50℃、ph7.0條件下按酶與底物（e/s）質量比1:100加入風味蛋白酶，酶解7.8h，酶解物經沸水浴滅酶（100℃，10min）和離心（4000r/min，10min）後得上清，將上清濃縮、凍幹後即得草魚肉水解多肽乾燥粉末樣品。

本發明的優點：

藉助聚能式超聲輔助美拉德反應，在相同反應效果下，加快反應速率、降低反應溫度。相比不加超聲作用120℃下反應60min的反應體系，超聲作用的反應體系類黑精濃度能提高4.79~14.85mmol/l，反應速率提高24.16~74.89%，同時反應溫度降低20~30℃。

具體實施方式

在本發明中所使用的術語，除非有另外說明，一般具有本領域普通技術人員通常理解的含義。下面結合具體的實施例，並參照數據進一步詳細地描述本發明。應理解，這些實施例只是對本發明進行進一步說明，不能理解為對本發明保護範圍的限定，該領域的技術工程師可根據上述發明的內容對本發明作出一些非本質的改進和調整。

在以下的實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領域中公知的常規方法。所用試劑的來源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現時標明，其後所用相同試劑如無特殊說明，均以首次標明的內容相同。

本實施例和對照例所用草魚購買自江蘇省鎮江市學府路歐尚超市。

本實施例和對照例所用魚糜由草魚肉經絞肉機絞肉製得。

本實施例和對照例所用風味蛋白酶購買自無錫市聯合恆洲化工有限公司，酶活為500lapu/g。lapu指每分鐘水解1mmoll-亮氨酸-對硝基苯胺所需的酶量。

本實施例和對照例所用葡萄糖購買自國藥集團化學試劑有限公司。

本實施例和對照例所用的草魚肉水解多肽乾燥粉末由以下方法製備：

（1）按照25%的底物濃度（m/v）用蒸餾水配置魚糜混濁液，放入50℃恆溫水浴鍋並調節ph到6.75。

（2）按酶底（e/s）質量比1:100加入風味蛋白酶，酶解7.8h，用naoh溶液維持反應體系ph維持在6.75。

（3）酶解結束，經沸水浴和離心獲得上清液，將其濃縮、乾燥後得草魚肉水解多肽乾燥粉末，置於乾燥皿中保存備用。

其中乾燥方式可以為冷凍乾燥、噴霧乾燥或其他合適的乾燥方式。

本實施例聚能式超聲作用方法如下：

本實施例所用聚能式超聲設備購自溫州博創輕工機械有限公司，型號bc-cs-1200。主要由聚能式超聲探頭、超聲發生器、超聲作用室、控制器等組成。細節操作參考說明書。

（1）取燒杯加蒸餾水並調ph到6~8，於90~100℃下預熱，升溫到位後加入14g草魚肉水解多肽乾燥粉末和2g葡萄糖並迅速混勻，將燒杯置於超聲作用室，使超聲探頭浸沒於液面以下，設置功率密度800~1200w/l後開動超聲發生器進行超聲作用。

（2）超聲作用60min後，迅速冰浴降溫，終止美拉德反應，取樣以備測定。

其中所述草魚肉水解多肽可由其他多肽或肽類衍生物簡單替代。

其中所述葡萄糖可由其他還原糖簡單替代。

類黑精是美拉德反應終產物，類黑精濃度越高表明美拉德反應進行越徹底。本實施例和對照例類黑精檢測方法如下：

（1）超聲結束降溫終止反應後取得的樣品溶液經離心（4000r/min，10min）後，取上清液備測。

（2）每次測定樣品稀釋後取樣0.2ml加入3.5ml磷酸緩衝液（ph8.5，1/15mol/l），在420nm處測定吸光值a420。根據公式c=（a420/ε×n）/100計算類黑精濃度，其中n（這裡n=18.5）為稀釋倍數，ε取500l·mol-1·cm-1，c為類黑精濃度，單位為mmol/l，所有樣品以蒸餾水為空白，以不使用超聲作用的草魚肉水解物乾燥粉末-葡萄糖溶液為對照進行實驗。

對照1

取500ml燒杯加入500ml蒸餾水調ph到7.0，於120℃油浴中預熱15min後，加入14g草魚肉水解多肽乾燥粉末和2g葡萄糖，迅速混勻並保持攪拌，120℃反應60min。迅速冰浴降溫到4℃，終止美拉德反應。取樣離心後取上清0.2ml，加入3.5ml磷酸緩衝液（ph8.5，1/15mol/l），在420nm處測定吸光值a420。代入公式計算類黑精濃度。樣品中類黑精的濃度為19.83±1.33mmol/l。

實施例1

取500ml燒杯加入500ml蒸餾水調ph到7.0，於90℃油浴中預熱15min後，加入14g草魚肉水解多肽乾燥粉末和2g葡萄糖，迅速混勻後放入超聲作用室，使聚能式超聲探頭浸沒液面，設定超聲功率為400w，超聲作用60min後，迅速冰浴降溫到4℃，終止美拉德反應。取樣離心後取上清0.2ml，加入3.5ml磷酸緩衝液（ph8.5，1/15mol/l），在420nm處測定吸光值a420。代入公式計算類黑精濃度。樣品中類黑精的濃度為24.62±2.07mmol/l，相比於對照1，類黑精濃度提高了4.79mmol/l。

實施例2

取500ml燒杯加入500ml蒸餾水調ph到7.0，於95℃油浴中預熱15min後，加入14g草魚肉水解多肽乾燥粉末和2g葡萄糖，迅速混勻後放入超聲作用室，使聚能式超聲探頭浸沒液面，設定超聲功率為400w，超聲作用60min後，迅速冰浴降溫到4℃，終止美拉德反應。取樣離心後取上清0.2ml，加入3.5ml磷酸緩衝液（ph8.5，1/15mol/l），在420nm處測定吸光值a420。代入公式計算類黑精濃度。樣品中類黑精的濃度為28.26±1.41mmol/l，相比於對照1，類黑精濃度提高了8.43mmol/l。

實施例3

取500ml燒杯加入500ml蒸餾水調ph到7.0，於100℃油浴中預熱15min後，加入14g草魚肉水解多肽乾燥粉末和2g葡萄糖，迅速混勻後放入超聲作用室，使聚能式超聲探頭浸沒液面，設定超聲功率為400w，超聲作用60min後，迅速冰浴降溫到4℃，終止美拉德反應。取樣離心後取上清0.2ml，加入3.5ml磷酸緩衝液（ph8.5，1/15mol/l），在420nm處測定吸光值a420。代入公式計算類黑精濃度。樣品中類黑精的濃度為31.33±1.27mmol/l，相比於對照1，類黑精濃度提高了11.50mmol/l。

實施例4

取500ml燒杯加入500ml蒸餾水調ph到7.0，於90℃油浴中預熱15min後，加入14g草魚肉水解多肽乾燥粉末和2g葡萄糖，迅速混勻後放入超聲作用室，使聚能式超聲探頭浸沒液面，設定超聲功率為600w，超聲作用60min後，迅速冰浴降溫到4℃，終止美拉德反應。取樣離心後取上清0.2ml，加入3.5ml磷酸緩衝液（ph8.5，1/15mol/l），在420nm處測定吸光值a420。代入公式計算類黑精濃度。樣品中類黑精的濃度為26.38±1.39mmol/l，相比於對照1，類黑精濃度提高了6.55mmol/l。

實施例5

取500ml燒杯加入500ml蒸餾水調ph到7.0，於95℃油浴中預熱15min後，加入14g草魚肉水解多肽乾燥粉末和2g葡萄糖，迅速混勻後放入超聲作用室，使聚能式超聲探頭浸沒液面，設定超聲功率為600w，超聲作用60min後，迅速冰浴降溫到4℃，終止美拉德反應。取樣離心後取上清0.2ml，加入3.5ml磷酸緩衝液（ph8.5，1/15mol/l），在420nm處測定吸光值a420。代入公式計算類黑精濃度。樣品中類黑精的濃度為30.45±1.68mmol/l，相比於對照1，類黑精濃度提高了10.62mmol/l。

實施例6

取500ml燒杯加入500ml蒸餾水調ph到7.0，於100℃油浴中預熱15min後，加入14g草魚肉水解多肽乾燥粉末和2g葡萄糖，迅速混勻後放入超聲作用室，使聚能式超聲探頭浸沒液面，設定超聲功率為600w，超聲作用60min後，迅速冰浴降溫到4℃，終止美拉德反應。取樣離心後取上清0.2ml，加入3.5ml磷酸緩衝液（ph8.5，1/15mol/l），在420nm處測定吸光值a420。代入公式計算類黑精濃度。樣品中類黑精的濃度為34.68±1.88mmol/l，相比於對照1，類黑精濃度提高了14.85mmol/l。