由原核細胞製備活性t-PA的技術的製作方法

2023-06-12 12:43:31 3

專利名稱：由原核細胞製備活性t-PA的技術的製作方法
技術領域：
本發明涉及人組織型纖維蛋白酶元激活物(t-PA，下同)表達結構的構 建及其在工程化改造的原核細胞內的高效表達。其產物具有生物活性，可 用於血栓性疾病的治療。所在的技術領域與生命醫藥和生物技術有關。
技術背景人t-PA在人體內的凝血和溶血系統中起著十分重要的生理作用。 t-PA由527個胺基酸編碼組成，在蛋白結構上有18個二硫鏈，其形成的 構形與蛋白生理功能有極為重要的作用。在蛋白質結構上，人t-PA由五個 不同的功能區構成，它們分別是(l).環狀手指功能區；(2).生長因子功 能區；(3).和(4).兩個相似功能的區域，Kringle l和Kringle2，此功能 性區可特異性結合於纖維蛋白凝塊；(5).絲氨酸蛋白酶，負責激活纖溶酶 元，使其轉化為纖溶酶，降解纖維蛋白，溶解血栓。由於t-PA具有上述溶血栓的重要生理功能，在臨床上可用於治療急性 心肌梗塞、腦血栓形成、肺梗塞和其他血栓性疾病。因此世界各國科學家 對其進行了廣泛深入的研究和開發，包括功能結構上的改構和各種表達系 統方面的(Cleary S， et al， Biochem. 1989， 28(4): 1884-91; Jarvis DL， et al， Mol Cell Biol 1989， 9(1):214-23; Anne M. F. ， et al， Biotech. And Applied Biochem. 1988， 10， 454-464: Canion丄Refino， et al， Thrombosis and Haemostasis，1993， 70(2)313-39; Kenichi F. ， et al. Circulation 1997， 95 (3) :715-722)以達到增強其溶栓功能和延長血液半 衰期或達到低成本生產之目的。以前在原核細胞表達系統中對人t-PA的大多數研究證明原核細胞可 以表達人t-PA，但最主要的問題是原核細胞表達的人t-PA在胞槳內形成 包涵體，且不具有生物活性，因此，需要耗時、複雜繁瑣的復性工藝。研 究還發現其主要原因是表達的人t-PA蛋白質在細胞漿內不能形成正確的 蛋白質空間構形。隨著分子、細胞生物學研究技術的發展，複雜大分子蛋白質在原核細胞 表達系統表達的研究有重大突破，使人t-PA在原核細胞內進行商業化生產 成為可能。如前所述，由於人t-PA結構上有18個二硫鍵，由此形成的蛋 白空間構形對人t-PA的生物活性起著決定性的作用。細胞中蛋白質二硫 鍵的形成是一個十分複雜的過程，是細胞內多種與二硫化物氧化還原作用 有關的醮類相互作用有關，即細胞中與二硫鍵形成有關的DsbA、 DsbB、 DsbD和DsbC,都是細菌周質Dsb家族中的成員，直接或間接參與二硫鍵的 形成，其中尤以DsbC的作用最強。研究表明DsbC是一種二硫鍵同分異構 酶，是二瑰鐮同分異構作用的良好催化劑。DsbC的 化還原狀態與細胞正確地拼裝多個二硫鍵的蛋白質的能力 緊密有關。在正常狀態下，細菌周質處於氧化態，野生型DsbC蛋白質活性 區在細菌周質處於還原態時才具有催化活性(ArneR.， et al. J. Baterio.， 1997， 179(21) :6602~6608)，故二硫鍵很容易在周質形成，不會在還原態 的細菌胞內形成。而細菌胞內還原態是硫氧還蛋白還原酶(trsB)/穀胱甘肽還 原酶(gov)基因控制的。 一旦這二種基因發生突變，將使細菌胞內還原態轉 變為氧化態，這將大大有利於無信號肽DsbC催化二硫鍵在氧化態的細菌 胞內形成，提高含多個二硫鍵蛋白質的轉錄和合成。在正常狀態下，當原核細胞表達一種含多個二硫鍵的複雜蛋白質時， 原核細胞本身催化二硫鍵形成的相關酶功能不足，不能使表達的複雜大分子蛋白質形成正確構形，故不能合成有生物活性的t-PA。這是表達蛋白不具有生 物活性的主要原因。然而，通過將克隆的DsbC基因轉入表達原核宿主菌 進行表達，將顯著增強其催化功能，使複雜蛋白的多二硫鍵得以形成而具 有生物活性。此外，在原核細胞內表達外源蛋白質需要一種在原核細胞內可驅動編 碼外源蛋白貭的DNA分子轉錄的原核細胞表達載體。這種載體不但需要有 一種強啟子，而且還要能緊密控制這種強啟子驅動的調控元件。研究證實 含有由阿拉佰糖arabinose操縱子的Pbad啟動子和其調控基因araC組成 的表達調控元件的表達載體符合上述要求。調控基因araC是一個正負調 控因子，控制著Pmd啟動子的轉錄開啟功能，其轉錄開啟功能和轉錄強弱 能力取決於誘導劑阿拉佰糖arabinose是否存在和使用量的多少(luz M. G.， et al. J Bacterio. 1995, 177(14) :4121—4130)。同樣，為了便於表達活性蛋白的分離純化，研究人員也一直試圖通過 一種轉膜信號多肽和目的基因的觸合，達到能將表達目的基因產物蛋白質 分泌到培養液之目的。目前研究應用的轉膜信號多肽有PelB、 LainB、 MalE、 PhoA和0i >A等(J.Pratap. ，et al.Mol. Gen.Genet (1998)258:-333)，但 各忡轉膜信號多肽和目的基因產物蛋白的分離率不一，可能與使用的表達 宿主細菌不同有關。人t-PA是一種具有顯著治療效果和巨大市場應用前景的重組藥物。目 前在臨床上應用的人t-PA，包括其突變體，都是經由真核細胞CHO系統生產的，故不能避免遇到生產的人源重組T-PA產品雖有生物活性，但產量較低，產品成本髙昂的瓶頸。價格昂貴，非一般病人所能承受。因此採用新的途徑 開發出成本更低、半衷期更長、溶栓功能更強的新一代人源重組T-PA產品藥物， 在我國將具有廣闊的市場前景，並將產生良好的社會效益和巨大的經濟效益。發明內容本發明的目的是構建一種融合有跨膜信號肽的突變型人組識型纖溶酶 原激活劑(坦t-PA,下同〉的、由阿拉佰糖arabinose操縱子的Pbad啟動子 和其調控基因araC組成的表達調控元件的表達質粒，並通過mt-PA表達質 粒與DsbC表達質粒共轉化(texB)/(gov)基因突變的宿主菌，形成高表達、可 分泌的、具有生物活性人mt-PA的工程菌，因而能成為一種可進行人mt-PA 產生化生產的原核細胞表達系統。為達成本發明的目的，提供了以下幾個方面的

發明內容
本發明的第一方面，提供了一種突變型人t-PA分子結構，該分子結構 中t-PA的野生型蛋白酶功能P區內與纖溶酶激活劑抑制因子-1結合的氨 基酸296-299(Lys-His-Arg-Arg)突變為(Ala- Ala- Ala- Ala)，因而具有更強溶栓功能和較長半衰期。本發明的第二方面，提供了一種含有信號肽0mpA的，由阿拉佰糖 arabinose操縱子的Pmd啟動子驅動和其調控因子araC組成表達調控元件 的原核細龐表達載體。因而，此表達載體具有緊密調控、高水平表達和分泌外源表達蛋白質的功能。本發明的第三方面，提供了一種融合0mpA信號信與突變型mt-PA的表 達結構，由阿拉佰糖arabinose操縱子的Pbad啟動子驅動和其調控因子 araC基因組成調控元件的mt-PA表達質粒。本發明的第四方面，提供了一種由啟動子T7和LacZ調控的、表達同分 異構,DsbC基因的表達質粒。在另一優選例中，提供了一種由啟動子T7和LacZ調控的、表達無信號 肽的同分異構酶DsbC的表達質粒。本發明的第五方面，提供了一種由人mt-PA表達質粒和DsbC表達質粒 或無信號肽DsbC表達質粒共轉化texB/gov基因突變的原核表達宿主菌， 構成表達人通t-PA的工程菌。在另一,例中，提供了一種人mt-PA表達質粒轉化經DsbC表達質粒 或無信號肽I^bC表達質粒預先轉化的texB/gov基因突變的原核感受態表 達宿主菌，構成表達人mt-PA的工程菌。附圉欐明圖l:野生型人t-PA和突變型人t-PA的內切酶酶切圖譜用內切酶Xbal 和Notl消化野生型人t-PA;用內切酶Ncol、 Hindlll和Notl消化突變型 人t-PA，電泳分離。第一道為DNA分子量標準物；第二道和第三道分別野生型和突變型人t-PA。圖2:為含有分泌信號肽OmpA和人mt-PA表達序列的、由阿拉佰糖 arabinose操縱子的P咖啟動子驅動和其調控因子araC基因組成調控元件 的mt-PA表達質粒圖譜。圖3: SDS-PAGE蛋白電泳的人邁t-PA表達圖譜第一道為蛋白質分子量標 準物；第二道、第三道、第四道和第五道分別為末誘導、l小時、2小時和 3小時誘導的mt-PA和DsbC蛋白產物。箭頭所指為表達蛋白質產物，在上 的為mt-PA,在下的為DsbC。圖4: SDS-PAGE蛋白電泳的分泌至細胞培養液中的t-PA表達產物，箭頭為 表達產物.。第一道為蛋白質分子量標準物；第二道為3小時誘導的mt-PA蛋 白產物；第三道為l小時誘導的mt-PA蛋白產物。箭頭所指為表達蛋白質產 物。圖5:細胞培養液中的人mt-PA表達產物的生物活性檢測。第一道和第二道 分別為3小時誘導和l小時誘導的mt-PA蛋白產物。箭頭所指白色條帶為有 生物活性表達蛋白質產物。圖6:細菌內表達人mt-PA的生物活性檢測。第一道和第二道分別為1號和2 號工程菌2小時誘導的mt-PA蛋白產物。箭頭所指白色條帶為有生物活性表 達蛋白質產物。具體實詹方式一、野生鏖人t-PA的突變其方法是釆用基因突變技術，使野生型人t-PA 的野生型蛋白酶功能P區內與纖溶酶激活劑抑制因子-1結合的胺基酸 296-299(Lys-His-Arg-Arg)突變為(Ala- Ala- Ala- Ala)。並在突變區形 成新的核普鶄內切酶Notl位點。 1).以野生型人t-PA為模板，用人工合成的引物1和引物2，引物3和引物4分別進行ra擴增。引物設計如下引物l: (27鵬r，並引入Ncol內切酶位點，字符框邊)5, 一gcjccat^gagc c縛atcttac caag -3， 引物2: (34mer，並引入Notl內切酶位點，字符框邊)5， 一 ccgctccgggcgatgcagcggccgcggcaaagat-3，引物3: (34鵬r,並引入Notl內切酶位點，字符框邊)5, -ttgccfecggccgctgcatcgcccggagagcggtW引物4: (33 mer，並引入Hindlll內切酶位點，字符框邊)5, -gc)aagctt|tcacggtcgcatgttgtcacgaatc-3，PCR擴増產物分鰣經tailing加上腺嘌呤後，連接至T-easy載體。轉化細 菌後，進行擴繒、抽提、純化，經DNA測序確定。將中含上述謝A片段的T-easy載體質粒DNA分別用Ncol和Notl， Notl 和Hindlll完全,切消化，將Ncol-Notl和Notl-Hindlll 二個DNA片段，分離純化後備用。二、含有核糖體銪合位點(-AGGAGG-)分泌信號肽OmpA的原核細胞表達載體 pBAD331).人工合成如下含有核糖體結合位點(-AGGAGG-)分泌信號肽OmpA DNA 片段:(5，-3，，核糖體結合位點為淺黑色區；在其5'-末端引入Nhel、在其3'-末 端分別引入Ncol和Sacl內切酶位點，字符框邊)tttccjgctag 4aggaggaaa cgatgaaaaa gacagctatc gcgattgcag tggcactggc tggtttcgctaccgtag cca tg漆c gagct c ggta2).分別用Mhel和S敏l內切酶消化分泌信號肽OmpADNA片段和原核細胞 表達載體pBi^33，經電泳分離純化後，進行拼接，轉化感受態細菌。然後篩選 成功轉化的if株進行質粒DNA擴增，抽提純化。最後用前述二種Nhel和Sacl 內切酶消化證實。三、含磁餘分港翁號勝O鵬pA和mt-PA表達序列的原核表達質粒的構建1) .用bfcoi和Hindlll內切酶消化含有分泌信號肽OmpA的原核細胞表達 載體醉AD33,分離純化；2) .將實,一中對人t-PA進行PCR反應後，分離純化備用的Nco1-Notl的 DNA片段和Mot1-Hindlll的DNA片段與分離純化的Ncol-Hindlll的原核細胞表 達載體pBiyM3片段進行拼接，並轉化感受態細菌。然後進行擴增、抽提和純 化質粒DNA。最後用酶切圖譜證實對pBAD33/mt-PA表達質粒構建。四、含同分,酶DsbC表達質粒的構建1).應用PCR法對DsbC基因進行改造。以DsbC基因為模板，用人工合成 的引物進行PCR反應。引物設計如下引物l:(Mmer，在其5'-端引入Ndel內切酶位點，字符框邊),"Cggatacatat tgatgaagaa aggt-3'引物2: (25鵬r,在其5，-端引入Ndel內切酶位點，字符框邊)5， — gcjaagct咖tatttaccgctggtca -3，PCR擴鱅產物分別經tailing加上腺嘌呤後，連接至T-easy載體。轉化細 菌後，進行擴增、抽提、純化，經DNA測序確定。應用Wel和Hindlll內切酶消化含有DsbC的T-easy質粒DNA，分離純化 DsbC酶切片段備用2) .用恥el和HindUl內切酶消化原核細胞表達質粒Peal-n(源自 stratagene公司)，分離純化備用3) .將l)和2)中的DsbC醃切片段和原核細胞表達質粒Peal-n酶切片段進 行拼接反應，並轉化感受態細菌，進行擴增、抽提、純化，最後用酶切圖譜證 實對Pcal-nCNbC表達質粒構建。五、含無信兮勝同分異構酶DsbC表達質粒的構建1).應用POt法對DsbC基因進行改造。以DsbC基因為模板，用人工合成的引 物進行PCR反應。引物設計如下引物1:(效ibct，在其5'-端引入Ndel內切酶位點，字符框邊) formula see original document page 14， 引物2: (25鵬r,在其5，-端引入Ndel內切酶位點，字符框邊)formula see original document page 14，PCR擴權產物分別經tailing加上腺嘌呤後，連接至T-easy載體。轉化細 菌後，進行擴增、抽提、純化，經DNA測序確定。應用附el和Hindi 11內切酶消化含有DsbC的T-easy質粒DNA，分離純化 DsbC酶切片段備用；2) .用恥el和Hindlll內切酶消化原核細胞表達質粒Peal-n(源自 stratagene公司)，分離純化備用；3) .將l)和2)中的DsbC酶切片段和原核細胞表達質粒Peal-n酶切片段進 行拼接反應，並轉化感受態細菌，進行擴增、抽提、純化，最後用酶切圖譜證 實對無信號肽Pcd-n/DsbC表達質粒構建。六、構建ft^C平表達、有生物活性的分泌型人mt-PA工程菌應用本發明中構建pBAD33/mt-PA表達質粒和Pcal-n/DsbC表達質粒或無 信號肽的P^i/DsbC表達質粒，按常規實驗操作方法，共轉化texB/gov基因 突變的原棟感受態表達宿主菌Qrigami(DE3),篩選高表達、有生物活性的 mt-PA菌株，確定表達人mt-PA的工程菌。七、表達艙人nrt-PA的生物活性檢淵採用纖維素板法檢測本發明中表達的mt-PA生物活性。具體操作如下 首先，按0.W(重量/體積)a-酪氨酸和每毫升含IO微克的纖溶蛋白酶原的比例，共聚膠形成濃度為12W的十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙醯胺膠； 其次，上樣後，在溫度攝氏4度，低電壓電泳過夜。次日用2. 5%的TritonX-100漂洗聚丙載胺膠1小時，去除膠中的十二烷基硫酸鈉(SDS)。然後，用大量的蒸餾水漂洗聚丙醯胺膠以去除Triton X-100;再其次，將上述的聚丙醯胺膠用pH為8. 3、濃度為0. 1摩爾的甘氨酸 緩衝液在攝氏37溫度孵化5小時。最後用卡馬氏亮蘭對聚丙醯胺膠染色 15分鐘並進行脫色。結果評估有生物活性的人t-PA及其衍生物在膠中顯示為一條亮白 的條帶。其截弱與t-PA及其衍生物的便用量和活性有關。序列表Street :廣州S際企業孵化器A區610房City :廣州State -廣東Country :中頃PostalCode : 510633〈110〉 LastNane :王<110〉 FirstNane :尚武Ssqueiice〈210〉 1〈211〉 Length : 95SequenceName : OmpA信號肽 SequenceDescription : Type : DNA Organismfeme -細菌〈400> PreSequenceString : 1tttccgctag caggaggaaa cgatgaaaaa gacagctatc gcgattgcag tggcactggc 60 tggtttcgct accgtAgcca tggccgagct cggta 95〈210〉 2〈2ID Length : 23SequenceName c OnpA信號肽SequenceDoscription : <212〉 Type : PRT 〈213〉 Qrg柳ismName :細菌 <400〉 RreSequenoeStriiJg : 5Met Lys Lys Thr Ala lie Ala lie Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe 15 10 15Ala Thr Val Ala Met Ala Glu Leu Gly 加 24〈210〉 3〈211〉 Length : 1609Sequ抑crite一 人源突變型纖溶酶原激活劑(nt-PA) Sequenccfi^icription : 〈212〉 Type : 0NA Qrgani^Na e : AX序列 RreSeq卿eeString : 3gcgccat鵬a^ccagatcttaccaagtgatctgcagagatgaaaaaacgcagatgatat60accagcaacmtcc^tcat驟ctgegccctgtgctcagaagcaaccgggtggaatattgct120ggtgcaacagt驟鄉ggcacagtgccactc鄰tgcctgtcaa幼gttgcatgcgagcc朋180ggtgtttcaatgccagc鄉ccctgtacttctcagatttcgtgtgcragt240gccccgaaggatttgctg碟aagtgctgtgaaatagataccagggccacgtgctacgagg300accagggcatcagctacaggggcacgtggagcacagcggagagtggcgccgagtgcacca360actggaacaggcccagaagccctac鄰cgggcggaggccagacgccatca420ggctgggcctg^aaccacaactactgcagaaacccagatcgagactcaaagccctggt480gctacgtcttaagtacagctcagagttetgcagcacccctgcctgctctg540agggaaacagtttgggaatgggtcagcctaccgtggcacgcac鄰cctca600ccgagtcgggtgcctcctgcctcccgtggaattccatgatcctgataggcaaggtttaca660cagcacagaaccccagtgcccaggcactgggcctgggcaaacataattactgccggaatc720ctgatgfi^gatgccaagccctggtgccacgtgctgaagaaccgcaggctgacgtgggagt780actgtgatgttccacctgcggcctgagacagtacagccagcctcagtttc840gcatcaaagga^gctcttcgccgacatcgcctcccacccctggc鄉ctgccatctttg900ccgcggccgctgcatcgccc鵬柳cggttcctgtgcgggggcatactcatcagctcct960gctggattctctctgccgcccactgcttccaggagaggtttccgccccaccacctgacgg1020tgatct敏gc腳tggtccctggcgaggaggagcagaaatttgaagtcg讓saaaatacattgtccataaggaattcgatgatgacacttacgacaatgacattgcgctgc1140tgcagctgaaate鵬ttcgtcc鄰ctgtgcccaggagagcagcgtggtccgcactgtgt1200gccttcccccg欲g靜cctgc鄰ctgccggactggacggagtgtgagctctccggctecg1260gc幼gcatgaggecttgtctectttctattcgg^cggctgaagg鄉ctcatgtcagac1320tgtacccatccagc鄰ctgcacatcacaacatttacttaacagaacagtcaccgac朋ca1380tgctgtgtgccg糊cggcgggccccaggcaaacttgcacgacgcctgcc1440agggc與ttcg^M8fccccctggtgtgtctgaacgatggccgcatgactttggtgggca1500tcatcagctgggfcct能gctgt碟acaga鄰gatgtcccgggtgtgtacaccaaggtta1560agac紹gattcgtgacaacat柳accgtgaaagcttgc翻 4
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SequenceNaae :人簾突變型纖溶酶原激活劑(mt-PA) SequenceDescription QrganisBNaBe :人工序列 〈400〉 PreSequenceString : 4
formula see original document page 18Arg Gin Tyr Ser Ala Asp lie Ala Ala Ala Ala Ser lie Ser Ser Cys Arg Phe Pro Pro Arg Val Val Pro Tyr lie Val His lie Ala Leu Leu Glu Ser Ser Val Gin Leu Pro Asp His Glu Ala Leu His Val Arg Leu Leu Asn Ai^ Thr Arg Ser Gly Gly Asp Ser Gly Gly Leu Val Gly lie Val Pro Gly ValGin Pro Gin Phe Arg lie 275 280 Ser His Pro Trp Gin Ala 290 295 Pro Gly Glu Arg Phe Uu 305 310 Trp lie Leu Ser Ala Ala 3加 325 His His Leu Thr Val lie 3加 320 Gly Glu Glu Glu Gin Lys 350 355 Lys Glu Phe Asp Asp Asp 365 370 Gin Leu Lys Ser Asp Ser 380 385 Val Arg Thr Val Cys Leu 395 400 Trp Thr Glu Cys Glu Leu 410 415 Ser Pro Phe Tyr Ser Glu 425 430 Tyr Pro Ser Ser Arg Cys 440 445 Val Thr Asp Asn Met Leu 455 460 Pro Gin Ala Asn Leu His 470 475 Pro Leu Val Cys Leu Asn 485 4恥 lie Ser Trp Gly Leu Gly 500 505 Tyr Thr Lys Val Thr Asn 515 520Lys Gly Gly Leu Phe 285Ala lie Phe Ala Ala 300Cys Gly Gly lie Leu 315His Cys Phe Gin Glu 330Leu Gly Arg Thr Tyr 345Phe Glu Val Glu Lys 360Thr Tyr Asp Asn Asp 375Ser Arg Cys Ala Gin 390Pro Pro Ala Asp Leu 405Ser Gly Tyr Gly Lys 420Arg Leu Lys Glu Ala 435Thr Ser Gin His Leu 450Cys Ala Gly Asp Thr 465Asp Ala Cys Gin Gly 480Asp Gly Arg Met Thr 495Cys Gly Gin Lys Asp 510Tyr Leu Asp Trp lie 525Arg Asp Asn Met Arg Pro 531〈210〉 5〈211> Length : 728SequenceNaae : DsbC Sequemad)escription :<212〉 Type :腿 OrganinNMe :細菌<400〉 PreSequenceString : 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GlyValLeuTyrlieThrAspAspGlyLys354045His lielieGin gly Pro84 tTyrAspValSerGlyThrAlaPro恥5560Yal AsnValThr Asn LysMetLeuLeuLysGinLeuAsnAlaLeu筋7075Glu LysGluMet lie ValTyrLysAlaProGinGluLysHisVal808590lie ThrValPte "Hit AsplieThrCysGlyTyrCysHisLysLeu鄉100艦His GluGinMet Ala AspTyrAsnAlaLeuGlylieThrValArg110115120Tyr UuAlaPhe l￥o ArgGinGlyLeuAspSerAspAlaGluLysl肪130135Glu MetLysAla I.le TrpCysAlaLysAspLysAsnLysAlaPhel抑145150Asp AspValktet Ala GlyLysSerValAlaProAlaSerCysAsp版160165Val AsplieAla細p HisTyrAlaLeuGlyValGinleuGlyVal170175180Ser GlyThr Pro Ala ValValL uSerAsnGly ThrLeuValPro185190195Gly TyrGin Pro Lys GluMetLysGlu PheLeu AspGluHisGin娜205210Lys Met Thr Ser Gly Lys
權利要求
1. 一種由原核細菌跨膜信號肽OmpA融合mt-PA的表達序列，由阿拉佰糖(arabinose)操縱子PBAD啟動子和其調控基因araC組成表達調控元件的表達質粒。其主要特徵為a).人組織型纖維蛋白溶酶元激活物(t-PA)的分子中與纖維蛋白溶酶元激活物抑制因子1(PAI-1，下同)結合區域中位於P區胺基酸296-299 lys-His-Arg-Arg突變成Ala-Ala-Ala-Ala，並在突變區形成新的Not1內切酶位點的突變型人mt-PA(下同)，其他胺基酸及其排序與野生型t-PA一致；b).人mt-PA的N-末端以Nco1酶切點連接於原核表達載體pBAD33分泌信號肽OmpA的C-末端，分泌信號肽OmpA的N-末端含有核糖體結合位點的核苷酸序列-AGGAGG-；分泌信號肽OmpA由24個胺基酸組成；c).本發明所用的原核表達載體pBAD33為新構成的含有核糖體結合位點(-AGGAGG-)分泌信號肽OmpA的原核細胞表達載體pBAD33。此分泌信號肽OmpA分別以N-端的Hhe1和C-端的Sac1連接於原型表達載體，成為由阿拉佰操縱子的PBAD啟動子驅動、具有緊密調控和高水平表達的一種分泌型原核細胞表達載體。
2. —種畲有同分異構酶DsbC或無信號肽DsbC的、由T7啟動子和LacZ組 成表達調控元件的原核細胞表達質粒構建。其主^iW在於a) .原狹黼應表達質粒的骨架是以pcal-n表達載體為基礎的，此載體經 Ndel和HiadMl消化後，切除了鈣調素結合區片段(Calmodelin-bindingunit);b) .細,闕分異,DsbC或無信號肽DsbC是以Ndel和Hindlll酶切片段 重組於前,pcrf-A形成由T7啟動子和LacZ組成表達調控元件的原核細胞表達質粒pcsd-Dlibco
3. —種同分獰構酶DdjC或無信號肽DsbC原核細胞表達質粒轉化的感受態宿主 笛Oi%amip>i3)。其主要特徵在於a) .該宿主菌的琉氧還蛋白還原酶(trsB)/穀胱甘肽還原酶(gov)基因己經突變， 其胞漿還感S^變為有利於二琉鍵形成的氧化態；b) .此複主菌是為同分異構酶DsbC或無信號肽DsbC原核細胞表達質粒所 轉化的表達宿主菌；c) .這些轉化的細菌表達同分異構酶DsbC或無信號肽DsbC蛋白質；d) .上述遂，化的細菌也能被表達人mt-pa的表達質粒所轉化；e) .此複主菌也能用於其他多二硫鍵的複雜大分子蛋白質的表達。 本權承澳求不僅限於描敘的宿主笛Origami(DE3)，也包括其他的表達宿主菌，如BL21、 BL21plus, BL21(DE3)plysS、 Origami(DE3) 、 Origami B(DE3)和 Origami(DE3脅sS。
4. 一種高表達分泌性人mt-PA的工程菌。其主要^在於a) .此工雜菌由本發明的權利要求第1、第2和第3項所述的表達質粒和原 核細鑫感受,達宿主菌共同構成的一個的系統工程菌；b) .此工藿菌分泌髙表達、有生物活性的人mt-PA蛋白到培養液。3
5. 權利要求4所述工程菌表達蛋白對治療急性心肌梗塞、腦血栓形成和肺梗塞 等相關疾病齣翻劑中的用途。
6. 除本發明新述mt-PA外，包含mt-PA的突變體K2S(由Kringle2和絲氨酸蛋 白酶,p區綴成)及其變構衍生物、尿激酶及其變構衍生物和其他有藥用價值的基 因在本發明^t利要求第2和第3項所述的表達質粒和原核細胞宿主菌共同構成 的一個的,DsbC或無信號肽DsbC感受態原核表達菌中的應用。
全文摘要
本發明為一種高表達含多個二硫鍵的非糖大分子蛋白質或糖基對其功能無重要影響的蛋白質的原核細胞表達系統。更具體的是用於表達有生物活性的突變型人纖維蛋白溶酶元激活劑(mt-PA)的原核細胞表達系統，其主要特徵為1)突變型人纖維蛋白溶酶元激活劑表達序列(mt-PA)；2)構建由阿拉佰糖(arabinose)操縱子PBAD啟動子和其調控基因araC組成的表達調控元件的、含有細菌OmpA分泌信號肽的原核表達載體及其表達mt-PA的表達質粒；3)構建同分異構酶DsbC或無信號肽DsbC的表達質粒；4)表達質粒mt-PA和DsbC或無信號肽DsbC的表達質粒共轉化trxB/gov突變的感受態宿主菌，構建成高水平表達、有生物活性的分泌型人mt-PA工程菌。
文檔編號C12N15/63GK101225398SQ20071002637
公開日2008年7月23日 申請日期2007年1月18日 優先權日2007年1月18日
發明者朱雅南, 王尚武 申請人:王尚武;朱雅南