新型抗腫瘤人參皂苷的製備方法
2023-06-12 22:47:46 6
專利名稱：新型抗腫瘤人參皂苷的製備方法
技術領域：
本發明涉及酶解或微生物發酵水解人參皂苷製備3位羥基游離的低極性人參皂苷20-O-β-D-木糖(1→6)-β-D-葡萄糖-20(s)-原人參二醇[20-O-β-D-xylopyanosyl(1→6)-β-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxadiol，簡稱Mx]、20-O-c-L-阿拉伯糖(1→6)-β-D-葡萄糖-20(S)-原人參二醇[20-O-α-L-arabinopyranosyl(1→6)-β-D-glucopyranosyl 20(S)-protopanaxadiol，簡稱C-Y]和20-O-α-L-阿拉伯糖(1→6)-β-D-葡萄糖-20(S)-原人參二醇[20-O-a-L-arabinofuranosyl(1→6)-β-D-glucopyranosyl 20(S)-protopanaxadiol，簡稱McJ的方法，特別是涉及粗蝸牛酶水解製備方法。
背景技術：
人參皂苷具有多種藥效功能，如抗腫瘤和免疫調節、改善微循環、調節消化機能、安神、抗衰老、抗緊張、預防消化道潰瘍、提高生命質量、增強記憶力和學習能力等。但天然人參皂苷幾乎不能被腸道直接吸收入血，並且，藥代動力學行為較差。
近來，先後發現多種由天然人參皂苷經生物轉化而來的代謝產物3位羥基游離的低極性人參皂苷，如C-K、C-Y和Mc。它們分別被證明是相應天然人參皂苷的口服吸收形式。Hasegawa等研究發現C-K在抗腫瘤方面具有誘導腫瘤細胞分化、誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞生長、抑制腫瘤誘導的新生血管形成、抗擊腫瘤的浸潤和轉移等多種生物活性；另外，C-K具有良好的藥代動力學行為且基本無毒或毒性很低，目前，在韓國已進入III期臨床研究。源於天然人參皂苷Rb2和Rc的代謝產物C-Y和Mc具有與C-K相似的藥效活性。
由於天然人參或天然人參皂苷口服後L乎不直接吸收，口服後上述三種可吸收的代謝產物是通過人體腸道菌的轉化而來。因機體的人參皂苷腸道菌代謝能力存在個體差異，因此，理論上，直接使用轉化物可以避免吸收障礙，使臨床上易於掌握有效劑量。
人參皂苷20位的糖苷鍵在酸性介質中的穩定性低於3位糖苷鍵，並且空間阻礙作用使酶水解20位的糖苷鍵活力極低。因而，生物轉化無疑是製備3位羥基游離的低極性人參皂苷的最佳方法。生物轉化包括酶法和微生物發酵法。
Hasegawa將天然人參皂苷與腸道菌一起體外厭氧培養，從培養液中分離得到C-K、C-Y和Mc，並申請了美國專利(5,919,770)。由於厭氧培養時，3位羥基游離的低極性人參皂苷不是唯一產物、並且原料轉化率低、分離純化繁瑣、培養條件苛刻、成本居高。因而，酶法更受關注。
目前，文獻中提供的酶法有柚皮苷酶和橙皮苷酶，但該酶有下列缺陷水解時間長、酶的用量大，酶的來源不易，因此，不適於工業製備。
我們先前的研究發明了在工藝及成本上均有優勢的C-K的酶法製備方法(中國專利，申請號01133410.X)和微生物發酵方法(中國專利，申請號02132403.4)。兩項技術發明較之腸道菌和柚皮苷酶、橙皮苷酶的製備技術有多種優勢。同時利用上述技術，以三七莖葉中富含的人參皂苷Rb3為原料，本發明的發明人發現了Mx這一具有抗腫瘤活性的新化合物，Mx具有與C-K相似的生物活性，而較之人參，三七及其莖葉在我國具有更加明顯的資源優勢，其結構式如下
發明的技術內容為了簡單、方便、低成本、大批量地製備Mx、C-Y和Mc，本發明提供了一種用酶解或微生物發酵水解人參皂苷製備人參皂苷製備Mx、C-Y或Mc的方法，包括水解、收集和酶回收利用步驟，其特徵在於用糖苷酶在緩衝液中分別選擇性水解人參皂苷Rb3或三七葉苷、Rb2、Rc，皂苷與糖苷酶的重量比為1∶1～10∶1，溫度為30～45℃，pH 3.0～5.5，水解時間2～72小時。
本發明所提供酶水解人參皂苷製備Mx、C-Y或Mc的方法中，要求糖苷酶對糖苷鍵的水解具有良好的選擇性，即僅水解3位糖苷鍵而不影響20位的木糖基和葡萄糖基。糖苷酶可來源商品酶如蝸牛酶、橙皮苷酶、柚皮苷酶等，也可自自然界中篩選分離具有選擇性糖苷酶活性的微生物，如螺旋菌屬、彎曲菌屬、柔曲桿菌屬、假單胞菌屬、黃單胞菌屬、葉狀菌屬、甲基球菌屬、奈氏菌屬、黃桿菌屬、類桿菌屬、放線桿菌屬、鮑特氏菌屬、副球菌屬、腸桿菌屬、變形桿菌屬、發光桿菌屬、纖毛菌屬、琥鉑酸弧菌屬、月形單胞菌、微球菌屬、口腔菌屬、腸球菌屬、乳酸鏈球菌、厭氧鏈球菌、明串珠球菌屬、片球菌屬、消化球菌屬、糞球菌屬、芽孢桿菌屬、芽孢乳桿菌屬、梭菌屬、乳桿菌屬、李斯特氏菌屬、棒狀桿菌屬、節桿菌屬、短桿菌屬、乾酪桿菌屬、微桿菌屬、纖維桿菌屬、優桿菌屬、放線菌屬、分枝桿菌屬、奴卡氏菌屬、糖化多孢子菌屬、前微小單孢子菌屬、念珠菌屬、青黴菌、麴黴菌屬、毛黴菌屬、隱球菌屬、假絲酵母菌等，也可用上述微生物具有選擇性糖苷酶活性的生物製品。
本發明所提供酶水解人參皂苷製備Mx、C-Y或Mc的方法中，酶法工藝的簡便、產品分離和純化容易，優於微生物發酵水解。
本發明所提供酶水解人參皂苷製備Mx、C-Y或Mc的方法中，製備Mx、C-Y和Mc的原料分別為人參皂苷Rb3、Rb2、Rc，或含有Rb3、Rb2、Rc的植物、植物提取物或植物培養液。
本發明所提供酶水解人參皂苷製備Mx、C-Y或Mc的方法中，蝸牛酶水解原料人參皂苷的酶活性高、選擇性好、抗失活能力強、來源方便、價格低廉，特別適用於Mx、C-Y和Mc的生產製備。粗蝸牛酶水解原料人參皂苷的最適溫度為40℃，最適pH為4.5，離子強度越低越好，緩衝液的種類對酶活性影響不大；本發明選用pH4.5，離子強度為0.001mol·L-1，的磷酸-檸檬酸緩衝液；原料與酶的比例以6∶1最為經濟；依照此條件，水解時間超過8小時後，Mx的產量不再發生變化，因此，水解時間以8小時為宜。
本發明所提供酶水解人參皂苷製備Mx、C-Y或Mc的方法中，酶反應液在除沉澱物和小分子雜質後，可循環使用。
本發明所提供酶水解人參皂苷製備Mx、C-Y或Mc的方法中，篩選分離具有選擇性糖苷酶活性的微生物時，採用酶誘導法與抗生素抗性誘導法，以增加微生物糖苷酶的含量或增強微生物水解能力，同時加入的抗生素，還可以防止雜菌汙染。
本發明所提供酶水解人參皂苷製備Mx、C-Y或Mc的方法中，收集過程是(1)酶法收集酶反應沉澱物，製成懸濁液；乙酸乙酯萃取三次，合併乙酸乙酯液，減壓回收乙酸乙酯後，收集的殘餘物即為Mx、C-Y或Mc；若原料為含有Rb3、Rb2和Rc的植物、植物提取物或植物培養液，所獲粗產物還需經吸附樹脂純化。(2)微生物發酵法用水飽和的正丁醇提取培養基三次，合併正丁醇提取液，活性炭去色除臭，減壓濃縮回收正丁醇，殘餘物溶於乙酸乙酯並用矽膠柱層析和反相層析純化後獲Mx、C-Y或Mc。
本發明所提供酶水解人參皂苷製備Mx、C-Y或Mc的方法中，加入一定量的有機溶劑對中間產物起助溶作用，有利於酶水解反應的正常進行。有機溶劑的種類和加入量以不影響酶活性為準。經篩選，以5～15％的乙醇最佳。
本發明為人參二醇皂苷酶解製備人參皂苷Mx、C-Y或Mc提供了一種來源方便、價格低廉的酶，用該酶製備Mx、C-Y和Mc工藝簡單方便、成本低、回收率高。使用本方法製備的Mx、C-Y和Mc含量≥95％，苷元收率≥91％。
具體實施例方式實施例1人參皂苷Rb3(500mg)與蝸牛酶(84mg)酶溶於32mL磷酸-檸檬酸緩衝液(pH4.5，離子強度為0.001mol·L-1，含10％的乙醇)中，40℃水浴中水解1天；離心反應液、收集沉澱，用水將沉澱物製成懸濁液，乙酸乙酯萃取(10mL×5)懸濁液，合併乙酸乙酯液，減壓除乙酸乙酯後，獲Mx(106mg)。
實施例2人參皂苷Rb3(50mg)與蝸牛酶(8.4mg)溶於3.2mL、pH不同的磷酸-檸檬酸緩衝液(離子強度為0.001mol·L-1，含10％的乙醇)中，40℃水浴中水解1天。離心反應液、收集沉澱。用水將沉澱物製成懸濁液，乙酸乙酯萃取(1mL×5)懸濁液，合併乙酸乙酯液，減壓除乙酸乙酯，收集的殘餘物並溶於5.00mL甲醇中，HPLC分析檢測Mx含量。結果說明蝸牛酶最適pH為4.5。
實施例3將人參皂苷Rb3與蝸牛酶按不同比例溶於3.2mL磷酸-檸檬酸緩衝液(pH4.5，離子強度為0.001mol·L-1，含10％的乙醇)中，40℃水浴中水解1天；離心反應液、收集沉澱。用水將沉澱物製成懸濁液，乙酸乙酯萃取(1mL×5)懸濁液，合併乙酸乙酯液，減壓除乙酸乙酯後，收集的殘餘物並溶於5.00mL甲醇中，HPLC分析檢測Mx含量。結果說明最適原料/酶量比為6/1。
實施例4人參皂苷Rb3(50mg)與蝸牛酶(8.4mg)溶於3.2mL磷酸-檸檬酸緩衝液(pH4.5，離子強度為0.001mol·L-1，含10％的乙醇)中，於不同溫度的水浴中水解1天；離心反應液、收集沉 澱。用水將沉澱物製成懸濁液，用乙酸乙酯萃取(1mL×5)懸濁液，合併乙酸乙酯液，減壓除乙酸乙酯後，收集的殘餘物並溶於5.00mL甲醇中，HPLC分析檢測Mx含量。結果說明最適溫度為45℃。
實施例5人參皂苷Rb3(50mg)與蝸牛酶(8.4mg)溶於3.2mL磷酸-檸檬酸緩衝液(pH4.5，含10％的乙醇)中，變化離子強度，於40℃水浴中水解1天；離心反應液、收集沉澱。用水將沉澱物製成懸濁液，乙酸乙酯萃取(1mL×5)懸濁液，合併乙酸乙酯液，減壓除乙酸乙酯後，收集的殘餘物並溶於5.00mL甲醇中，HPLC分析檢測Mx含量。結果說明離子強度越低越好。
實施例6人參皂苷Rb3(50mg)與蝸牛酶(8.4mg)溶於3.2mL pH4.5離子強度為0.001mol·L-1含10％的乙醇的不同緩衝液(包括1為甘氨酸-HCl，2為鄰苯二甲酸氫鉀-HCl，3為Na2HPO4-檸檬酸，4為檸檬酸-檸檬酸鈉，5為醋酸-醋酸鈉)中，於40℃水浴中水解8小時；反應液經離心收集沉澱；用水將沉澱物製成懸濁液；用乙酸乙酯萃取(1mL×5)，合併乙酸乙酯液，減壓回收乙酸乙酯後，收集的殘餘物Mx溶於5.00mL甲醇中，HPLC分析Mx含量。結果說明緩衝液的種類對蝸牛酶酶活性影響不大。
實施例7人參皂苷Rb3(50mg)與蝸牛酶(8.4mg)溶於3.2mL磷酸-檸檬酸緩衝液(pH4.5，離子強度為0.001mol·L-1，含10％的乙醇)中，於40℃水浴中，變換水解時間。離心反應液、收集沉澱，水將沉澱物製成懸濁液；用乙酸乙酯萃取(1mL×5)懸濁液，合併乙酸乙酯液，減壓除乙酸乙酯後，收集的殘餘物並溶於5.00mL甲醇中，HPLC分析檢測Mx含量。結果說明反應10小時後，Mx的增量不大。
實施例8經人參皂苷Rb3共同培養馴化得到的對四環素具有抗雜菌生長的黑麴黴(Aspergillus niger v.Tiegh)YLY菌株溶液，使用前在查氏液體培養基(100mL)中培養過夜，挑出菌落，傳入含人參皂苷Rb3(3％)的查氏液體培養基中(100mL)，37度搖床連續培養3天。用水飽和正丁醇提取培養液三次(10mL×5)，合併正丁醇提取液，活性炭去色、除臭，減壓除正丁醇，將殘餘物溶於乙酸乙酯進行矽膠柱層析(洗脫液為氯仿/乙酸乙酯/乙醇＝60/30/10，下層500mL)和反相層析純化(流動相為50％的乙醇5L)，獲Mx(515mg)，經檢驗含量≥95％。
實施例9人參皂苷Rb2(500mg)與蝸牛酶(84mg)酶溶於32mL磷酸-檸檬酸緩衝液(pH4.5，離子強度為0.001mol·L-1，含10％的乙醇)中，40℃水浴中水解1天；離心反應液、收集沉澱，用水將沉澱物製成懸濁液，乙酸乙酯萃取(10mL×5)懸濁液，合併乙酸乙酯液，減壓除乙酸乙酯後，獲C-Y(103mg)。
實施例10人參皂苷Rc(500mg)與蝸牛酶(84mg)酶溶子32mL磷酸-檸檬酸緩衝液(pH4.5，離子強度為0.001mol·L-1，含10％的乙醇)中，40℃水浴中水解1天；離心反應液、收集沉澱，用水將沉澱物製成懸濁液，乙酸乙酯萃取(10mL×5)懸濁液，合併乙酸乙酯液，減壓除乙酸乙酯後，獲Mc(105mg)。
權利要求
1.一種用酶水解人參二醇型皂苷製備3位羥基游離的低極性人參皂苷20-O-β-D-木糖(1→6)-β-D-葡萄糖-20(s)-原人參二醇[20-O-β-D-xylopyranosyl(1→6)-β-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxadiol，簡稱Mx]、20-O-α-L-阿拉伯糖(1→6)-β-D-葡萄糖-20(S)-原人參二醇[20-O-α-L-arabinopyranosyl(1→6)-β-D-glucopyranosyl 20(S)-protopanaxadiol，簡稱C-Y]或20-O-α-L-阿拉伯糖(1→6)-β-D-葡萄糖-20(S)-原人參二醇[20-O-α-L-arabinofuranosyl(1→6)-β-D-glucopyranosyl 20(S)-protopanaxadiol，簡稱Mc]的方法，包括水解、產物收集和酶回收利用步驟，其特徵在於用糖苷酶在緩衝液中分別選擇性水解人參皂苷Rb3或三七葉苷、Rb2、Rc，皂苷與糖苷酶的重量比為1∶1～10∶1，溫度為30～45℃，pH3.0～5.5，水解時間2小時～3天。
2.按照權利要求1所述用酶水解製備Mx、C-Y或Mc的方法，其特徵在於所用的糖苷酶對糖苷鍵具有良好的選擇性，即僅水解人參皂苷3位的糖苷鍵而不影響20位的糖苷鍵以及其後的木糖基與葡萄糖基的糖苷鍵，包括糖苷酶和具有選擇性糖苷酶活性的微生物及其具有選擇性糖苷酶活性的生物製品。
3.按照權利要求1所述用酶水解製備Mx、C-Y或Mc的方法，其特徵在於對於糖苷酶或微生物酶製品，酶解反應在酶的pH 3.0～5.5的緩衝溶液中進行對於微生物，酶解反應在或在培養基中進行，培養基為液體、半固體或固體；培養條件是需氧的、兼氧的或厭氧的。
4.按照權利要求1所述用酶水解製備Mx、C-Y或Mc的方法，其特徵在於製備Mx、C-Y、Mc的原料分別為人參皂苷Rb3、Rb2、Rc，或含有Rb3、Rb2、Rc的植物、植物提取物或隨物培養液。
5.按照權利要求1所述用酶水解製備Mx、C-Y或Mc的方法，其特徵在於所用酶為蝸牛酶，皂苷與蝸牛酶的重量比為1∶1～10∶1，pH值在2.0～10.0之間，水解溫度為30-60℃，水解時間2～20小時。
6.按照權利要求5所述用酶水解製備Mx、C-Y或Mc的方法，其特徵在於所用酶為蝸牛酶，皂苷與蝸牛酶的重量比為6∶1，pH為4.5，水解溫度為45℃，水解時間為8小時。
7.按照權利要求1所述用酶水解製備Mx、C-Y或Mc的方法，其特徵在於所述的收集過程是(1)酶法 收集酶反應沉澱物，製成懸濁液；乙酸乙酯萃取三次，合併乙酸乙酯液，減壓回收乙酸乙酯後，收集的殘餘物即為Mx、C-Y或Mc；若原料為含有Rb3、Rb2和Rc的植物、植物提取物或植物培養液，所獲粗產物還需經吸附樹脂純化；(2微生物發酵法 用水飽和的正丁醇提取培養基三次，合併正丁醇提取液，活性炭去色除臭，減壓濃縮回收正丁醇，殘餘物溶於乙酸乙酯並用矽膠柱層析和反相層析純化後獲Mx、C-Y或Mc。
8.按照權利要求1所述用酶水解製備Mx、C-Y或Mc的方法，其特徵在於所述的除去了沉澱物的酶反應液，經超濾除去小分子雜質後回收作為原料酶使用。
9.按照權利要求1所述用酶水解製備Mx、C-Y或Mc的方法，其特徵在於所用緩衝液中含有5～15％的乙醇。
全文摘要
本發明涉及酶解或微生物發酵水解人參皂苷製備3位羥基游離的低極性人參皂苷20－O－β－D－木糖(1→6)－β－D－葡萄糖－20(s)－原人參二醇[20－O－β－D－xylopyranosyl(1→6)－β－D－glucopyranosyl－20(S)－protopanaxadiol，簡稱Mx]、20－O－α－L－阿拉伯糖(1→6)－β－D－葡萄糖－20(S)－原人參二醇[20－O－α－L－arabinopyranosyl(1→6)－β－D－glucopyranosyl 20(S)－protopanaxadiol，簡稱C－Y]和20－O－α－L－阿拉伯糖(1→6)－β－D－葡萄糖－20(S)－原人參二醇[20－O－α－L－arabinofuranosyl(1→6)－β－D－glucopyranosyl 20(S)－protopanaxadiol，簡稱Mc]的方法，特別是涉及粗蝸牛酶水解製備方法。本發明中所用蝸牛酶酶活性高、選擇性好、離子強度要求低、抗失活能力強、來源方便、價格低廉，用該酶製備Mx、C－Y或Mc工藝簡單方便、成本低、回收率高，產品質量好，可以滿足醫藥、化妝及功能食品領域的需求，應用和開發價值極大。
文檔編號C12P33/00GK1508260SQ02144779
公開日2004年6月30日 申請日期2002年12月13日 優先權日2002年12月13日
發明者楊凌, 何克江, 韓蔚, 吳磊, 楊 凌 申請人:中國科學院大連化學物理研究所