重組長效胰高血糖素樣肽類似物的製備方法

2023-06-12 06:20:26 3

專利名稱：：重組長效胰高血糖素樣肽類似物的製備方法
技術領域：
：本發明涉及重組蛋白，具體涉及重組長效胰高血糖素樣肽類似物的製備方法。
背景技術：
：糖尿病是一種多病因的代謝性疾病，已成為現代社會嚴重危害人類健康與生命的主要疾病。根據世界衛生組織(WHO)提供的數據，發達國家糖尿病患病率己高達5%-10%，在我國則為3%左右；到2030年，全世界糖尿病患者人數將比2000年翻一番。其中2型糖尿病患者人數目前約佔所有糖尿病患者人數的90%以上。胰高血糖素樣肽-1(glucagon,likep印tide.1GLP—1)可以與GLP-1受體相結合，通過多種作用控制血糖，包括刺激胰島素分泌、同時抑制胰高血糖素和胃排空，但是不會產生低血糖，對II型糖尿病的治療具有較好的效果。天然胰高血糖素樣肽-1在體內很快被DPP-IV降解，半衰期只有2-3分鐘，在給藥上具有很大的困難。腸促胰島素類似物(exendin-4)最初由毒蜥屬動物唾液中分離，是由基因exendin-4表達產生，可激活人體內GLP-1受體，可以通過促進胰島素分泌和細胞再生、抑制食物攝入而降低血糖。但它不是DIP-IV的底物，因而具有較長的半衰期和較強的生物活性。exendin-4注射給藥後，能夠模擬調控機體胰島素的激素在體內發揮作用，從而達到控制血糖的效果。exendin-4—天注射兩次，優點在於不需要根據糖化血紅蛋白(HbAlc)或血糖水平來調整劑量,在早餐和晚餐前給予固定劑量即可，從而減少患者頻繁監測血糖的不便。HGS公司的Albugon，它是GLP-1和人血清白蛋白(humanserumalbumin,HSA)的融合體，它在猴子體內的半衰期為3天，目前已進入臨床II期。人血清白蛋白(HSA)是一種可溶性單體蛋白質，構成血液中的蛋白質總量的一半。白蛋白作為一種基本載體，攜帶傳遞脂肪酸、類固醇和激素分子等，其穩定的惰性性質是維持血壓的一個重要因素。人血清白蛋白是一種球狀非糖基化的，分子量為65Kd的蛋白質。人血清白蛋白的基因位於4號染色體上，有16961個鹼基對，分為15個間隔區，經RNA加工拼接後形成的mRNA可編碼一個具有585個胺基酸的蛋白質。這一蛋白在經過高爾基體的轉化加工，去除分泌信號而分泌到細胞外。人血清白蛋白有35個半胱氨酸，構成17個二硫鍵的單體(BrownJR，Thestructure,functionalandapplicationofhumanalbumin,Pergamon，NY1977)。人血清白蛋白具有多種多態形及30種不同的遺傳分子(Weikamp，CR，humangenomicAnnual,37:219-226，1973)。人血清白蛋白分子的三維結構已經由X光衍射法測定(Carter,Science,244，1195-1198，1989)。人血清白蛋白是血液種的主要成分，在人體內含量為每升血液含40克，半衰期壽命為14-20天。綜上所述，人血清白蛋白具有極大的優勢使之可抵禦生物體內酶的作用，並可使治療性蛋白質以較高的劑量使用。目前用於臨床的人血清白蛋白均是從人血漿中提取的。利用微生物重組表達白蛋白(rHSA)的生產專利已經公開，EP330451和EP361991。
發明內容本發明的目的在於提供一種長效胰高血糖素樣肽類似物的製備方法。本發明中的長效胰高血糖素樣肽類似物為將exendin-4和人血清白蛋白通過基因工程的方法融合在一起的融合蛋白，融合蛋白分子既保持exendin-4蛋白的生物學功能，又含有HSA穩定的惰性性質，極大的延長了exendin-4的半衰期。在臨床使用中可減少注射給藥次數，減輕患者的痛苦，提高療效並降低醫療費用。以往不同基因融合表達中，在考慮兩個蛋白生物學活性上，兩個基因之間往往需要連接肽(linker)連接，而連接肽在臨床治療中可能造成高的免疫原性。本發明在研究exendin-4蛋白和人血清白蛋白構象和活性中心後，充分利用兩個不同蛋白N端和C端的序列特徵，使兩個基因直接相連融合表達，避免了免疫原性的擔憂，同時保留了exendin-4的降糖活性。本發明在獲得了表達長效胰高血糖素樣肽類似物的基因工程菌的基礎上，又對其發酵和純化工藝進行了選擇及優化，在保證產物活性的基礎上，進一步提高了蛋白表達效率及純化產物得率。本發明公開了一種長效胰高血糖素樣肽類似物的製備方法，將長效胰高血糖素樣肽類似物通過帶有長效胰高血糖素樣肽類似物基因的工程酵母發酵表達，長效胰高血糖素樣肽分泌表達於培養基中。含有胰高血糖素樣肽的培養上清通過藍色染料親和層析進行粗純化，再經過疏水層析中純化和離子交換層析精純化獲得純度大於95%的胰高血糖素樣肽精製本發明的製備方法具體包括下列步驟1)在發酵罐中接種前述基因工程畢赤酵母菌種；2)在適合表達長效胰高血糖素樣肽類似物的條件下，發酵罐發酵培養基因工程畢赤酵母菌種；3)發酵液離心並收集上清；4)發酵液上清液中長效人胰高血糖素樣肽類似物的分離純化發酵液上清經藍色染料親和層析進行粗純化，再經疏水層析中純化，再經離子交換層析精純化後獲得純度大於95%的產物。上述長效胰高血糖素樣肽類似物，是由腸促胰島素類似物exendin-4與人血清白蛋白(humanser咖albumin)直接連接獲得的多肽，exendin-4與人血清白蛋白(humanserumalbumin)之間沒有連接肽。上述基因工程畢赤酵母菌株，為被基因工程載體轉化的畢赤酵母菌株，基因工程載體含有編碼上述長效胰高血糖素樣肽類似物的蛋白的基因。較佳的，上述編碼上述長效胰高血糖素樣肽類似物的蛋白的基因為針對酵母表達優化過的序列。上述步驟2)的發酵罐發酵培養條件為採用基礎鹽培養基，控制溶解氧大於30%，溫度為30'C，pH6.0，培養16-20小時後，補加甘油溶液，再培養4-6小時；甘油培養階段結束後，以向發酵罐中補加甲醇，發酵約70小時後結束髮酵；上述步驟2)中，在酵母中表達融合蛋白時，通過分泌到酵母細胞外的培養液中完成。進一步的，本發明還對發酵產物的發酵及純化工藝條件進行了優化對前述步驟1，先將基因工程菌菌種以YPD培養基搖瓶培養14小時_18小時後接種發酵罐。對前述步驟2，包括下述幾方面的工藝條件優化1.所述基礎鹽培養基中加有6ml/L培養基的微量元素添加劑PTM1。2.補加甘油溶液的濃度為50%(v%)，且甘油溶液中含有12ml/L的PTMl。此階段培養主要為生物量的增長階段，使菌體的量在短時間內得到擴增。3.補加甲醇的過程為先控制補加甲醇的速度為3.6ml/小時/升培養基，其中甲醇中含有12ml/L的PTM1，而後逐步提高甲醇補料速度到10.8ml/小時/升培養基，並以此速度補加甲醇70小時後結束髮酵。採用上述工藝條件，發酵液上清液中的長效胰高血糖素樣肽類似物的含量可達到300mg—600mg/L。對於前述步驟3，包括下述幾方面的工藝條件優化1.發酵液上清經藍色染料親和層析進行粗純化的步驟為發酵上清液pH到7.0，上樣到經20mMpH為7.0的磷酸鹽、500mMNaCl緩衝液平衡的藍色染料(BlueS印hroase)親和層析柱，上樣完畢後先用20mMpH為7.O的磷酸鹽、128rnMKSCN緩衝液衝洗去未結合的物質，再用20mMpH為7.0的磷酸鹽、230rnMKSCN緩衝液衝洗脫結合在柱上的融合蛋白，以紫外280nM吸收檢測，收集蛋白峰。2.疏水層析中純化的步驟為收集的蛋白溶液，調節硫酸銨的終濃度為0.46M，調節pH到7.0，此溶液上樣到經20mM的磷酸鹽加0.5M硫酸銨pH為7.0緩衝液平衡的PhenylHighPerformance層析柱，上樣完畢後先用20mM的磷酸鹽加0.3M硫酸銨pH為7.0緩衝液衝洗去未結合的物質，使紫外280nm吸收的降回到基線，再用20mM磷酸鹽加上0.1M硫酸銨pH7.0的溶液洗脫結合在柱上的融合蛋白。3.離子交換層析精純化的步驟為收集的蛋白溶液調節pH到5.0，並用水稀釋到電導率小於3ms/cm，此溶液上樣到經20mM的醋酸鈉pH為5.0緩衝液平衡的CMFF層析柱，上樣完畢後先用80mM的醋酸鈉pH為6.5緩衝液緩慢洗脫，收集pH為6.2時的目標峰。重組長效胰高血糖素樣肽類似物經親和層析、疏水層析和離子交換層析後的純度已大於95%，細菌內毒素、宿主DNA或蛋白殘留等指標都能到達藥典的一般要求，樣品可用於下一步的製劑或除菌過濾後於一2CTC凍存。本發明製備獲得的長效胰高血糖素樣肽類似物極大的延長了exendin-4的半衰期。在臨床使用中可減少注射給藥次數，減輕患者的痛苦，提高療效並降低醫療費用。此外，本發明製備方法，工藝條件容易控制，可以獲得具有生物活性的長效胰高血糖素樣肽類似物，且蛋白表達效率高及純化產物得率高。具體實施例方式以下列舉具體實施例進一步闡述本發明，應理解，實施例並非用於限制本發明的保護範圍，實施例中未註明具體條件的實驗方法及未說明配方的試劑均為按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆試驗手冊(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件或者製造商建議的條件進行或配置。實施例1基因工程菌的培養和表達搖瓶菌種培養5個容量為1L的三角瓶，裝YPD培養基各200ml，培養基配方為酵母提取物(1%)10g、蛋白腖(2%)20g,葡萄糖(2%)20g，用去離子水溶解並定容到1L，115。C蒸汽滅菌20分鐘。每瓶接甘油菌種lOOul，3(TC搖床300rpm培養24小時，此時菌濃度0D600在6-20之間。30L罐發酵培養30L全自動發酵罐(Biostatc-dcu，Sartourius)，具體操作可參照其使用說明書。30L罐中裝入基礎鹽培養基15L，配方為CaS04'2&00.93g/l，K2S0418.2g/l，MgS047H20，K0H4.13g/l，H3P0426.7ml/l，甘油40g/l用去離子水溶解並定容到15L。連接好pH電極、溶氧電極，溫度電極等，開動攪拌500rpm，12rC在位滅菌30分鐘。滅菌結束後，待其溫度降到95'C時開始通氣，繼續待其冷卻道3(TC時，加大通氣量到30L每分鐘，攪拌速度調到900rpm。調整溶氧電極讀數到100，接上氨水調節發酵罐中的培養基pH到6.O，加入66ml經無菌過濾的微量元素添加劑70ml(PTMl:GuS04別206g/1，Nal0.08g/l，MnS04'H203g/l，CoCl20.5g/l，ZnCl20g/l，H3B030.02g/lNaMo03,2H200.2g/l，FeS047H2065g/l，Biotin0.2g/l，6MH2S0430ml/l)，加入已培養好的菌種開始培養。培養條件為溫度3(TC、溶氧大於30%、pH用氨水控制在6.0、攪拌速度900rpm、空氣流量為30L每分鐘。如此培養20小時後，培養基中的甘油逐漸被耗盡，此時溶氧開始上升。當溶氧上升後，開始以280ml/小時的速度向發酵罐中補加50%的甘油(含12ml/L的PTM1)溶液，如此再培養6小時，停止甘油補料。此時菌體濃度OD600在150左右，開始以50ml/小時向發酵罐中補加甲醇(含12ml/LPTM1)。穩定2小時後提高甲醇補料速度為100m1/小時，此流速再穩定2小時後提高甲醇補料速度到150ral/小時，以此速度補加甲醇70小時後結束髮酵。取出發酵液，6000rpm離心10分鐘，收集上清液。共收集上清液22L，上清液中的目標蛋白表達量在470mg/L。實施例2基因工程菌表達產物的分離純化藍色染料親和層析將實施例1獲得的發酵上清液用6MNaOH調節pH到7.0，上樣到經20rnMpH為7.0的磷酸鹽、500mMNaCl緩衝液平衡的藍色染料親和層析柱，柱床直徑100mm，柱床高度15cm，柱床體積為1000ml。流速8L/小時，經3小時後上完樣。上樣完畢後先用20mMpH為7.0的磷酸鹽、128mMKSCN緩衝液衝洗去未結合的物質，再用20mMpH為7.0的磷酸鹽、230mMKSCN緩衝液衝洗脫結合在柱上的融合蛋白。以紫外280nM吸收檢測，收集蛋白峰，共收集洗脫液3200ml。疏水層析收集的蛋白溶液加入3M的硫酸銨溶液630ml，使溶液中的硫酸銨的終濃度到0.46M，調節pH到7.0。此溶液上樣到經20mM的磷酸鹽加0.5M硫酸銨pH為7.0緩衝液平衡的PhenylHighPerformance層析柱，柱床直徑50mm,柱床高度10cm，柱床體積為300ml。流速為1.2L/小時，經3小時上樣完畢，然後先用20mM的磷酸鹽加0.3M硫酸銨pH為7.0緩衝液衝洗去未結合的物質，使紫外280nm吸收的降回到基線。再用20mM磷酸鹽加上0.1M硫酸銨pH7.0的溶液洗脫結合在柱上的融合蛋白。共收集蛋白峰780ml。離子交換層析收集的蛋白溶液加入lM醋酸調節pH到5.0，加入1500ml去離子水使電導率小於3ms/cm。此溶液上樣到經20mM的醋酸鈉pH為5.0緩衝液平衡的CMFF層析柱，柱床直徑50mm，柱床高度15cm，柱床體積為300ml。流速1.2L/小時，上樣完畢後先用80mM的醋酸鈉pH為6.5緩衝液緩慢洗脫，收集pH為6.2時的目標峰。共收集蛋白溶液820ml。實施例3小鼠的口服葡萄糖耐受實驗採用8—10周的昆明小鼠，購買後適應性詞養l周，自由採食和飲水。試驗前l天禁食16_18小時，按體重靜脈注射5mg/Kg人血清白蛋白或上述配置的重組胰高血糖素樣肽類似物白蛋白融合蛋白注射液。給藥後l小時口服灌注給予1.5mg/g體重的葡萄糖，分別在給糖前IO分鐘和給糖後的IO、20、30、60、120分鐘通過尾靜脈取血並測定葡萄糖水平。結果如下:tableseeoriginaldocumentpage10結果表明本發明獲得的重組胰高血糖素樣肽類似物白蛋白融合蛋白有明顯的降糖活性。圖1:重組長效胰高血糖素樣肽類似物表達電泳圖圖2:藍色染料親和層析圖譜圖3:疏水層析圖譜圖4:離子交換層析圖譜圖5:純化後的重組長效胰高血糖素樣肽類似物電泳圖圖6:小鼠口服葡萄糖耐受實驗血糖濃度隨時間圖。權利要求1.一種長效胰高血糖素樣肽類似物的製備方法，包括下列步驟a)在發酵罐中接種表達長效胰高血糖素樣肽類似物的基因工程畢赤酵母菌種；b)發酵罐發酵培養；c)發酵液離心並收集上清；d)發酵液上清液中長效人胰高血糖素樣肽類似物的分離純化:發酵液上清經藍色染料親和層析進行粗純化，再經疏水層析中純化，再經離子交換層析精純化後獲得純度大於95％的產物。2.如權利要求1所述長效胰高血糖素樣肽類似物的製備方法，其特徵在於，所述長效胰高血糖素樣肽類似物是由exendin-4與人血清白蛋白直接連接獲得的多肽，exendin-4與人血清白蛋白之間沒有連接肽。3.如權利要求1所述長效胰高血糖素樣肽類似物的製備方法，其特徵在於，所述步驟a為將基因工程菌菌種以YPD培養基搖瓶培養14小時_18小時後接種發酵罐。4.如權利要求1所述長效胰高血糖素樣肽類似物的製備方法，其特徵在於，步驟b中，所述發酵罐培養的條件為採用基礎鹽培養基，控制溶解氧大於30%，溫度為30°C，pH6.0，培養16-20小時後，補加甘油溶液，再培養4-6小時；甘油培養階段結束後，以向發酵罐中補加甲醇，發酵約70個小時後結束髮酵。5.如權利要求1所述長效胰高血糖素樣肽類似物的製備方法，其特徵在於，步驟b中，所述基礎鹽培養基中加有6ml/L培養基的微量元素添加劑PTM1。6.如權利要求1所述長效胰高血糖素樣肽類似物的製備方法，其特徵在於，步驟b中，所述甘油溶液為體積百分比50%的甘油溶液，且甘油溶液中含有12ml/L的PTM1。7.如權利要求1所述長效胰高血糖素樣肽類似物的製備方法，其特徵在於，步驟b中，所補加甲醇的過程為先控制補加甲醇的速度為3.6ml/小時/升培養基，其中甲醇中含有12ntl/L的PTM1，而後逐步提高甲醇補料速度到10.8ml/小時/升培養基，並以此速度補加甲醇70小時後結束髮酵。8.如權利要求1所述長效胰高血糖素樣肽類似物的製備方法，其特徵在於，步驟d中，所述發酵液上清經藍色染料親和層析進行粗純化的步驟為發酵上清液pH到7.0，上樣到經20rnMpH為7.0的磷酸鹽、500rnMNaCl緩衝液平衡的藍色染料(BlueS印hroase)親和層析柱，上樣完畢後先用20mMpH為7.0的磷酸鹽、128mMKSCN緩衝液衝洗去未結合的物質，再用20mMpH為7.0的磷酸鹽、230mMKSCN緩衝液衝洗脫結合在柱上的融合蛋白，以紫外280nM吸收檢測，收集蛋白峰。9.如權利要求1所述長效胰高血糖素樣肽類似物的製備方法，其特徵在於，步驟d中，所述疏水層析中純化的步驟為收集的蛋白溶液，調節硫酸銨的終濃度為0.46M，調節pH到7.0，此溶液上樣到經20mM的磷酸鹽加0.5M硫酸銨pH為7.0緩衝液平衡的PhenylHighPerformance層析柱，上樣完畢後先用20mM的磷酸鹽加0.3M硫酸銨pH為7.0緩衝液衝洗去未結合的物質，使紫外280nm吸收的降回到基線，再用20mM磷酸鹽加上0.1M硫酸銨PH7.0的溶液洗脫結合在柱上的融合蛋白。10.如權利要求1所述長效胰高血糖素樣肽類似物的製備方法，其特徵在於，步驟d中，所述離子交換層析精純化的步驟為收集的蛋白溶液調節pH到5.0，並用水稀釋到電導率小於3ms/cm，此溶液上樣到經20mM的醋酸鈉pH為5.0緩衝液平衡的CMFF層析柱，上樣完畢後先用80mM的醋酸鈉pH為6.5緩衝液緩慢洗脫，收集pH為6.2時的目標峰。全文摘要本發明涉及重組蛋白，公開了一種長效胰高血糖素樣肽類似物的製備方法，包括下列步驟在發酵罐中接種基因工程畢赤酵母菌種；發酵罐發酵培養；發酵液離心並收集上清；發酵液上清液中長效人胰高血糖素樣肽類似物的分離純化，最終獲得純度大於95％的產物。本發明的長效胰高血糖素樣肽類似物的製備方法，工藝條件容易控制，可以獲得具有生物活性的長效胰高血糖素樣肽類似物，且蛋白表達效率高及純化產物得率高。文檔編號C12R1/84GK101372705SQ20081004359公開日2009年2月25日申請日期2008年7月4日優先權日2008年7月4日發明者丁劍鋒,朱化星,王英明,蔡麗君申請人:上海欣百諾生物科技有限公司