降解黃麴黴毒素的方法

2023-06-12 23:30:11 2

專利名稱：降解黃麴黴毒素的方法
技術領域：
本發明涉及一種降解黃麴黴毒素的方法，特別是涉及一種利用Y射線輻照降解 黃麴黴毒素Bi的方法。
背景技術：
黃麴黴毒素(Aflatoxin，簡稱為AF)，是對人類和動物危害大的真菌毒素之一。 大量資料證實，黃麴黴毒素對人及動物的肝臟組織有很強的毒害作用，嚴重時可導 致肝癌，甚至死亡。黃麴黴毒素汙染食品比較嚴重，尤其是對花生、核桃、玉米及 其製品的汙染最為嚴重和普遍。此外，在大豆、稻穀、通心粉、牛奶及其製品、食 用油等食品中也經常發現黃麴黴毒素。黃麴黴毒素不僅降低農產品和飼料品質，使 經濟遭受巨大損失，還可通過汙染或殘留黃麴黴毒素的肉、乳等動物源性食品進入 人體，對人類健康造成威脅。其中毒性最強的是黃麴黴毒素B, (C17H1206，分子量 312)，為氰化鉀的10倍，其化學結構式如式I所示。(高橋治男；花生麴黴毒素 汙染途徑與防除；花生科技，2000， 1: 37。)
(式I)
現有去除黃麴黴毒素的方法，主要分為物理化學法和生物化學法。其中，物理 化學去毒法對食品的色、香、味及營養成分如維生素或蛋白質等均有不同程度的破 壞和不良影響。生物化學去毒法成本較高，很難在工業化水平製備高活性黃麴黴毒 素解毒活性物質。

發明內容
本發明的目的是提供一種降解黃麴黴毒素的方法。
本發明提供的降解黃麴黴毒素的方法，是用Y射線輻照含有黃麴黴毒素的樣品。 該方法中，Y射線是由放射性物質^Co產生的，輻照劑量為0-10kGy，但不包 括0;優選2-10kGy，更優選4-10kGy，尤其優選6-10kGy，最優選10kGy。上述含
有黃麴黴毒素的樣品為含有黃麴黴素的的農產品或農產品加工得到的製品，如食品或詞料等。該方法尤其適用於降解黃麴黴毒素Bp
本發明提供了一種利用輻照技術降解黃麴黴毒素的方法，該方法在去毒處理過 程中具有明顯的優勢，既可殺死病原微生物，又能降解其中的生物毒素，且不會產 生任何工業汙染。


圖1為黃麴黴毒素BJ勺標準曲線。 圖2為黃麴黴毒素Bi的選擇離子色譜圖。
具體實施例方式
下面結合具體實施例對本發明作進一步說明，但本發明並不限於以下實施例。
本發明各實施例中所用的儀器與試劑如下所示
Agilentll00液相系統(美國Agilent公司)；API3000三級四極杆質譜系統(美 國應用生物系統)；FW100高速萬能粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)；LD4-2 低速離心機(北京醫用離心機廠)；固相萃取裝置(美國Supelco公司)；Oasis HLB 固相萃取柱(3cc/60mg， Waters公司)；甲醇(色譜純Fisher);甲酸(分析純)； 正己垸(色譜純，天津市大茂化學試劑廠)；氯化鈉；超純水。
黃麴黴毒素B!標準品10mg (購於美國Sigma-Aldrich公司，純度^97%);
黃麴黴菌Us/^^〃M/7avM)ATCC11498(購自美國菌種保藏中心ATCC， 11498 號菌株)。
本發明中所用分析檢測條件如下所示
1) 色譜條件
Agilentll00液相系統
G1312A二元泵系統、G1367A型自動進樣器
色譜柱Agela Technologies Inc. VenusilASB-Cl8、柱內徑x柱長2.1x150mm, 填料直徑5|im
流速200|il/min
流動相甲醇水(甲酸的體積百分比濃度為0.1%) =7: 3 進樣體積50^1;
2) 質譜條件
API3000三級四極杆質譜系統
掃描方式多反應監測(MRM)，正離子分析模式 離子源Turbo Spray離子源 前級離子m/z二313.0， 二級離子m/z二241.1、 269.1參數設置
霧化氣(Nebulizer Gas， NEB):氮氣，10ml/min 窗簾氣(Curtain Gas, CUR):氮氣，12ml/min 電離電壓(Ionspray Voltage, IS) : 5500V 加熱溫度(Temperature, TEM) : 500°C 碰撞氣(Collision Gas, CAD):氮氣，8ml/min 去集勞夷電壓(Declustering Potential, DP) : 70V 聚焦電壓(Focusing Potential, FP) : 300V 入口電壓(Entrance Potential, EP) 10V 碰撞能(CollisionEnergy, CE) : 45V
碰撞池出口電壓(Collision Cell Exit Potential, CXP) : 9V 。
第一部分、製作標準曲線
1) 標準溶液的配製
用甲醇將黃麴黴毒素B, (AFB。配製成100mg/L標準儲備液，4"C避光保存。 用體積比為50: 50的甲醇與水的混合液稀釋標準儲備液，配製成O.l、 0.2、 0.5、 1、 2、 5、 10、 20、 50嗎/L的AFBi標準工作溶液。
2) 樣品的提取
稱取5g粉碎後的花生樣品於100ml離心管，加入50ml甲醇-水(6: 4) ， 5gNaCl， 20ml正己垸，搖勻，放入離心機中離心提取30min。提取後，用定量濾紙過濾，入 分液漏鬥靜置分層，取5ml下層溶液待用。
3) 樣品的淨化
將OASIS HLB固相萃取柱置於真空固相萃取裝置上，加2ml甲醇活化，待甲醇 至OASIS小柱吸附劑上層時，再加2ml純水平衡小柱，然後加樣品過濾液5ml過柱， 流速為lml/min，加入3ml純水淋洗OASIS小柱兩次，後用2ml體積比為3: 7的甲 醇與水的混合液淋洗OASIS小柱以除去雜質，用真空泵抽乾。最後以lml甲醇洗脫， 洗脫液用純水定容至2ml，待分析。
4) 花生接種黃麴黴菌產毒培養
將黃麴黴菌ATCC11498接種於察氏培養基(該培養基的具體配方為硝酸鈉 2g，磷酸氰二鉀lg，氯化鉀0.5g，硫酸鎂0.5g，硫酸亞鐵0.01g，蔗糖30g，瓊脂 15-20g，水1000ml) 12rC滅菌20min。斜面，溫度28。C，溼度50%，培養7天，待 斜面長滿黃綠色菌絲，菌絲上略生孢子時，用無菌水製成孢子懸浮液(107cfu/ml，其中cfu/ml為每毫升樣品中含有的細菌群落總數)。將5g花生在紫外燈下照射 30min滅菌後，加入5ml無菌水(121°C， 20min)，然後加入孢子懸浮液lml。溫度 28°C，溼度50%，培養7天。 5)標準曲線及檢測限
準確吸取0.1 、0.2、 0.5、 1、2、 5、 10、20、50ng/LAFB!標準溶液50^1， HPLC-MS/MS
分析，得到黃麴黴毒素Bi峰面積對濃度進行線性回歸，即得標準曲線，如圖l所示。 該標準曲線為線性方程為y=10494x+3041.9。
按3倍信噪比計算，當樣品組分的響應值等於基線噪聲的3倍時，該樣品的濃 度即可作為最低檢測限。當樣品組分的響應值等於基線噪聲的IO倍時，該樣品的濃 度即可作為最低定量限。
由圖1可知，當黃麴黴毒素Bi濃度為0.03嗎/kg時，S/N=3.2，故方法的最低檢 測限約為0.03pg/kg。當黃麴黴毒素B!濃度為0.1pg/kg時，S/N=10.2，故方法的最低 定量限約為0.1嗎/kg 。
第二部分、Y射線輻照降解花生中的黃麴黴毒素及測定結果 本實施例提供的對花生中的黃麴黴毒素進行降解的具體方法是 稱取5g染菌花生樣品，置於100ml聚丙烯離心管(材質為99.9%生物級聚丙烯， 耐輻射)中密封，放入6QCoY射線輻射場(中國農業輻照中心)內進行輻照處理，輻 照劑量分別設定為OkGy、 2kGy、 4 kGy、 6 kGy、 8kGy或10kGy。實驗設三次重複。 之後按照下述步驟對上述輻照後的花生樣品進行測定；
1) 提取
取輻照後的花生樣品離心管，加入50ml體積比為6: 4的甲醇與水的混合液， 5gNaCl， 20ml正己烷，搖勻，放入離心機中離心提取30min。提取後，用定量濾紙 過濾，入分液漏鬥靜置分層，取5ml下層溶液待用。平行樣品2個。
2) 淨化
將OASIS HLB固相萃取柱置於真空固相萃取裝置上，加2ml甲醇活化，待甲醇 至OASIS小柱吸附劑上層時，再加2ml純水平衡小柱，然後加步驟l)得到的樣品 過濾液5ml過柱，流速為lml/min，加入3ml純水淋洗OASIS小柱兩次，後用2ml 體積比為3: 7的甲醇與水的混合液淋洗OASIS小柱以除去雜質，用真空泵抽乾。 最後以lml甲醇洗脫，洗脫液用純水定容至2ml，待分析。
3) 測定
分別注入50pL適當濃度的黃麴黴毒素Bj示準溶液及樣品提取物溶液於高效液相色譜串聯質譜儀中，按照前述分析檢測條件進行分析，記錄峰面積。圖2為黃曲 黴毒素Bi的選擇離子色譜圖。根據標準樣品的保留時間進行定性分析，利用外標法 進行定量分析。
將上述染菌花生樣品經提取、淨化、進LC-MS分析後，樣品中黃麴黴毒素B, 的峰面積，結合圖1所示的標準曲線換算成樣品溶液的濃度，計算溶質的質量，再 除以稱取的花生的質量，得到輻照降解後的折合濃度。降解率由不同Y射線吸收劑 量下的折合濃度與未輻照時的折合濃度相比得出。上述結果均列於表1中。另外， 已計算得到未輻照的染菌花生中黃麴黴毒素Bi的汙染濃度為64pg/kg。上述計算數 據均為三次重複的平均值。
由表1可知，經Y射線輻照後，黃麴黴毒素B,可達59.61%。我國GB2761-2005 《食品中真菌毒素限量》規定黃麴黴毒素B,的限量為〈20^ig/kg;而國際上關於總黃 麴黴毒素的含量一般都小於15pg/kg，對黃麴黴毒素Bi的限量要求更低。花生中黃曲 黴毒素B!的汙染水平為6-400pg/kg，禾,本發明提供的Y射線輻照降解方法，在輻照 劑量為10kGy時，降解率可達59.61%，對出口貿易具有現實的利用價值。
表l、染菌花生中黃麴黴毒素B,的輻照降解
吸收劑量折合濃度 /)xg/kg降解率/0/。
0640
258.788.15
450.4421.18
639.9237.63
833.1848.15
1025.8559.61
權利要求
1、一種降解黃麴黴毒素的方法，是用γ射線輻照含有黃麴黴毒素的樣品。
2、 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述Y射線是由放射性物質6130) 產生的。
3、 根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於所述輻照劑量為0-10 kGy， 但不包括0。
4、 根據權利要求3所述的方法，其特徵在於所述輻照劑量為2-10kGy。
5、 根據權利要求4所述的方法，其特徵在於所述輻照劑量為4-10kGy。
6、 根據權利要求5所述的方法，其特徵在於所述輻照劑量為6-10kGy。
7、 根據權利要求6所述的方法，其特徵在於所述輻照劑量為10kGy。
8、 根據權利要求l-7任一所述的方法，其特徵在於所述黃麴黴毒素為黃麴黴毒 素B!。
9、 根據權利要求l-8任一所述的方法，其特徵在於所述含有黃麴黴毒素的樣品為含有黃麴黴素的的農產品或農產品加工得到的製品。
10、 根據權利要求9所述的方法，其特徵在於所述含有黃麴黴素的的農產品或 農產品加工得到的製品為花生或花生製品。
全文摘要
本發明公開一種降解黃麴黴毒素的方法。該方法是用γ射線對含有黃麴黴毒素的樣品進行輻照。其中，γ射線是由放射性物質60Co產生的，輻照劑量為0-10kGy，但不包括0；優選2-10kGy，更優選4-10kGy，尤其優選6-10kGy，最優選10kGy。上述含有黃麴黴毒素的樣品為含有黃麴黴素的農產品或農產品加工得到的製品，如食品或飼料等。該方法尤其適用於降解黃麴黴毒素B1。該方法既可殺死病原微生物，又能降解其中的生物毒素，且不會產生任何工業汙染。
文檔編號A23L1/015GK101491310SQ200910078708
公開日2009年7月29日 申請日期2009年3月2日 優先權日2009年3月2日
發明者周洪傑, 哈益明, 李彥傑, 靜 楊, 鋒 王, 蓓 範 申請人:中國農業科學院農產品加工研究所