Leber氏遺傳性視神經病變相關mtDNA突變位點集成檢測基因晶片及其製備與應用的製作方法
2023-06-12 05:42:46 3
專利名稱：Leber氏遺傳性視神經病變相關mtDNA突變位點集成檢測基因晶片及其製備與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因晶片，具體涉及與Leber氏遺傳性視神經病變相關的檢測基因晶片及 其製備與應用。
背景技術：
Leber氏遺傳性視神經病變(Leber， s hereditary optic neuropathy, L,)是一 種最常見的遺傳性視神經萎縮疾病，以兩側急性或亞急性中央視力喪失為特徵，主要累及 青少年男性。1871年，Theodor Leber首次報導了一個LHON家系，並詳盡描述了 LHON的 臨床特徵。隨後一段時期內，人們認為LHON的遺傳學模式與X染色體相關聯(X-linked), 直到1972年Erickson提議LHON的遺傳方式更傾向於母系遺傳，他認為可能存在某個潛在 的線粒體DNA(mtDNA)突變與LHON相關。1988年，Wallace及其同事首次報導LHON與MTND4 基因11778G〉A突變相關，至今已有30多種mtDNA點突變被報導與LHON相關，它們廣泛地 分布在世界各地不同種族和人群中。從MITOMAP資料庫(http:〃w麗.mitomap.org)可以檢 索到與LHON相關的基因突變位點，其中90%以上的LHON患者與三大原發性mtDNA突變 (11778G〉A, 3460G〉A及14484T〉C)有關，一些罕見的rotDNA突變也能引發LH0N，如14459G〉A, 10663T〉C, 14568C>T， 14482T〉A/G, 14495A>G, 4171C〉A， 3733G〉A等。雖然LHON的發病機 制至今沒有被完全闡明，毋庸置疑，原發性突變是LHON的發病基礎。但僅存在原發性突變 還不足以致病，如攜帶11778G〉A, 3460G〉A或14484T〉C的部分家系成員可不表現出任何臨 床症狀，其他遺傳學因素(如繼發性mtDNA突變、核調節基因)和環境因素亦可能在LHON 的病理生理學進程中發揮關鍵作用。此外，攜帶相同原發性突變位點的不同家系可表現出 不同的外顯率、發病年齡、嚴重程度以及視力喪失過程。因而，有必要對原發性突變以外 的致病因素(如罕見突變和繼發性突變)進行篩査，以進一步闡明mtDNA突變與LHON的關 系，為診斷和治療提供指導。
基因診斷技術的出現，改變了過去臨床上僅依靠典型家族史和臨床特徵為判斷依據，提 高了對散發LHON病的確診率。至今LHON病仍無十分有效的療法，婚前遺傳諮詢和分子遺 傳學檢測是預防和降低本病發生率的有效措施。己經建立了不少mtDNA突變檢測方法，如
4限制性酶切片段長度多態性(Restriction fragment length poly morphism， RFLP)、單鏈 構象多態性(Single- strand conformation polymorphism, SSCP)、等位基因特異性寡核 苷酸斑點印記(Allele-specific oligonucleotide dot blot)、溫度梯度電泳(Temperature gradient gel electrophoresis, TGGE)、 瞬時溫度梯度電泳(Temporal temperature gradient gel electrophoresis, TTGE)、變性梯度凝膠電泳(Denaturant gradient gel electrophoresis, DGGE)禾口變性高效液相色譜(Denaturing high performance liquid chromatography, DHPLC)等，但在實際運用中這些技術仍存在一定的局限性，如RFLP花費 高、工作量大，且有些重要突變位點因不在所用限制性內切核酸酶的識別範圍而不能被檢 測到，其他方法相對於RFLP要複雜，更主要的是，這些方法大多一次只能針對一個或幾個 突變位點進行檢測，檢測結果常需DNA測序驗證。全長mtDNA測序技術是目前LHON病最可 靠的基因診斷方法，但該方法工作量大、費用昂貴，難以在常規臨床診斷實驗室普及運用。
目前，與本發明相關的中國發明專利共有三個，發明名稱分別是Leber氏遺傳性視 神經病變檢測方法及其試劑盒(申請號96116296.1)， Leber' s遺傳性視神經病病人的線 粒體DNA突變定量檢測方法(申請號200410027623.4)和Leber氏遺傳性視神經病變的 基因診斷試劑盒及其檢測方法(申請號200510006097.8)。這些專利都只針對LH0N三種 原發性突變(11778G〉A， 3460G〉A及14484T〉C)中的部分或全部進行檢測，而不針對罕見 突變或繼發性突變進行檢測，在運用上仍有一定的局限性。
基因晶片是近年來迅速發展起來的集物理學、化學、材料科學和生命科學於一體的高新 技術，利用微電子晶片技術的集約化和平行處理原理，將大量具有生物學意義的特殊序列 的生物樣品有序地固化在玻璃片和矽片等基質表面，並利用微量反應體積， 一次雜交就可 以對許多基因表達水平、突變和多態性進行特異、快速、精確檢測，己經在基因表達、基 因突變、基因多態性研究和基因診斷等領域獲得成功應用。由於基因晶片具有這些獨特的 優點使其在線粒體基因檢測方面得到一定的運用，如利用表達譜微陣列對線粒體基因的表 達狀況進行檢測，來探討線粒體病的發病機制，或利用寡核苷酸微陣列上的引物延伸反應 或直接核酸雜交檢測線粒體單核苷酸多肽性(SNP)等。
由於與LH0N相關的mtDNA突變位點數量較多，常規基因診斷方法已經難以滿足要求， 因而，研發一種新型基因晶片，用於對LHON相關mtDNA突變位點的集成檢測，無疑具有潛 在的社會效益和臨床價值。
發明內容
本發明的目的之一在於提供一種Leber氏遺傳性視神經病變相關mtDNA突變位點集成檢 測基因晶片及其製作方法。
本發明的另一個目的在於提供一種上述Leber氏遺傳性視神經病變相關mtDNA突變位點 集成檢測基因晶片的使用方法。
本發明的構思如下
建立一種檢測Leber氏遺傳性視神經病變相關32個突變位點的基因晶片。該基因晶片 包括檢測系統和監控系統。檢測系統根據MITOMAP資料庫(hUp:〃麗w.mitomap.org)報導 的32個與Leber氏遺傳性視神經病變相關的線粒體DNA (mtDNA)突變位點，設計相應的位點 特異性寡核苷酸探針，利用氨基與醛基的共價結合將寡核苷酸探針固定在晶片表面，探針 與螢光標記的樣本PCR擴增產物雜交，根據雜交信號可判斷有無突變發生及突變類型。監 測系統與檢測系統位於同一陣列，包括陽性對照、陰性對照和平行對照，陽性對照為檢測 系統各探針的等量混合物，陰性探針為點樣液，平行對照為東亞人常見的mtDNA U719G〉A 單核苷酸多態性位點探針，可以根據監控系統來判斷雜交的質量。
具體來說，根據修正版劍橋mtDNA參考序列(revised Cambridge Reference Sequence, rCRS)和MITOMAP資料庫(http:〃www. mitomap. org)報導的32種與Leber氏遺傳性視神經 病變相關的mtDNA點突變(分別為:T3394C、 G3460A、 G3635A、 G3733A、 A4136G、 T4160C、 C4171A、 T4216C、 A4435G、 C4640A、 A4917G、 G5244A、 G7444A、 G9738T、 G9804A、 T10663C、 G11696A、 G11778A、 G13708A、 G13730A、 G14459A、 C14484A、 A14495G、 T14498C、 A14495G、 T14498C、 C14568T、 A14596T、 A14693G、 G15257A、 G15812A、 A15951G)和東亞人常見的mtDNA 11719G〉A多態性位點，共設計了 33對探針(其中32對探針針對32個Leber氏遺傳性視神 經病變相關突變位點，1對探針針對11719G〉A多態性位點)和11對PCR引物。11對引物 分成三組在同一熱循環下進行多重PCR擴增，能特異地擴增出包含上述32個Leber氏遺傳 性視神經病變相關mtDNA突變位點和11719G〉A多態性位點的目的DNA片段。在一張晶片上 固定上述33對探針，只用一次PCR和一次雜交反應，就可以在6—8小時及時準確地確認 被檢者是否存在上述突變位點，.從而為治療和遺傳學諮詢提供確鑿證據，並可以進一步闡 明這些突變位點在中國人群中的分布及其對病因、發病機理、臨床治療及預後的影響。
本發明一方面公開了一種Leber氏遺傳性視神經病變相關mtDNA突變位點集成檢測基因 晶片，在基因晶片載體表面點陣固定有與Leber氏遺傳性視神經病變相關的mtDNA突變位 點的特異性寡核苷酸探針和mtDNA 11719G〉A單核苷酸多態性位點的特異性寡核苷酸探針。
6上述特異性寡核苷酸探針的設計原則為根據MITOMAP資料庫報導的32種LHON相關 mtDNA突變位點和11719G〉A多態性位點，參考修正版劍橋mtDNA參考序列(revised Cambridge Reference Sequence, rCRS)，使不同探針的Tm值儘量位於(45±5) °C，使探 針長度位於14-20 bp，使每對探針所檢測的基因位點位於探針序列中部或中部附近，使探 針與相應單鏈靶基因的結合部位儘量靠近單鏈靶基因的5'端至中部區域之間以保障雜交 效率。特異性寡核苷酸探針可特異性識別Leber氏遺傳性視神經病變相關的mtDNA突變位 點和11719G〉A多態性位點。
上述特異性寡核苷酸探針選自序列為SEQ ID NO. 1 65的寡核苷酸探針中的一個或多個。
較佳的，基因晶片載體表面點陣固定有序列為SEQ ID NO. 1 65的寡核苷酸探針，該 晶片可用於特異檢測LHON相關的mtDNA突變和11719G〉A多態性位點。
優選的，上述寡核苷酸探針的5'端有氨基修飾基團，以便與醛基修飾晶片相結合，探 針5'端加上一段15聚的Poly T，以減少雜交時的空間位阻。
上述基因晶片還可固定有陰性對照及陽性對照。陰性對照為點樣液，陽性對照為所選的 各寡核苷酸探針的等量混合液。
上述基因晶片載體可以為載玻片，優選醛基修飾的載玻片。
本發明第二方面，公開了上述Leber氏遺傳性視神經病變相關mtDNA突變位點集成檢測 基因晶片的製備方法，包括下列步驟
將選自序列為SEQ ID NO. 1 65的寡核苷酸探針5'端加上一段15聚的Poly T,並對 5'端進行氨基修飾，用去離子水將各探針分別稀釋，並分別與點樣液等體積混合，獲得終 濃度為12.5 50 uM的寡核苷酸探針溶液，採用常規的方法將寡核苷酸探針溶液與陰性對 照和陽性對照一起點陣於載玻片表面並固定。
上述點樣液的作用在於優化晶片製作的質量，可選用各種市售或自行配置的點樣液。
本發明的第三方面，公開了上述Leber氏遺傳性視神經病變相關mtDNA突變位點集成檢 測基因晶片的使用方法，包括下列步驟
1) 收集患者外周血，抽取樣本DNA;
2) 樣本DNA的PCR擴增和標記以樣本DNA為模板，選擇合適引物PCR擴增並標記待 測的突變相關序列；
3) 採用前述基因晶片於樣本PCR產物變性後進行雜交檢測將樣本PCR擴增產物等體
7積混合後，與適量體積雜交液混合(如將樣本PCR擴增產物與雜交液以1: 2 1: l的體積 比混合)，將與雜交液混勻後的PCR產物變性，取適量體積滴在晶片的點陣區進行雜交，雜 交後用洗液洗滌，再檢測標記信號的強度。通過檢測標記信號的強度比對，可判斷是否發 生相應突變。
上述雜交液為常規用於核酸雜交反應的雜交液，可選用各種市售或自行配置的雜交液。
上述雜交液溶解後的PCR擴增產物變性可採用常規的變性方法，如95'C變性。 洗液用於將未完全匹配的PCR擴增產物從晶片上除去，可選用本領域常規的用於核酸雜 交的洗液。
較佳的，上述步驟3中，雜交溫度為35-40。C;雜交時間為30-60分鐘。
洗液洗滌時，先用一次洗液洗5-15分鐘，再用二次洗液洗5-15分鐘。優選的， 一次洗 液為2xSSC+0. lw%SDS (以洗液總重量為基礎計)；二次洗液為0. 2xSSC+0. lw%SDS ; —次 洗脫條件為30'C洗滌IO分鐘；二次洗脫條件為3(TC洗滌5分鐘。
改進的，上述步驟2中的引物選自序列為SEQ ID N0.66 87的核苷酸序列。每對正反 引物中，至少有一個被標記，標記可採用常規的標記，如螢光標記等，本發明實施例中使 用了 Cy5螢光分子標記，並使用雷射共聚集掃描儀掃描螢光信號強度。
更佳的，上述步驟2中的PCR擴增為多重PCR擴增將序列為ID NO. 66 71、 ID NO. 72 79、 IDN0.80 87的核苷酸序列分別作為三組多重PCR的引物，在同一熱循環下以樣本DNA 為模板進行PCR擴增。
本發明的第四方面，公開了上述檢測Leber氏遺傳性視神經病變相關mtDNA突變位點集 成檢測基因晶片在製備Leber氏遺傳性視神經病變相關mtDNA突變位點的檢測試劑盒中的 應用。
本發明第五方面，公開了一種Leber氏遺傳性視神經病變相關mtDNA突變位點的檢測試 劑盒，包括上述基因晶片，及Leber氏遺傳性視神經病變相關mtDNA突變位點的PCR擴增 引物。
較佳的，上述Leber氏遺傳性視神經病變相關mtDNA突變位點的PCR擴增引物為選自序 列為SEQ ID NO. 66 87的核苷酸序列中的一個或多個。
優選的，上述Leber氏遺傳性視神經病變相關mtDNA突變位點的PCR擴增引物為SEQ ID N0.66 87的核苷酸序列。各引物可分別獨立包裝。
試劑盒中還可包括其他在試劑盒使用過程中需用到的常規試劑，如雜交液、核酸雜交洗 液等。較佳的，上述洗液包括一次洗液和二次洗液，其中一次洗液為2xSSC+0. lw%SDS; 二次洗液為0. 2xSSC + 0. lw%xSDS。
本發明的基因晶片可用於檢測Leber氏遺傳性視神經病變相關的mtDNA突變位點，可一 次同時檢測32種mtDNA突變位點。優選方案僅需1次PCR擴增和1次雜交反應，即可特異 性檢測臨床樣本中32種與Leber氏遺傳性視神經病變相關的突變位點。本發明的基因晶片 具有省時、費用低廉和操作簡便等優點，從樣本製備到PCR擴增，得到檢測結果，可在6 一8小時內完成，大大縮短了對患者的診斷時間，可以對臨床上疑似Leber氏遺傳性視神經 病變患者的mtDNA進行初步篩查，以確定有無已知突變體，從而為疾病的治療或遺傳學諮 詢提供一定的線索，具有較好的臨床推廣價值。本發明的基因晶片還具有很高的靈敏度和 特異性，與傳統分子生物學方法相比，檢測時間大大縮短，達到LHON臨床診斷與鑑別診斷 的目的。
圖l晶片點樣布陣圖，P為陽性對照，成份為SEQ ID NO. 1 65探針的等量混合物，N為 陰性對照，成份為點樣液。
圖2 P卜11778G〉A均質性突變體晶片檢測與DM測序結果
圖3 P2-11778G〉A異質性突變體晶片檢測與DNA測序結果
圖4 P3-3460G〉A和3394T>C均質性突變體晶片檢測與DNA測序結果
圖5 P4-14484T>C均質性突變體晶片檢測與DNA測序結果
具體實施例方式
下面結合實施例進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明，而非限制 本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法及未說明配方的試劑均為按照常 規條件如Sambrook等人，分子克隆試驗手冊(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件或者製造商建議的條件進行或配置。
實施例1 探針設計和晶片的製備 (1)晶片上探針的設計 根據MIT0MAP資料庫報導的32種LHON相關mtDNA突變位點和11719G〉A多態性位點， 參考修正版劍橋ratDNA參考序列(revised Cambridge Reference Sequence, rCRS)，設計並篩選獲得33對寡核苷酸探針，使不同探針的Tm值儘量位於(45±5) 'C，使探針長度位 於14-20 bp，使每對探針所檢測的基因位點位於探針序列中部或中部附近，使探針與相應 單鏈靶基因的結合部位儘量靠近單鏈靶基因的5'端至中部區域之間以保障雜交效率。探針 的5'端有氨基修飾基團，以便與醛基修飾晶片相結合；不同探針的綜合參數(探針長度、 GCX及Tm值)儘量接近，為了減少雜交時的空間位阻，合成時，在33對探針的寡核苷酸 5'端加上一段15聚的Poly T (連接臂)。陽性對照探針選取各個探針的等量混合物，陰性 對照探針選取點樣液。檢測系統和平行對照的33對探針如表1所列
表1檢測系統和平行對照氨基修飾探針
探針名稱 SEQ ID NO.探針序列(5， 一3')
3394T1ATTCTAGGCTATATACAACT
3394C2ATTCTAGGCCATATACAAC
3460G3GTTTTATGGCGTCAGCG
3460A4AGTTTTATGGTGTCAGCGA
3635G5ACCTCTAGCCTAGCC
3635A6ACCTCTAACCTAGCC
3733G7TCTCATATGAAGTCACC
3733A8TCTCATATAAAGTCACC
4136A9TCGGGGGTATGCTGT
4136G10TCGGGGGCATGCTG
4160T11GGTGTATGAGTTGGTC
4160C12GGTGTATGGGTTGGT
4171C13TTTTTCATAGGAGGTG
4171A14TTTTTCATATGAGGTG
4216T15TGGAGACATATCATATAAG
4216C16TGGAGACATGTCATATAAG
4435A17TTCGGGGTATGGGC
4435G18TTCGGGGCATGGGC
4640C19GCTGCCATCAAGTATT
4640A20GCTGCCATAAAGTATT4917 A21CCTCACTAAACGTAAG
4917 G22CCTCACTAGACGTAAG
5244 G23GCTAACCGGCTT
5244 A24GCTAACCAGCTTTTT
7444 G25CTTTTTTGTCTAGATTT
7444 A26CTTTGTTTAGATTT
9738 G27CCTACAAGCCTCAGA
9738 T28CCTACAATCCTCAGA
9804 G29TTTTGTAGCCACAGG
9804 A30TTTTGTAACCACAGG
10663 T31CGGCAAAGACTAGTAT
10663 C32CGGCAAAGGCTAGTA
11696 G33TGAGAATGACTGCGC
11696 A34TGAGAATGATTGCGC
11719 G35GATGTAAGCCCGTGG
11719 A36GATGTAAGTCCGTGG
11778 G37TATGATGCGACTGTG
11778 A38TTATGATGTGACTGTG
13708 G39AACGCCTGGCAGCC
13708 A40AACGCCTGACAGCC
13730 G41TCGCAGGATTTCTCA
13730 A42TCGCAGAATTTCTCA
14459 G43TACTACAGCGATGGC
14459 A44TACTACAGTGATGGC
14482 C45GGAATGATGGTTGTCT
14482 A46GGAATGATTGTTGTCT
14482 G47GGAATGATCGTTGTC T14484 T48GGGAATGATGGTTGT
14484 C49GGGAATGGTGGTTG
1114495A50AATTTATTTAGGGGGA
14495G51AATTTATTCAGGGGGA
14498T52TTTAATTTATTTAGGGG
14498C53TTTAATTTGTTTAGGGG
14568C54TGTTAGCGGTGTGGT
14568T55TGTTAGCAGTGTGGT
14596A56CCTTCTCCTATTTATGGG
14596T57CCTTCTCCTATATATGGG
14693A58GTCGTGGTTGTAGTC
14693G59GTCGTGGCTGTAGTC
15257G60ACTCAGTAGACAGTCCC
15257A61ACTCAGTAAACAGTCCC
15812G62TAGCATCCGTACTATAC
15812A63TAGCATCCATACTATAC
15951A64TTCCAAGGACAAATC
15951G65TTCCAAGGGCAAATC
(2)晶片的製備
點樣液為Micro-Spotting Solution (2X)，購自TeleChem Internation公司，室 溫保存。
探針由Takara公司負責合成，用去離子水將探針稀釋，並與點樣液等體積混合，使探 針終濃度為12.5uM，通過Cartesian Tech. ， PROSYS 5510A晶片製作系統點陣於醛基修飾 的載玻片表面，檢測系統和平行對照的每個探針平行點3個點，置於70%的相對溼度、室 溫條件下48-72小時進行固定。取出後於沸水浴中30秒，空氣中充分乾燥，4'C保存，即 製成了檢測Leber氏遺傳性視神經病變32種相關突變的基因晶片，晶片點樣布陣圖見圖1。
實施例2 樣本的突變檢測 (1)樣本的製備、標記和處理 用Qiagen公司DNA抽提試劑盒提取Leber氏遺傳性視神經病變患者或疑似患者樣本
12DNA，備用。
樣本的PCR擴增和標記處理在同一熱循環下，通過三組多重PCR(將序列為ID NO. 66 71、 ID NO. 72 79、 ID NO. 80 87的核苷酸序列分別作為三組多重PCR的引物)來擴增11 條靶基因，這11條靶基因涵蓋與Leber氏遺傳性視神經病變相關的32個rnt潔A突變位點 和11719G〉A多態性位點。在25ul PCR反應體系中(擴增體系包括2. 5 ul 10*PCR buffer, 各200 uM的dATP、 dGTP、 dCTP、 dTTP， 1. 5mM MgCl" 1. 5U DNA TagE (Takara),和介於 0.05-0. 5 uM之間不等的引物，每個反應中加入100 ng樣本DNA，通過以下熱循環過程制 備11條螢光標記的樣本DNA目的片段首先在94。C變性5min，以94。C， 35s， 61°C, 55s ， 72°C， 90s循環35次，最後在72。C延伸10min。上述PCR引物由Takara公司合成，其中， 每對正向引物和反向引物中至少有一條引物的5'端加cy5螢光分子標記，引物序列如表2 所列。
表2 PCR引物
引物名稱 SEQ ID NO.引物序列(5， 一3')
PI--F66CAG CCGCTATTA AAGGTTCGT
PI--R67TGG CAGGAGTAA TCAGAGGTG
P2--F68TCT TCAATCAGC CACATAGCC
P2--R69TCT CGGTAAATA AGGGGTCGT
P3--F70ACC AATCCTACC TCCATCG
PS--R71CCA AGGAGTGAG CCGAAGT
PI-F72TAG AAGAACCCT CCATAAACCTG
P4--R73TA GCG TCT TGT AGA CCT ACT TGCP5--F74ACA CCCACTCCC TCTTAGCC
P5--R75GTT GGGACGATT AGTTTTAGCA
P6--F76CGT CCTTGCCCT ATTACTATCC
P6--R77TTG GGTGCTAAT GGTGGAGT
P7--F78GAC CCTACTTCT AACCTCCCTG
P7--R79CAC CTCAACTGC CTGCTATG
P8--F80GCA CCACGACCC TACTACTATC
13P8-R 81 GGG ATG ATG AGG CTA TTG TTT
P9-F 82 CGA AAC CAA ATA ATT CAA GCA C
P9-R 83 GAA AGT TGA GCC AAT AAT GAC G
P10-F 84 CAA ACG CCT GAG CCC TAT C
PIO-R 85 GAA TCC GAG TAT GTT GGA GAA AT
Pll-F 86 CAT CGG CAT TAT CCT CCT G
Pll-R 87 GTT GTT TGA TCC CGT TTC G
注F表示正向引物，R表示反向引物。
從三組多重PCR擴增產物中分別取10yl，與30ul雜交液混勻，作為晶片雜交用靶基因。
(2)雜交反應和信號檢測 取實施例2步驟(l)的晶片雜交用靶基因15ul， 95。C變性10min，迅速冰浴3-5 min， 取lOul變性後的晶片雜交靶基因滴於實施例1製備的檢測Leber氏遺傳性視神經病變32 種相關突變的基因晶片表面的點陣區域，蓋上蓋玻片，置於37。C溼盒中雜交45min，然後 30。C於洗液l (2XSSC， 0. P/。SDS)中蕩洗10min，再於洗液2 (0.2XSSC， 0.1°/。SDS)中蕩洗 5min，氮氣吹乾。用雷射共聚集掃描儀(GenePix4000B，Axon Instruments, Inc.)在635咖處 掃描前述洗脫並乾燥後的雜交晶片，掃描強度設為700 (最大為920);通過圈點過濾背景 信號，提取各點平均螢光信號強度值。配合其配套軟體分析，最終獲得晶片檢測結果。以 診斷比值(野生型探針信號強度平均值與相應位點突變型探針信號強度平均值的比值)作 為分析突變是否存在的標準，如果診斷比值在3以上為野生型，在0.3以下為均質性突變， 介於0.3和3之間為異質性突變。(比值衡量標準參考Du W， Marsac C， Kruschina M, Ortigao F， Florentz C. Functionalized self-assembled monolayer on gold for detection of human mitochondrial tRNA gene mutations. Anal Biochem， 2003， 322(1): 14-25獲得)
用實施例1製備的檢測Leber氏遺傳性視神經病變32種相關突變的基因晶片分別對20 例健康對照和12例Leber氏遺傳性視神經病變患者按上述方法進行檢測各健康對照均未 檢測到32種相關突變；12例患孝中8例檢測到11W8G〉A均質性突變，1例檢測到11"8G〉A 異質性突變，1例同時檢測到3460G〉A和3394T〉C均質性突變，1例檢測到14484T>C均質 性突變；所有健康對照和患者均檢測到11719G〉A單核苷酸多態性。晶片檢測結果與DNA測 序結果完全吻合。
144例含不同突變體患者樣本晶片掃描圖示例和相應突變位點DNA測序結果如圖2-5所 示，對應位點的晶片診斷比值如表3所列
表3突變診斷比值
mtDNA突變位點Pl (w/m)P2(w/m)P3(w/m)P4(w/m)
3394T>C4. 23. 4。.763. 2
3460G〉A3. 74. 3。J3. 5
3635G>A18341114
3733G>A66452455
4136A>G12145. 613
4160T〉C8. 57. 75.47. 5
4171C>A33361724
4216T〉C9.5117.49.2
4435A〉G9. 5265. 67. 7
4640OA14234. 09. 3
4917A〉G13186. 148
5244G〉A49482048
7444G〉A11104.332
9738G〉T62331964
9804G>A614813147
10663T>C8.98.74,411
11696G〉A17161029
11719G〉A0. 060. 040. 120. 06
11778G〉Aft "7. 77. 513
13708G〉A9. 1101315
13730G〉A786629132
14459G〉A28191647
144820A63482311
144820G13883339. 5
14484T〉C138.47.3。.似
14495A〉G4. 47.73.913
14498T>C3. 58.33.210
14568C〉T463915156
14596A〉T12141619
151柳3A〉G 21 24 9.7 128
15257G>A 64 34 22 394
15812G>A 26 26 13 94
15951A>G 5.9 6.4 5.0 20
w/m指野生型探針螢光信號強度平均值與相應位點突變。 實施例3試劑盒的組裝
按實施例1製備基因晶片，將實施例2記載的SEQ ID NO. 66 87的PCR引物分裝，與製得 的基因晶片、雜交液、核酸雜交洗液組配後包裝製得試劑盒。序列表
<110〉安徽醫科大學中國科學院上海微系統與信息技術研究所
<120〉 Leber氏遺傳性視神經病變相關mtDNA突變位點集成檢測基因晶片及其製備與應用
PCNWX081297
87
<170〉 Patentln version 3. 1
〈210〉 1
<211〉 20
〈212〉 腿
artificial sequence
探針
1
attctaggct atatacaact 20
<210〉 2
19
<212〉 腿
artificial sequence
〈223>探針
〈400> 2
attctaggcc atatacaac 19
3
〈211〉 17
DNA
artificial sequence〈220〉
〈223〉 探針 〈400> 3
gttttatggc gtcagcg 17
4
〈211〉 19
〈212〉 腿
〈213〉 artificial sequence <220〉
〈223〉探針
〈400> 4
agttttatgg tgtcagcga 18
〈210〉 5
〈211〉 15
DNA
〈213〉 artificial sequence
〈223〉探針
5
acctctagcc tagcc 15
〈210〉 6
〈211〉 15
DNA
〈213> artificial sequence 〈220〉
〈223〉 探針
〈400〉 6
18tagcc 15
〈210〉 7
〈211〉 17
〈212〉 DNA
〈213〉 artificial sequence 〈220〉
<223〉 探針
〈400> 7
tctcatatga agtcacc 17
〈210〉 8
〈211〉 17
〈212〉 DNA
〈213〉 artificial sequence <220〉
〈223〉探針
〈400〉 8
tctcatataa agtcacc 17
〈210〉 9
15
〈212〉 DNA
〈213〉 artificial sequence 〈220〉
〈223〉 探針
〈400〉 9
tcgggggtat gctgt 15
〈210〉 10〈211> 14
〈212> DNA
<213〉 artificial sequence 〈220〉
〈223〉 探針
〈400> 10
tcgggggcat gctg 14
<210〉 11
16
〈212〉 DNA
〈213〉 artificial sequence 〈220>
〈223〉 探針
〈400〉 11 ggtgtatgag ttggtc
〈210〉 12
〈211〉 15
<212〉 DNA
〈213〉 artificial sequence 〈220〉
〈223〉探針
〈400〉 12 ggtgtatggg ttggt
13
〈211〉 16
<212〉 DNA
〈213〉 artificial sequence
探針 <400〉 13
tttttcatag gaggtg 16
〈210> 14
〈211〉 16
<212〉 DNA
〈213〉 artificial sequence 〈220〉
〈223〉 探針
〈400〉 14
tttttcatat gaggtg 16
〈210> 15
〈211> 19
〈212〉 DNA
〈213> artificial sequence 〈220〉
〈223〉探針
15
tggagacata tcatataag 19
〈210〉 16
〈211〉 19
〈212> 腿
artificial sequence 〈220>
<223〉 探針
〈400〉 16
21tggagacatg tcatataag 19
<210〉 17
<211〉 14
〈212〉 ■
〈213〉 artificial sequence 〈220〉
〈223〉探針
〈400〉 17
ttcggggtat gggc 14
〈210〉 18
〈211〉 14
〈212〉 腿
〈213> artificial sequence 〈220〉
〈223〉 探針
<400〉 18
ttcggggcat gggc 14
〈210〉 19
〈211〉 16
〈212〉 DNA
〈213〉 artificial sequence 〈220〉
〈223〉 探針
19
gctgccatca agtatt 16
〈210〉 20
22formula see original document page 23〈220>
〈223> 探針 〈400〉 23
gctaaccggc ttttt 15
<210〉 24
〈211> 15
〈212〉 廳
<213〉 artificial sequence 〈220〉
探針
〈400〉 24
gctaaccagc ttttt 15
〈210〉 25
〈211〉 17
〈212〉 DNA
<213〉 artificial sequence 〈220〉
探針
〈400> 25
cttttttgtc tagattt 17
〈210〉 26
17
<212〉 腿
<223〉 探針
〈400〉 26
24cttttttgtt tagattt 17
〈210> 27
〈211〉 15
<212〉 DNA
artificial sequence 〈220〉
探針
〈400〉 27
cctacaagcc tcaga 15
〈210〉 28
〈211〉 15
<212〉 DNA
〈223>探針
<400〉 28
cctacaatcc tcaga 15
〈210〉 29
<211〉 15
〈212〉 DNA
〈213> artificial sequence 〈220〉
探針
〈400〉 29
ttttgtagcc acagg 15
〈210〉 30
25 15
〈212〉 DNA
〈213〉 artificial sequence 〈220〉
〈223> 探針
〈400〉 30
ttttgtaacc acagg 15
〈210〉 31
〈211> 16
腿
<213〉 artificial sequence 〈220〉
<223〉 探針
〈400〉 31 cggcaaagac tagtat
〈210> 32
<211〉 15
腿
<213〉 artificial sequence 〈220〉
探針
< 32 cggcaaaggc tagta
<210〉 33
<211〉 15
〈212〉 DNA
〈213> artificial sequence
26<220〉
〈223> 探針
<400〉 33 tgagaatgac tgcgc
<210〉 34
〈211> 15
〈212〉 DNA
〈213> artificial sequence 〈220〉
〈223〉 探針
〈400> 34 tgagaatgat tgcgc
〈210〉 35
15
〈212〉 DNA
artificial sequence 〈220>
<223〉 探針
35 gatgtaagcc cgtgg
36
〈211〉 15
<212〉 DNA
<223〉 探針
36
15
15
15
27〈210> 37
15
〈212> 纖
artificial sequence <220〉
探針
37 tatgatgcga ctgtg
〈210〉 38
〈211〉 16
〈212〉 腿
〈213〉 artificial sequence 〈220〉
〈223〉 探針
〈400〉 38 ttatgatgtg actgtg
〈210〉 39
14
〈212> 廳
〈213〉 artificial sequence
探針
〈400〉 39 aacgcctggc agcc
〈210〉 40
15
15
16
14
28 14
<212〉 DNA
〈213> artificial sequence 〈220>
〈223〉 探針
40
aacgcctgac agcc 14
〈210〉 41
〈211〉 15
〈212〉 DNA
〈213〉 artificial sequence 〈220>
〈223〉探針
〈400〉 41
tcgcaggatt tctca 15
〈210〉 42
<211〉 15
〈212〉 腿
〈213〉 artificial sequence 〈220>
〈223〉探針
〈400> 42
tcgcagaatt tctca 15
〈210〉 43
〈211> 15
〈212〉 腿
〈213> artificial sequence<220〉
〈223〉 探針 〈400〉 43
tactacagcg atggc 15
〈210〉 44
〈211> 15
■
<213〉 artificial sequence 〈220〉
探針
〈400〉 44
tactacagtg atggc 15
〈210〉 45
〈211> 16
DNA
artificial sequence 〈220〉
〈223>探針
〈400〉 45
ggaatgatgg ttgtct 16
46
〈211〉 16
〈212> DNA
〈213〉 artificial sequence
〈223> 探針
〈400〉 46ggaatgattg ttgtct
〈210〉 47
〈211〉 16
〈212〉 DNA
〈213〉 artificial sequence 〈220〉
〈223> 探針
〈400〉 47 ggaatgatcg ttgtct
〈210〉 48
〈211〉 15
〈212> DNA
〈213> artificial sequence 〈220〉
<223〉探針
〈400〉 48 gggaatgatg gttgt
〈210> 49
〈211〉 14
<212〉 腿
<213〉 artificial sequence 〈220〉
探針
〈400〉 49 gggaatggtg gttg
〈210〉 50
16
16
15
14
31 16
DNA
artificial sequence 〈220〉
〈223〉 探針
〈400> 50
aatttattta ggggga 16
<210〉 51
<211〉 16
〈212〉 腿
〈213〉 artificial sequence 〈220〉
探針
〈400〉 51 aatttattca ggggga
〈210> 52
<211〉 17
腿
〈213〉 artificial sequence 〈220〉
〈223〉 探針
<400〉 52
tttaatttat ttagggg
53 17 〈212〉 DNA
〈213〉 artificial sequence<220〉
〈223〉 探針 〈400〉 53
tttaatttgt ttagggg 17
〈210〉 54
〈211〉 15
〈212> 腿
〈213〉 artificial sequence 〈220〉
〈223〉 探針
〈400〉 54
tgttagcggt gtggt 15
〈210〉 55
〈211〉 15
DNA
〈213〉 artificial sequence
〈223〉探針
〈400〉 55
tgttagcagt gtggt 15
〈210〉 56
〈211〉 19
〈212> DNA
artificial sequence 〈220〉
<223〉 探針
56
33formula see original document page 34 17
〈212〉 DNA
artificial sequence 〈220〉
〈223〉 探針
〈400〉 60
actcagtaga cagtccc 17
61
<211〉 17
〈212〉 DNA
<213〉 artificial sequence
<223〉 探針
〈400〉 61
actcagtaaa cagtccc
〈210〉 62
<211〉 17
DNA
〈213〉 artificial sequence <220〉
〈223> 探針
62
tagcatccgt actatac
〈210〉 63
17
〈212〉 ■
artificial sequence〈220〉 ' 〈223〉 探針 〈400〉 63
tagcatccat actatac 17
〈210〉 64
〈211> 15
〈212> DNA
〈213> artificial sequence 〈220〉
〈223〉 探針
〈400〉 64 ttccaaggac aaatc
〈210〉 65
〈211〉 15
騰
〈213> artificial sequence <220〉
探針
〈400〉 65 ttccaagggc aaatc
〈210〉 66
<211〉 21
〈212> 腿
<213〉 artificial sequence 〈220〉
〈223〉 引物
〈400〉 66
36cagccgctat taaaggttcg t 21
〈210〉 67
<211〉 21
〈212〉 DNA
artificial sequence 〈220>
〈223〉 引物
67
tggcaggagt aatc卿ggt g 21
〈210〉 68
〈211> 21
〈212〉 腿
<213〉 artificial sequence <220〉
〈223〉 引物
〈400〉 68
tcttcaatca gccacatagc c 21
〈210〉 69
〈211〉 21
〈212〉 廳
artificial sequence <220〉
引物
〈400〉 69
tctcggtaaa taaggggtcg t 21
<210〉 70〈211〉 19
〈212〉 腿
artificial sequence
〈223〉 引物
〈400〉 70
accaatccta cctccatcg 19
〈210〉 71
〈211〉 19
<212〉 DNA
〈213〉 artificial sequence 〈220〉
引物
〈400〉 71
ccaaggagtg agccgaagt
〈210〉 72
<211〉 23
〈212〉 DNA
artificial sequence 〈220〉
〈223〉 引物
〈400〉 72
tagaagaacc ctccataaac ctg
<210〉 73
〈211〉 23
〈212〉 DNA
〈213〉 artificial sequence
38〈220〉
73
tagcgtcttg tagacctact tgc 23
〈210〉 74
〈211〉 20
〈212〉 DNA
〈213〉 artificial sequence 〈220〉
〈223〉 引物
〈400> 74
acacccactc cctcttagcc 20
〈210〉 75
〈211> 22
〈212> 腿
<213〉 artificial sequence 〈220〉
<223〉 引物
〈400〉 75
gttgggacga ttagttttag ca 22
〈210〉 76
〈211〉 22
〈212〉 腿
<213〉 artificial sequence 〈220〉
〈223〉 引物
<400〉 76
39cgtccttgcc ctattactat cc 22
〈210〉 77
〈211> 20
〈212〉 DNA
〈213〉 artificial sequence
〈223〉 引物
〈400〉 77
ttgggtgcta atggtggagt 20
〈210〉 78
〈211> 22
〈212〉 畫
〈213> artificial sequence 〈220〉
〈223〉 引物
〈400〉 78
gaccctactt ctaacctccc tg 22
〈210〉 79
〈211〉 20
<212〉 DNA
〈213〉 artificial sequence
〈223〉 引物
79
cacctcaact gcctgctatg 20
〈210〉 80
40說明書第38/40頁
〈211〉 22
〈212〉 DNA
〈213〉 artificial sequence 〈220〉
〈223〉 引物
〈400〉 80
gcaccacgac cctactacta tc 22
〈210〉 81
<211〉 21
〈212〉 腿
〈213〉 artificial sequence <220〉
〈223〉 引物
〈400〉 81
gggatgatga ggctattgtt t 21
<210〉 82
〈211〉 22
DNA
artificial sequence 〈220〉
〈223〉 引物
〈400〉 82
cgaaaccaaa taattcaagc ac 22
〈210〉 83
〈211〉 22
〈212〉 畫
artificial sequence
41formula see original document page 42catcggcatt atcctcctg 19
87
〈211〉 19
DNA
<213〉 artificial sequence
引物
〈400〉 87
gttgtttgat cccgtttcg 19
權利要求
1. 一種Leber氏遺傳性視神經病變相關mtDNA突變位點集成檢測基因晶片，其特徵在於，在基因晶片載體表面點陣固定有與Leber氏遺傳性視神經病變相關的mtDNA突變位點的特異性寡核苷酸探針和mtDNA 11719G>A單核苷酸多態性位點的特異性寡核苷酸探針。
2. 如權利要求1所述Leber氏遺傳性視神經病變相關mtDNA突變位點集成檢測基因晶片， 其特徵在於，所述與Leber氏遺傳性視神經病變相關的mtDNA突變位點的特異性寡核苷 酸探針和mtDNA 11719G〉A單核苷酸多態性位點的特異性寡核苷酸探針選自序列為SEQ ID NO. 1 65的寡核苷酸探針中的一個或多個，且所述基因晶片上還固定有陰性對照及 陽性對照，其中，陽性對照為所選的各寡核苷酸探針的等量混合液。
3. 如權利要求1所述Leber氏遺傳性視神經病變相關mtDNA突變位點集成檢測基因晶片， 其特徵在於，所述基因晶片載體表面點陣固定有序列為SEQ ID NO. 1 65的寡核苷酸 探針。
4. 如權利要求1-3中任一權利要求所述Leber氏遺傳性視神經病變相關mtDNA突變位點集 成檢測基因晶片，其特徵在於，所述寡核苷酸探針的5'端有氨基修飾基團，且探針5' 端有一段15聚的Poly T。
5. 如權利要求1-4中任一權利要求所述Leber氏遺傳性視神經病變相關mtDNA突變位點集 成檢測基因晶片的製備方法，包括下列步驟將選自序列為SEQ ID NO. 1 65的寡核苷酸探針5，端加上一段15聚的Poly T，並對 5'端進行氨基修飾，用去離子水將各探針分別稀釋，並分別與點樣液等體積混合，獲 得終濃度為12. 5 50 uM的寡核苷酸探針溶液，將寡核苷酸探針溶液與陰性對照和陽性 對照一起點陣於載玻片表面並固定。
6. 如權利要求1-4中任一權利要求所述Leber氏遺傳性視神經病變相關mtDNA突變位點集 成檢測基因晶片的使用方法，包括下列步驟a) 收集患者外周血，抽取樣本DNA;b) 樣本DNA的PCR擴增和標記以樣本DNA為模板，PCR擴增並標記待測的突變相關 序列；c) 採用如權利要求1-4中任一權利要求所述Leber氏遺傳性視神經病變相關mtDNA突 變位點集成檢測基因晶片於樣本PCR產物變性後進行雜交檢測將樣本PCR擴增產 物等體積混合後，與適量體積雜交液混合，將與雜交液混勻後的PCR產物變性，滴 在晶片的點陣區進行雜交，雜交後用洗液洗滌，再檢測標記信號的強度。
7. 如權利要求6所述Leber氏遺傳性視神經病變相關mtDNA突變位點集成檢測基因晶片的 使用方法，其特徵在於，所述步驟b中PCR擴增引物選自序列為SEQ ID NO. 66 87的 核苷酸序列中的一個或多個，且每對正反引物中至少有一個被標記。
8. 如權利要求7所述Leber氏遺傳性視神經病變相關mtDNA突變位點集成檢測基因晶片的 使用方法，其特徵在於，所述步驟b的PCR擴增為多重PCR擴增將序列為IDN0.66 71、 ID N0.72 79、 ID NO. 80 87的核苷酸序列分別作為三組多重PCR的引物，在同 一熱循環下以樣本DNA為模板進行PCR擴增。
9. 如權利要求1-4中任一權利要求所述Leber氏遺傳性視神經病變相關mtDNA突變位點集 成檢測基因晶片在製備Leber氏遺傳性視神經病變相關mtDNA突變位點的檢測試劑盒中 的應用。
10. —種Leber氏遺傳性視神經病變相關mtDNA突變位點的檢測試劑盒，包括權利要求1_4 中任一權利要求所述Leber氏遺傳性視神經病變相關mtDNA突變位點集成檢測基因芯 片，和Leber氏遺傳性視神經病變相關mtDNA突變位點的PCR擴增引物。
全文摘要
本發明涉及基因晶片，公開了一種Leber氏遺傳性視神經病變相關mtDNA突變位點集成檢測基因晶片及其製備與應用，該基因晶片的載體表面點陣固定有與Leber氏遺傳性視神經病變相關的mtDNA突變位點的特異性寡核苷酸探針和mtDNA 11719G＞A單核苷酸多態性位點的特異性寡核苷酸探針。本發明的基因晶片具有省時、費用低廉和操作簡便等優點，僅需1次PCR擴增和1次雜交反應，即可特異性檢測臨床樣本中32種與Leber氏遺傳性視神經病變相關的突變位點。適用於Leber氏遺傳性視神經病變的基因診斷。
文檔編號C12Q1/68GK101497925SQ20081020477
公開日2009年8月5日 申請日期2008年12月17日 優先權日2008年12月17日
發明者張學軍, 曹慧敏, 杜衛東, 趙建龍, 金慶輝, 剛 陳 申請人:安徽醫科大學;中國科學院上海微系統與信息技術研究所