一種利用固定化酵母細胞與滲透蒸發膜耦合連續發酵葡萄糖木糖的方法
2023-06-12 09:32:11 2
專利名稱：一種利用固定化酵母細胞與滲透蒸發膜耦合連續發酵葡萄糖木糖的方法
技術領域：
本發明屬於微生物發酵領域，特別涉及海藻酸鈣膠珠固定化酵母細胞與 滲透蒸發膜耦合連續發酵木糖和葡萄糖的方法。
技術背景20世紀以來，作為主要能源之一的石油為人類的發展做出了巨大貢獻， 但是石油資源已經面臨枯竭，酒精則成為最具潛力的替代品(Su T M et al, AIChE Symposium Series, 1978, 74(181): 75-78; Wyman C E et al, Proceedings of the Intersociety Energy Conversion Engineering Conferenc, 1994, 3: 1090-1095.)，因而利用植物纖維發酵生產酒精的研究，具有十分重要的意 義。植物纖維原料包括纖維素、半纖維素和木質素，其水解液主要是葡萄糖、 木糖、阿拉伯糖等多種單糖和寡糖的混合物，是地球上最豐富的生物可再生 資源，利用其作為廉價的糖源發酵生產燃料乙醇是解決世界能源危機的最有 效途徑(Lin Y et al, Applied microbiology and biotechnology, 2006, 69(6): 627-642; Janusz S et al， Biomass and Bioenergy， 1996， 10(5-6): 367-375.)。在傳統的發酵工藝中，主要採用間歇式發酵，這種方法乙醇轉化率和生 產能力都比較低，滿足不了工業生產的要求(Gray K A et al， Current option in chemical biology, 2006, 10(2): 141-146.)。這主要是因為細胞處於游離狀態 導致細胞數量低，而且細胞不能循環利用；發酵法生產燃料乙醇是一個產品 抑制過程，隨著發酵液中乙醇產物濃度的上升，酵母細胞的生長會受到抑制。 一般來說，當酒精濃度達到90g七"以上時，酵母細胞就會完全停止生長，發酵會處於停滯狀態(伍勇，四川大學博士論文,2004.)。為了克服上述缺陷， 必須使乙醇發酵連續化，其中首要問題就是要提高細胞濃度並不斷把產物乙 醇分離出去。通過固定細胞，既可以達到提高細胞濃度的目的，還能夠便於細胞的重 複利用。目前關於細胞的固定方式主要有表面吸附、包埋、微膠囊和細胞自身固定等(VerbelenP J et al, Biotechnol Letters, 2006， 28(19): 1515—1525.)。 Bekers等人(Bekers M et al, Process Biochemistry, 2000, 35(5): 523—530.)把酵 母細胞固定於表面經過氨處理過的鐵絲球上進行發酵，裝置的生產能力達到 0.92 1.25g丄"七—'，並且鐵絲球可以在間歇發酵中重複使用；Plessas等人 (Plessas S, Bioresource Technology, 2007, 98(4): 860—865.)把酵母固定於橘子 皮上，裝置生產能力達至IJl50.6g七"-d"; Najafpour等人(Najafpour G， Bioresource Technology, 2004， 92(3): 251-260.)利用海藻酸f丐固定普通釀酒酵母連續發酵葡萄糖制乙醇，生產能力達到2.8g七十h";鄧旭等人(鄧旭等，食品與發酵工業，1995， 6.)也使用海藻酸鈣固定普通釀酒酵母和畢赤氏酵 母連續發酵木糖、葡萄糖混合液，生產能力為6.47g七—'七—、Talebnia等人 (Talebnia F, Biotechnology and bioengineering, 2005, 90(3): 345-353.)用海藻 酸鈣製得微膠囊將普通釀酒酵母包裹其中間歇發酵乙醇，生產能力為5.15 g丄十h"; Peinado等人(Peinado R A et al， Biotechnology Letters, 2005, 27(18): 1421-1424.)利用青黴菌製成微膠囊固定普通釀酒細胞間歇發酵葡萄汁，生產 能力是游離發酵的2倍；徐鐵軍等人(Xu T J et al, Enzyme and Microbial Technology, 2005, 37(6): 634-640.)使用自絮凝酵母連續發酵葡萄糖，生產能 力為3.44g七—'七—、前人的這些固定方法雖然能提高酵母濃度，但是提高的程 度都不大。這主要是因為產物乙醇的抑制作用。國內外學者已經提出了許多 與發酵耦合的乙醇原位分離技術，包括真空蒸餾、溶劑萃取、膜蒸餾、膜過濾、膜滲透蒸發和C02氣提等方法(Zhangwen Wu et al， Applied Biochemistry and Biotechnonogy, 1998(70-72): 479-492;楊斌等，生物工程學報，1997， 13(4): 380 384; Ho N W V et al， Applied and Environmental Microbiology, 1998, 64(5): 1852 1859.)，以實現乙醇的發酵分離一體化。與其它技術相比， 使用滲透蒸發膜進行乙醇連續發酵具有過程及設備簡單、能耗小、能通過分 級冷凝直接得到指定濃度產品等優點。Shabtai、張衛等人(Shabtai Y et al, Biotechnology and Bioengineering, 1991, 38(8): 869-876;張衛等，膜科學與 技術，1997, 17(3).)將矽橡膠/聚碸複合管式膜應用於乙醇分離，存在膜分離 性能下降的現象，並分析這是由於死亡細胞等造成膜汙染和濃差極化所致； 鍾月華等人(鍾月華，膜科學與技術，2005, 25(5).)將矽橡膠膜應用於連續發 酵，雖然達到了分離乙醇減少抑制的目的，但是80小時後由於游離酵母細胞 的存在使得膜汙染現象非常嚴重。 發明內容本發明要解決的技術問題是提供一種利用固定化酵母細胞與滲透蒸發 膜耦合連續發酵葡萄糖木糖的方法。 本發明的技術方案包括以下步驟1. 普通釀酒酵母和嗜鞣管囊酵母細胞的活化培養用兩個三角瓶分別 配置200ml細胞活化培養基，其中含葡萄糖50g七—i, (NH4)2S04 2g七—", KH2P04 2g，L—1，酵母粉5g丄—\蛋白腖5g丄—1。 115t:下滅菌25min，冷卻至 室溫。在無菌操作臺上將保存於斜面培養基上的兩種酵母細胞分別刮下少 許，放入各自的活化培養基中，3CTC、 150轉/分條件下搖床培養48小時；2. 海藻酸鈣膠珠包埋酵母細胞將濃度為40g七"的海藻酸鈉溶液 400mL平均分為兩份，分別與活化後的普通釀酒酵母和嗜鞣管囊酵母細胞 混合均勻，通過蠕動泵以7.6mLmin—1的速率分別滴入濃度為60g七—1的CaCl2溶液中，以150~200轉/分不斷攪拌，固化20分鐘，製得直徑為4 6mm的 分別包埋普通釀酒酵母和嗜鞣管囊酵母的固定化膠珠；3. 配置細胞增殖培養基及發酵培養基細胞增殖培養基包含葡萄糖50g.L",酵母膏2g.L.'， KH2P04 2g'L.1, MgS04 0.2g七"，CaCl2 0.2g'L", (NH4)2S042g丄—1;發酵培養基包含葡萄糖50g七—1 ，木糖25g七—1 ，酵母膏2g七'1 ， KH2P04 2g七-',MgS04 0.2g七—'，CaCl20.2g'L-1, (NH4)2S042g.L"。 115。C下滅菌 25min，冷卻至室溫，待用；4. 發酵罐內酵母細胞的擴增用洗滌劑及軟刷清洗髮酵罐、緩衝罐、 矽膠管、鐵管、膠塞等，超純水衝洗三遍並用牛皮紙包好，121。C下滅菌 25min，烘乾。把兩個發酵罐固定於實驗架上，將包埋酵母細胞的膠珠分別 裝入兩個發酵罐中，使每個罐中膠珠總體積佔整個發酵罐體積的70~80%， 超純水衝洗掉膠珠表面殘留的CaCl2。串聯兩個發酵罐，35T:下循環發酵罐 中的細胞增殖培養基，使酵母細胞適應新環境並增殖，直至葡萄糖濃度降至lg七-'以下；5. 與滲透蒸發膜耦合，連續發酵葡萄糖木糖混合液把細胞增殖培養 基換為發酵培養基，分別於兩個串連的發酵罐之間及後-一個發酵罐與回收罐之間聯入滲透蒸發膜組件，進行循環發酵；6. 分離乙醇32小時後，循環發酵過程進入穩定狀態，啟動真空泵， 進行滲透蒸發分離乙醇，分離出的乙醇蒸汽用冷阱冷凝收集於產品罐中。本發明的效果和益處是(1) 將酵母細胞固定後提高了發酵細胞的濃度，增加了發酵速度；(2) 用滲透蒸發膜分離乙醇有效降低了乙醇對細胞發酵的抑制作用， 改善了固定化細胞的生長環境，從而提高了細胞活性並進一步增加了固定化 細胞的濃度；(3) 海藻酸鈣膠珠固定酵母細胞與滲透蒸發膜相耦合，明顯降低了膜 分離乙醇過程的膜汙染與阻力；(4) 以發酵植物秸稈而不是糧食為應用背景，既節省資源又減少因焚燒秸稈而造成的環境汙染。
圖1是本發明所述的一種利用固定化酵母細胞與滲透蒸發膜耦合連續 發酵葡萄糖木糖的方法操作流程圖。圖2是本發明所述的一種利用固定化酵母細胞與滲透蒸發膜耦合連續 發酵葡萄糖木糖的方法裝置流程圖。圖3是本發明所述的一種利用固定化酵母細胞與滲透蒸發膜耦合連續 發酵葡萄糖木糖的方法所用膜組件的正視圖(圖3 (A))和側視圖(圖3 (B))。圖4是本發明所述的一種利用固定化酵母細胞與滲透蒸發膜耦合連續 發酵葡萄糖木糖的方法製備海藻酸鈣膠珠(直徑為4 6mm)流程示意圖。圖5是本發明所述的一種利用固定化酵母細胞與滲透蒸發膜耦合連續 發酵葡萄糖木糖的方法製備的海藻酸鈣膠珠(直徑為4 6mm)內部孔道的顯 微照片。圖6是本發明所述的一種利用固定化酵母細胞與滲透蒸發膜耦合連續 發酵葡萄糖木糖的方法海藻酸鈣膠珠(直徑為4 6mm)包埋普通釀酒酵母細 胞的顯微照片(80hr)。圖7是本發明所述的一種利用固定化酵母細胞與滲透蒸發膜耦合連續 發酵葡萄糖木糖的方法海藻酸鈣膠珠(直徑為4 6mm)包埋嗜鞣管囊酵母細 胞的顯微照片(80hr)。圖中1發酵液儲藏罐；2蠕動泵；3緩衝罐；4發酵罐；5滲透蒸發膜 組件；6回收罐；7空氣泵；8膜過濾器；9氣體轉子流量計；10產品罐；ll真空泵；12膜組件俯視圖；13膜組件側視圖；14酵母-海藻酸鈉混合液；15磁力攪拌子；16CaCV溶液；17包埋酵母細胞的海藻酸鈣膠珠。
具體實施方式
以下結合技術方案和附圖詳細敘述本發明的具體實施例。實施例1:本實施例為用海藻酸鈣包埋普通釀酒酵母和嗜鞣管囊酵母細胞。分別用兩個三角瓶各配置200ml細胞活化培養基，其中含葡萄糖50g丄-', (NH^SO^g'lAKHsPOJg.L-1,酵母粉5g'L",蛋白腖5g丄—1。 115。C下滅菌 25min，冷卻至室溫，待用。在無菌操作臺上將保存於斜面培養基上的兩種 酵母細胞分別刮下少許，放入各自的活化培養基中，30°C、 150轉/分條件 下搖床活化培養48小時。配置200ml， 60g七—'的CaCl2溶液兩瓶；400ml， 40g七—1的海藻酸鈉溶 液-一瓶。12rC下滅菌25min，冷卻至室溫，待用。將海藻酸鈉溶液平分為 兩份，分別與活化後的普通釀酒酵母和嗜鞣管囊酵母細胞混合均勻，製得海 藻酸鈉-酵母細胞混合液，通過蠕動泵以7.6mhmin—1的速率滴入60g七—1的 CaCl2溶液中，CaCV溶液通過磁力攪拌器以150 200轉/分不斷攪拌，固化 20分鐘後，製得直徑為4 6mm的分別包埋普通釀酒酵母和嗜鞣管囊酵母細 胞的固定化膠珠。實驗結果兩種酵母細胞活化培養48hr後，細胞濃度明顯增加；包埋 細胞的海藻酸鈣固定化膠珠體積均勻，機械強度好。此實施例說明該活化方法適合普通釀酒酵母和嗜鞣管囊酵母細胞的 培養與增殖；製備固定化膠珠的方法可靠，製得的膠珠適於發酵罐內使用。實施例2:本實施例為發酵罐內酵母細胞的增殖培養。細胞增殖培養基包含葡萄糖50g七-\酵母膏2g七"，KH2P04 2g七"， MgS04 0.2g'L—'， CaCl2 0.2g'L—', (NH4)2S04 2g七"；發酵培養基包含葡萄糖 50g-L-'，木糖25g'I/1，酵母膏2g'L—、 KH2P04 2gL1, MgS04 0.2g.L1, CaCl2 0.2g'L"，(NH4)2SO42g'L"。 115。C下滅菌25min，冷卻至室溫，待用。用清洗劑及軟刷清洗髮酵罐、緩衝罐、矽膠管、鐵管、膠塞等，超純水 衝洗三遍並用牛皮紙包好，12rC下滅菌25min，烘乾；把兩個發酵罐固定 於實驗架上，將包埋酵母細胞的膠珠分別裝入兩個發酵罐中，使每個罐中膠 珠總體積佔整個發酵罐體積的70 80%，超純水衝洗掉膠珠表面殘留的 CaCl2。將兩個發酵罐串聯，35"C下使細胞增殖培養基在串聯的兩個發酵罐 中循環，直至細胞增殖培養基中葡萄糖濃度降到lg七—1以下。實驗結果細胞增殖培養基在串聯的兩個發酵罐中循環約48小時後， 培養基中葡萄糖濃度可降至lg丄"以下，此時普通釀酒酵母和嗜鞣管囊酵母 細胞濃度可達10、ells'ger1以上。此實施例說明通過細胞增殖培養基在串聯的兩個發酵罐中循環，能夠增加膠珠內細胞濃度，為下一步實驗提供了條件。實施例3:本實施例為耦合滲透蒸發膜，連續發酵葡萄糖木糖混合液，分離乙醇。配置發酵培養基，包含葡萄糖50g.L-i，木糖25g丄-)，酵母膏2g.L-1， KH2P04 2g'L人MgS04 0.2g丄"，CaCl2 0.2g'i;1， (NH4)2S04 2g-L" 。 115。C下滅 菌25min，冷卻至室溫，待用。以細胞發酵培養基替換增殖培養基,分別於兩個串連的發酵罐之間及後 一個發酵罐與回收罐之間聯入滲透蒸發膜組件，35。C下進行循環發酵。發酵 32小時後，整個裝置進入穩定狀態，啟動真空泵進行滲透蒸發分離乙醇， 分離出的乙醇蒸汽用冷阱冷凝收集於產品罐中。實驗結果連續發酵370小時後，與膜耦合的發酵裝置剩餘葡萄糖0.134g丄-'，剩餘木糖4.921g'U1，乙醇濃度為12.256g.L-1，轉化率達0.457h—1 ， 乙醇生產能力為10.996g.L".h"，普通釀酒酵母細胞濃度為 8.35xl08cells'mL—\嗜鞣管囊酵母細胞濃度為5.31xl08cells'mL"。通過與無 膜耦合的發酵裝置發酵結果(剩餘葡萄糖0.129g丄—1，乘lj餘木糖9.662g七—1， 乙醇濃度為29.313g丄—1，轉化率達0.391h—1，乙醇生產能力為9.404g.L十h—1， 普通釀酒酵母細胞濃度為7.49xl0Scells'mL—1，嗜鞣管囊酵母細胞濃度為 3.50xlOScdls'mL—1)相比較，剩餘葡萄糖的濃度基本處於一個水平；有膜情 況剩餘木糖的濃度僅為無膜情況下的約50%;有膜裝置相對無膜裝置流出 液中乙醇濃度有很大程度的降低；如果將滲透蒸發出的乙醇量折算在流出液 中，所算得的轉化率和生產能力與無膜情況下相比都有較大程度的提高；普 通通釀酒酵母細胞濃度提高得不大；嗜鞣管囊酵母細胞濃度提高了兩倍以 上。此實施例說明發酵裝置通過滲透蒸發作用，能夠分離出乙醇原液，明 顯降低其對嗜鞣管囊酵母細胞的抑制作用，這使嗜鞣管囊酵母細胞濃度提 高，進而提高了乙醇的產量；而由於葡萄糖主要由裝於發酵罐1中的普通釀 酒酵母細胞發酵，其發酵環境基本不受滲透蒸發膜的影響，故剩餘葡萄糖濃 度和普通釀酒酵母細胞濃度，在與有膜耦合和無膜耦合兩種發酵狀態下基本 不變。
權利要求
1.一種利用固定化酵母細胞與滲透蒸發膜耦合連續發酵葡萄糖木糖的方法，其特徵在於以下步驟(1)普通釀酒酵母和嗜鞣管囊酵母細胞的活化培養配置兩瓶200mL細胞活化培養基，其中含葡萄糖50g·L-1，(NH4)2SO4 2g·L-1，KH2PO4 2g·L-1，酵母粉5g·L-1，蛋白腖5g·L-1；115℃下滅菌25min，冷卻至室溫；在無菌操作臺上將保存於斜面培養基上的兩種酵母細胞放入各自的活化培養基中，在30℃，150轉/分條件下搖床培養48小時；(2)海藻酸鈣膠珠包埋酵母細胞將濃度為40g·L-1的海藻酸鈉溶液400mL平均分為兩份，分別與活化後的普通釀酒酵母和嗜鞣管囊酵母細胞混合均勻，通過蠕動泵以7.6mL·min-1的速率分別滴入濃度為60g·L-1的CaCl2溶液中，以150～200轉/分不斷攪拌，固化20分鐘，製得直徑為4～6mm的分別包埋普通釀酒酵母和嗜鞣管囊酵母的固定化膠珠；(3)配置細胞增殖培養基及發酵培養基細胞增殖培養基包含葡萄糖50g·L-1，酵母膏2g·L-1，KH2PO4 2g·L-1，MgSO4 0.2g·L-1，CaCl2 0.2g·L-1，(NH4)2SO4 2g·L-1；發酵培養基包含葡萄糖50g·L-1，木糖25g·L-1，酵母膏2g·L-1，KH2PO4 2g·L-1，MgSO4 0.2g·L-1，CaCl2 0.2g·L-1，(NH4)2SO4 2g·L-1；115℃下滅菌25min，冷卻至室溫，待用；(4)發酵罐內酵母細胞的擴增用洗滌劑及軟刷清洗髮酵罐、緩衝罐、矽膠管、鐵管、膠塞等，超純水衝洗三遍並用牛皮紙包好，121℃下滅菌25min，烘乾；把兩個發酵罐固定於實驗架上，將包埋酵母細胞的膠珠分別裝入兩個發酵罐中，使每個罐中膠珠總體積佔整個發酵罐體積的70～80％，超純水衝洗掉膠珠表面殘留的CaCl2；串聯兩個發酵罐，35℃下循環發酵罐中的細胞增殖培養基，使酵母細胞適應新環境並增殖，直至葡萄糖濃度降至1g·L-1以下；(5)與滲透蒸發膜耦合，連續發酵葡萄糖木糖混合液把細胞增殖培養基換為發酵培養基，分別於兩個串連的發酵罐之間及後一個發酵罐與回收罐之間聯入滲透蒸發膜組件，進行循環發酵；(6)分離乙醇32小時後，循環發酵過程進入穩定狀態，啟動真空泵，進行滲透蒸發分離乙醇，分離出的乙醇蒸汽用冷阱冷凝收集於產品罐中。
全文摘要
一種利用固定化酵母細胞與滲透蒸發膜耦合連續發酵葡萄糖木糖的方法，屬於微生物發酵工程領域，特別涉及一種連續發酵葡萄糖木糖生產乙醇的方法。其特徵是利用海藻酸鈣膠珠把普通釀酒酵母細胞和嗜鞣管囊酵母細胞固定後，分別接種於兩個串聯的發酵罐內，並與矽橡膠滲透蒸發膜耦合連續發酵葡萄糖木糖混合液。本發明的效果和益處是，通過海藻酸鈣膠珠固定酵母細胞不但使細胞濃度增高，而且減少了由於細胞的粘附所造成的滲透蒸發膜的汙染及阻力；通過滲透蒸發作用減少了產物乙醇對酵母細胞的抑制作用；能夠同時發酵葡萄糖和木糖；取材於植物秸稈，不採用糧食，既節省資源又減少因焚燒秸稈而造成的環境汙染。
文檔編號C12R1/85GK101255446SQ20071015908
公開日2008年9月3日 申請日期2007年12月18日 優先權日2007年12月18日
發明者劉天慶, 姜秀美, 孫相彧, 李香琴, 隋東宇 申請人:大連理工大學