鄰菲羅啉-硫酸鋅紫外光譜法測定那曲肝素鈣的溶液濃度的製作方法

2023-06-02 04:07:06 1

專利名稱：鄰菲羅啉-硫酸鋅紫外光譜法測定那曲肝素鈣的溶液濃度的製作方法
技術領域：
本發明屬於那曲肝素鈣藥物的生產領域，特別是涉及一種應用鄰菲羅啉-硫酸鋅紫外光譜法快速定量測定那曲肝素鈣溶液濃度的方法。
背景技術：
肝素(Heparin)是由D-葡糖胺、L-艾杜糖醛酸、N-乙醯葡糖胺及葡糖醛酸交替組成的粘多糖硫酸酯，分子量從5至30kDa，其中硫酸根約佔40%。通常，肝素類藥物最初來源於豬、牛腸黏膜和肺臟。在當今醫學上，肝素主要作為抗凝血劑，於1953年正式應用於臨床治療，被認為是最有效和臨床用量最大的抗凝血藥物。最初使用的是普通肝素，即Unfractionated Heparin。到了上世紀末，通過化學裂解或者生物酶解等方法,將普通肝素製備成了平均分子量分布為3500飛500的肝素衍生物，即低分子肝素(Low MolecularWeight Heparin)，其藥效明顯得到了增強，成為被廣泛應用的新型肝素類藥物。據統計，目前全球約有三分之一的肝素原料藥用於製成標準肝素鈉製劑，其餘約三分之二作為原料用於生產低分子肝素鈣(低分子肝素鈉)原料藥。進一步的數據表明，在2008年，全球肝素原料藥銷售額約為8億美元，同時全球肝素類藥物銷售額則接近60億美元；預計2012年，全球肝素類藥物的銷售額將超過90億美元。低分子肝素類藥物的通用生產流程圖如圖1所
/Jn ο其中，那曲肝素I丐(Nadroparin Calcium)是採用亞硝酸裂解法製備得到的低分子肝素藥物，其主要特徵包括:平均分子量範圍為3600-5000Da;分子結構的還原末端為6-0-硫酸-2，5-脫水-D-甘露醇，非還原末端為2-0-硫酸-a -L-艾杜糖醛酸；抗Xa效價為95 130IU/mg，AXa/A II a數值為2.5 4.0。本公司生產的那曲肝素鈣藥物達到相應的質量指標，其簡單的生產工藝流程如圖2所示。在實際生產過程中，需要進行超濾、醇沉和乾燥等工藝，我們發現了在超濾工藝以後得到的那曲肝素鈣溶液，需要進行迅速的準確的濃度檢測，並依據所得測試結果對其進行適當的濃度調控，這樣十分有利於後續工藝的控制，尤其是醇沉工藝。但是在實際的生產過程中，超濾工藝以後得到的那曲肝素鈣溶液很難藉助溶液稱重法或者高效液相色譜法等分析方法，快速地完成這個檢測任務。另一方面，目前國內外肝素類藥物的最初來源主要都是豬小腸黏膜等動物原料，存在地域性差異，在氮含量、硫含量以及糖基序列等方面具有較大的變化範圍。同時，那曲肝素鈣藥物其實也只是一個規定了分子量範圍、並具有其它主要性質的高分子混合物，因此針對那曲肝素鈣的檢測方法必需具備較強的抗幹擾能力，否則在實際樣品的檢測過程中，會產生較大的分析誤差，所得測試結果將不能應用於工藝中控和指導後續工藝。

發明內容
本發明的目的在於針對現有那曲肝素鈣實際生產中的上述不足，提供一種鄰菲羅啉-硫酸鋅紫外光譜法測定那曲肝素鈣的溶液濃度。為了達到上述目的，本發明採用了如下技術方案:
鄰菲羅啉-硫酸鋅紫外光譜法測定那曲肝素鈣的溶液濃度，在緩衝溶液的環境下，通過測定Zn2+離子、鄰菲羅啉和那曲肝素鈣三者混合溶液的紫外吸光度來定量測定那曲肝素鈣的濃度。具體地，在緩衝溶液的環境下，將Zn2+離子溶液、鄰菲羅啉溶液和那曲肝素鈣溶液混合，混合溶液中Zn2+離子的濃度範圍在0.05、.3mM,鄰菲羅啉的物質的量是Zn2+離子的物質的量的2倍以上，測定混合溶液的紫外吸光度；建立標準工作曲線時，加入混合溶液的為已知濃度的那曲肝素鈣溶液，那曲肝素隹丐的質量相對於Zn2+離子的物質的量為11.84g/mmol 163.3g/mmol ；建立標準工作曲線後，加入混合溶液的為未知濃度的那曲肝素鈣溶液，根據測定的吸光度及建立的標準工作曲線計算得出那曲肝素鈣溶液的濃度，當加入的那曲肝素鈣的質量相對於Zn2+離子的物質的量不在11.84g/mmol 163.3g/mmol的範圍時,在不改變加入體積的情況下通過濃縮或稀釋的方法改變加入混合溶液中那曲肝素鈣溶液的濃度，測定其吸光度並利用標準工作曲線計算得出那曲肝素鈣溶液的濃度，使那曲肝素鈣的質量相對於Zn2+離子的物質的量在11.84g/mmol 163.3g/mmol的範圍； 需要指出的是，那曲肝素鈣的濃度是指那曲肝素鈣的質量體積百分比。具體地，混合溶液的溶劑是水、乙醇、甲醇、異丙醇、正丙醇和正丁醇中的至少一種。具體地，緩衝溶液包括乙酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉和硫酸氫鈉中的至少一種物質的水溶液。優選地，緩衝溶液為乙酸鈉溶液，乙酸鈉在混合溶液中的濃度為0.05、.6M。優選地，乙酸鈉在混合溶液中的濃度為0.3M。具體地，Zn2+離子來自硫酸鋅，Zn2+離子的濃度為0.2mM。優選地，鄰菲羅啉的物質的量是Zn2+離子的物質的量的4倍。優選地，測定混合溶液的吸光度時紫外波長為302± lnm。優選地，配製混合溶液時，硫酸鋅水溶液為1.0mL,2.0mM,鄰菲羅啉的乙醇溶液為1.0mL,8.0mM,乙酸鈉水溶液為3.0mL, 1.0M,充分混合後，加入2.0mL那曲肝素鈣溶液和
3.0mL注射用水，充分混合併靜置後，測定混合溶液在302 ± Inm的吸光度。本發明公開了鄰菲羅啉-硫酸鋅紫外光譜法測定那曲肝素鈣的溶液濃度，該測定方法應用鄰菲羅啉-硫酸鋅紫外光譜測試體系，實現了對那曲肝素鈣溶液濃度的快速定量檢測，其分析方法的線性範圍為1.184% 16.33% ;同時，該方法對鈣離子、鈉離子和硫酸根離子有很好的抗幹擾能力，可以應用於那曲肝素鈣藥物的實際生產過程中，對中間產品溶液或者成品溶液進行濃度檢測。


圖1為低分子肝素類藥物通用生產流程圖；圖2為那曲肝素鈣藥物的生產工藝流程圖；圖3為不同批次那曲肝素鈣樣品在鄰菲羅啉-硫酸鋅溶液中的紫外光譜檢測圖；圖4為不同濃度鈣離子對檢測溶液的影響檢測圖；圖5為不同乙酸鈉溶液用量對檢測溶液的影響檢測圖6為不同鄰菲羅啉溶液用量對檢測溶液的影響檢測圖；圖7為不同亞硝酸鈉溶液用量對檢測溶液的影響檢測圖；圖8為不同濃度那曲肝素鈣樣品在鄰菲羅啉-硫酸鋅溶液中的檢測圖。
具體實施例方式下面將結合具體實施例對本發明的技術方案作進一步清楚、完整地說明。首先需要說明的是，本發明中生產工藝源頭所用的肝素鈉樣品來自河北常山生化藥業股份有限公司；那曲肝素鈣樣品，來自深圳賽保爾生物藥業有限公司。同時，本發明中所使用的主要化學試劑包括:無水乙酸鈉(CH3COONa,分析純，CAS127-09-3);鄰菲羅啉(C12H8N2.H2O,分析純，CAS5144-89-8使用時，配製成乙醇溶液)；七水硫酸鋅(ZnSO4.7H20，分析純，CAS7446-20-0);氯化鈣(CaCl2，藥用級，CAS10043-52-4)。實施例中那曲肝素鈣溶液的濃度是指那曲肝素鈣的質量體積百分比。實施例實施例公開了鄰菲羅啉-硫酸鋅紫外光譜法測定那曲肝素鈣的溶液濃度，首先通過實驗一至實驗五依次檢驗鄰菲羅啉-硫酸鋅體系的適用性、對鈣離子的抗幹擾性、乙酸鈉溶液用量的影響、鄰菲羅啉用量的影響和亞硝酸鈉溶液用量的影響，以說明該檢測體系的適用性、可變化範圍及檢測原理；而後通過實驗六建立吸光度與那曲肝素鈣溶液濃度的標準工作曲線，實驗七通過實驗驗證該方法及該標準工作曲線的可靠性。實驗一、鄰菲羅啉-硫酸鋅體系的適用性取6支15mL離心管，其中5支為樣品測試體系，I支為空白對照體系(不加那曲肝素鈣樣品)。首先，往所有離心管中，分別加入1.0mL2.0mM硫酸鋅溶液、1.0mL8.0mM鄰菲羅啉溶液和3.0mLl.0M乙酸鈉溶液，充分混合。接著,往樣品測試體系中，分別加入2.0mL不同批號的那曲肝素鈣樣品溶液，以及3.0mL注射用水，搖勻；往空白對照體系中，加入5.0mL注射用水，充分混合。靜置15分鐘後，以空白對照體系作為空白對照溶液，在20(T400nm範圍內，分別掃描5個樣品測試體系的紫外光譜。所得測試結果如圖3所示。從圖3可以發現，在鄰菲羅啉-硫酸鋅體系中，5個不同批次的那曲肝素鈣樣品溶液，在302± Inm處都具有明顯的最大紫外吸收峰。這表明，鄰菲羅啉-硫酸鋅體系對於不同批次那曲肝素鈣樣品溶液的紫外光譜檢測，有很好的系統適用性。實驗二、鄰菲羅啉-硫酸鋅體系對鈣離子的抗幹擾性取7支15mL離心管，其中6支為樣品測試體系，I支為空白對照體系(不加那曲肝素鈣樣品)。首先，往所有離心管中，分別加入1.0mL2.0mM硫酸鋅溶液、1.0mL8.0mM鄰菲羅啉溶液和3.0mLl.0M乙酸鈉溶液，充分混合.接著,往6支樣品測試體系中，全部加入
2.00mL10%那曲肝素鈣樣品溶液，搖勻。然後，往6支樣品測試體系中，分別加入0.00,0.05、0.10,0.15,0.20,0.25mL 的 5.0M 氯化鈣溶液，以及 3.00,2.95,2.90,2.85,2.80,2.75mL 的注射用水；往空白對照體系中，加入5.0mL注射用水，充分混合。靜置15分鐘後，以空白對照體系作為空白對照溶液，在20(T400nm範圍內，分別掃描6個樣品測試體系的紫外光譜。所得測試結果如圖4所示。從圖4可以發現，濃度範圍為2.5%-12.5%的外加鈣離子，對鄰菲羅啉-硫酸鋅紫外光譜體系的測試結果沒有明顯的影響。這表明，鄰菲羅啉-硫酸鋅紫外光譜體系，對那曲肝素鈣樣品測試溶液中的鈣離子濃度有很強的抗幹擾作用。實驗三、乙酸鈉溶液用量對鄰菲羅啉-硫酸鋅紫外光譜測試體系的影響取7支15mL離心管，其中6支為樣品測試體系，I支為空白對照體系(不加那曲肝素鈣樣品)。首先，往所有離心管中，分別加入1.0mL2.0mM硫酸鋅溶液和1.0mL8.0mM鄰菲羅啉溶液，充分混合。接著，往6支樣品測試體系中，全部加入2.00mL10%那曲肝素鈣樣品溶液，搖勻。然後，往6支樣品測試體系中，分別加入1.0、1.5,2.0,3.0,3.5,4.0mL的1.0M乙酸鈉溶液，以及5.0,4.5,4.0,3.0,2.5,2.0mL的注射用水；往空白對照體系中，加入3.0mL乙酸鈉溶液和5.0mL注射用水，充分混合。靜置15分鐘後，以空白對照體系作為空白對照溶液，在20(T400nm範圍內，分別掃描6個樣品測試體系的紫外光譜。所得測試結果如圖5所示。從圖5可以發現，不同的乙酸鈉溶液用量，對鄰菲羅啉-硫酸鋅紫外光譜體系的測試結果，只會產生比較輕微的改變。這表明，乙酸鈉溶液用量對鄰菲羅啉-硫酸鋅紫外光譜測試體系的影響很小。不過，為了增強鄰菲羅啉-硫酸鋅紫外光譜體系，對測試樣品溶液酸度和鹽含量的抗幹擾性，在試驗方案中，保持乙酸鈉溶液的添加量為3.0mL。實驗四、鄰菲羅啉溶液用量對鄰菲羅啉-硫酸鋅紫外光譜測試體系的影響取7支15mL離心管，其中6支為樣品測試體系，I支為空白對照體系(不加那曲肝素鈣樣品)。首先，往所有離心管中，分別加入1.0mL2.0mM硫酸鋅溶液和3.0mL乙酸鈉溶液，充分混合。接著，往6支樣品測試體系中，全部加入2.00mL10%那曲肝素鈣樣品溶液，搖勻。然後，往1-6號樣品測試體系中，分別加入0、0.5,0.8、1.0、1.2、1.5mL的8.0mM鄰菲羅啉溶液，以及4.0,3.5,3.2,3.0,2.8,2.5mL的注射用水；往空白對照體系中，加入1.0mL8.0mM鄰菲羅啉溶液和5.0mL注射用水，充分混合。靜置15分鐘後，以空白對照體系作為空白對照溶液，在20(T400nm範圍內，分別掃描6個樣品測試體系的紫外光譜。所得結果如圖6所示。從圖6可以發現，不同的鄰菲羅啉溶液用量，對鄰菲羅啉-硫酸鋅紫外測試體系有非常顯著的影響。當鄰菲羅啉溶液的用量小於空白對照體系中的鄰菲羅啉溶液用量時，所得紫外光譜落在吸光度的負區；而當鄰菲羅啉溶液的用量等於或大於空白對照體系中的鄰菲羅啉溶液用量時，所得紫外光譜的吸光度在正區，且成倍數增加。這說明了，那曲肝素鈣測試樣品在302nm處的最大紫外吸收峰，來源於鄰菲羅啉與那曲肝素鈣分子、鋅離子的同時結合，而不只是鋅離子與那曲肝素鈣分子的結合.
實驗五、亞硝酸鈉溶液用量對鄰菲羅啉-硫酸鋅紫外光譜測試體系的影響取7支15mL離心管，其中6支為樣品測試體系，I支為空白對照體系(不加那曲肝素鈣樣品)。首先，往所有離心管中，分別加入1.0mL2.0mM硫酸鋅溶液、1.0mL8.0mM鄰菲羅啉溶液和3.0mLl.0M乙酸鈉溶液，充分混合。接著,往6支樣品測試體系中，全部加入2.00mL10%那曲肝素鈣樣品溶液，搖勻。然後，往1-6號樣品測試體系中，分別加入0.00、
0.05,0.10,0.15,0.20,0.25mL 的 2.0M 亞硝酸鈉溶液，以及 3.00,2.95,2.90,2.85,2.80、
2.75mL的注射用水；往空白對照體系中，加入5.0mL注射用水，充分混合.靜置15分鐘後，以空白對照體系作為空白對照溶液，在20(T400nm範圍內，分別掃描6個樣品測試體系的紫外光譜。所得測試結果如圖7所示.
從圖7可以發現，隨著亞硝酸鈉溶液用量的增加，所得紫外光譜在302nm處的最大吸收峰逐漸消失，同時在354nm處出現一個新的最大吸收峰。這說明了，亞硝酸鈉溶液對鄰菲羅啉-硫酸鋅紫外測試體系的影響很大，可以令其最大吸收峰產生顯著的紅移現象。根據那曲肝素鈣的化學結構特徵，其原因很可能是在測試體系中，外加的大量亞硝酸根離子具有氧化作用，將那曲肝素鈣分子中的羥基轉變為醛基或者羧基，從而增大了顯色基團的共軛效應，進而令其最大紫外吸收峰產生了紅移現象。同時，這也說明了，那曲肝素鈣分子中的羥基參與了整個顯色體系的形成。通過上述實驗一至實驗五，可以證明鄰菲羅啉-硫酸鋅體系可以被用作測定那曲肝素鈣溶液的濃度。下面的兩組實驗將首先建立鄰菲羅啉-硫酸鋅體系紫外光譜測定那曲肝素鈣溶液濃度的標準工作曲線，然後通過實驗來證實該工作曲線的可靠性。實驗六、鄰菲羅啉-硫酸鋅紫外光譜測試體系對那曲肝素鈣的標準工作曲線取7支15mL離心管，其中6支為樣品測試體系，I支為空白對照體系(不加那曲肝素鈣樣品)。首先，往所有離心管中，分別加入1.0mL2.0mM硫酸鋅溶液、1.0mL8.0mM鄰菲羅啉溶液和3.0mLl.0M乙酸鈉溶液，充分混合(在其它實施例中Zn2+離子的濃度範圍，在加入那曲肝素鈣和注射用水後的整個混合體系中，為0.05、.3mM ;在其它實施例中，鄰菲羅啉的物質的量是Zn2+離子的物質的量的2倍以上)。接著，往樣品測試體系中，分別加入2.0mL不同濃度的那曲肝素鈣樣品溶液，濃度依次5.69%,7.86%,9.61%、11.84%、14.14%、16.33%，以及3.0mL注射用水，搖勻；往空白對照體系中，加入5.0mL注射用水，充分混合。靜置15分鐘後，以空白對照體系作為空白對照溶液，在20(T400nm範圍內，分別掃描6個樣品測試體系的紫外光譜。所得測試結果如圖8所示，圖8中從下到上所示曲線的加入的那曲肝素鈣溶液的濃度依次為:5.69%,7.86%,9.61%、11.84%、14.14% 和 16.33%。從圖8可以發現，鄰菲羅啉-硫酸鋅紫外測試體系對那曲肝素鈣樣品，在濃度範圍5.699Γ16.33%之內，呈現良好的線性關係，即那曲肝素鈣的質量相對於Zn2+離子的物質的量在56.9g/mmofl63.3g/mmol的範圍時,可以準確地進行定量檢測，計算得到的標準工作曲線方程為:y=2.6362x+0.0644，R2=0.9987，其中y代表302nm處的吸光度，x代表加入的那曲肝素鈣的濃度。依照該方法進一步的研究結果表明，鄰菲羅啉-硫酸鋅紫外測試體系對那曲肝素鈣樣品濃度總的線性範圍為:1.1849Γ16.33%，即當那曲肝素鈣的質量相對於Zn2+離子的物質的量在11.84g/mmofl63.3g/mmol的範圍時,適用於生產過程中那曲肝素鈣實際樣品的檢測。實驗七、鄰菲羅啉-硫酸鋅紫外光譜測試體系對那曲肝素鈣實際樣品的檢測在實驗六的基礎上，另取3支15mL離心管，作為實際樣品測試體系，即重複測試三次，然後取平均值。首先，往所有離心管中，分別加入1.0mL2.0mM硫酸鋅溶液、1.0mL8.0mM鄰菲羅啉溶液和3.0mLl.0M乙酸鈉溶液，充分混合。接著，往實際樣品測試體系中，分別加入2.0mL在實際生產過程中產生的經過2倍稀釋的那曲肝素鈣溶液(如圖2所示，這裡的實際產品為超濾工藝與醇沉工藝之間的中間產品溶液)，以及3.0mL注射用水，搖勻。靜置15分鐘後，以空白對照體系作為空白對照溶液，在20(T400nm範圍內，掃描其紫外光譜，記錄302nm處的吸光度。將所得吸光度值代入在實驗六中的標準工作曲線方程，計算其濃度，測試結果列於表I。表I鄰菲羅啉-硫酸鋅紫外光譜 測試體系對那曲肝素鈣實際樣品的檢測
權利要求
1.鄰菲羅啉-硫酸鋅紫外光譜法測定那曲肝素鈣的溶液濃度，其特徵在於:在緩衝溶液的環境下，通過測定Zn2+離子、鄰菲羅啉和那曲肝素鈣三者混合溶液的紫外吸光度來定量測定那曲肝素鈣的濃度。
2.根據權利要求1所述的測定方法，其特徵在於:在緩衝溶液的環境下，將Zn2+離子溶液、鄰菲羅啉溶液和那曲肝素鈣溶液混合，混合溶液中所述Zn2+離子的濃度範圍在.0.05、.3mM，所述鄰菲羅啉的物質的量是Zn2+離子的物質的量的2倍以上，測定所述混合溶液的紫外吸光度； 建立標準工作曲線時，加入混合溶液的為已知濃度的那曲肝素鈣溶液，且所述那曲肝素隹丐的質量相對於所述Zn2+離子的物質的量為11.84g/mmofl63.3g/mmol ； 建立標準工作曲線後，加入混合溶液的為未知濃度的那曲肝素鈣溶液，根據測定的吸光度及建立的標準工作曲線計算得出所述那曲肝素鈣溶液的濃度，當加入的那曲肝素鈣的質量相對於所述Zn2+離子的物質的量不在11.84g/mmofl63.3g/mmol的範圍時,在不改變加入體積的情況下通過濃縮或稀釋的方法改變加入混合溶液中那曲肝素鈣溶液的濃度，測定其吸光度並利用標準工作曲線計算得出所述那曲肝素鈣溶液的濃度，使那曲肝素鈣的質量相對於所述Zn2+離子的物質的量在11.84g/mmol 163.3g/mmol的範圍； 所述那曲肝素鈣的濃度是指那曲肝素鈣的質量體積百分比。
3.根據權利要求1或2所述的測定方法，其特徵在於:所述混合溶液的溶劑是水、乙醇、甲醇、異丙醇、正丙醇和正丁醇中的至少一種。
4.根據權利要求1或2所述的測定方法，其特徵在於:所述緩衝溶液包括乙酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉和硫酸氫鈉中的至少一種物質的水溶液。
5.根據權利要求4所述的測定方法，其特徵在於:所述緩衝溶液為乙酸鈉溶液，乙酸鈉在所述混合溶液中的濃度為0.05、.6M。
6.根據權利要求4所述的測定方法，其特徵在於:所述乙酸鈉在所述混合溶液中的濃度為0.3M。
7.根據權利要求1或2所述的測定方法，其特徵在於:所述Zn2+離子來自硫酸鋅，所述Zn2+離子的濃度為0.2mM。
8.根據權利要求1或2所述的測定方法，其特徵在於:所述鄰菲羅啉的物質的量是所述Zn2+離子的物質的量的4倍。
9.根據權利要求1或2所述的測定方法，其特徵在於:測定所述混合溶液的吸光度時紫外波長為302±lnm。
10.根據權利要求5所述的測定方法，其特徵在於:配製混合溶液時，所述硫酸鋅水溶液為1.0mL,2.0mM，所述鄰菲羅啉的乙醇溶液為1.0mL,8.0mM，所述乙酸鈉水溶液為3.0mL,.1.0M，充分混合後，加入2.0mL那曲肝素鈣溶液和3.0mL注射用水，充分混合併靜置後，測定所述混合溶液在302 ± Inm的吸光度。
全文摘要
本發明公開了鄰菲羅啉-硫酸鋅紫外光譜法測定那曲肝素鈣的溶液濃度。在緩衝溶液的環境下，通過測定Zn2+離子、鄰菲羅啉和那曲肝素鈣三者混合溶液的紫外吸光度來定量測定那曲肝素鈣的濃度。該方法應用鄰菲羅啉-硫酸鋅紫外光譜測試體系，實現了對那曲肝素鈣溶液濃度的快速定量檢測，其分析方法的線性範圍為1.184%～16.33%；同時，該方法對鈣離子、鈉離子和硫酸根離子有很好的抗幹擾能力，可以應用於那曲肝素鈣藥物的實際生產過程中，對中間產品溶液或者成品溶液進行濃度檢測。
文檔編號G01N21/33GK103149170SQ201310036199
公開日2013年6月12日 申請日期2013年1月30日 優先權日2013年1月30日
發明者陳賢光, 鄭華淦, 張滌平, 吳園園, 曲和之, 盛光陽 申請人:深圳賽保爾生物藥業有限公司